全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
收稿日期:2010-12-15
基金项目:国家自然科学基金项目(30960030) ，内蒙古自然科学基金项目(2009MS0505) ，内蒙古大学高层次引进人才科研启动基金项目
(Z20080215)
作者简介:朱雯雯，女，硕士研究生，研究方向:植物生理;E-mail:zhuwenwendemail@ 163. com
通讯作者:林晓飞，女，副教授，博士后，研究方向:植物逆境生理与分子生物学;E-mail:linxiaofei04@ hotmail. com
兴安落叶松肌动蛋白基因的分离与序列分析
朱雯雯1 林晓飞1 张文波2 许月英1 高野博嘉3
(1内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021;2内蒙古农业大学林学院，呼和浩特 010019;
3熊本大学自然科学研究科，日本国熊本市 860-8555)
摘 要: 以兴安落叶松(Larix gmelinii)实生苗为材料，提取总 RNA和基因组 DNA;利用兼并 PCR及 RACE技术克隆肌
动蛋白基因(Lg-act)。序列分析的结果显示，该基因 cDNA全长 1 662 bp，编码 377 个氨基酸;基因组 DNA长度约为 2 564 bp，
包含 4 个内含子，5 个外显子。所克隆的 Lg-act cDNA序列与 GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在
77%以上，氨基酸序列的相似性高达 93%以上。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统树显示，兴安落叶松肌动蛋白与挪
威云杉肌动蛋白之间的亲缘关系较为密切，在进化中分化时间最为接近。
关键词: 兴安落叶松 肌动蛋白 基因克隆 序列分析
Isolation and Sequence Analysis of Larix gmelinii Actin Gene
Zhu Wenwen1 Lin Xiaofei1 Zhang Wenbo2 Xu Yueying1 Takano Hiroyoshi3
(1College of Life Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010021;
2College of Forestry，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010019;
3Graduate School of Science and Technology，Kumamoto University，Kumamoto 860-8555，Japan)
Abstract: Total RNA and genomic DNA were extracted from Larix gmelinii seedlings，and full-length sequences of L． gmelinii ac-
tin gene，named as Lg-act，were isolated by using degenerate-PCR and RACE technique． The cloned Lg-act cDNA was 1 662 bp in
length，encoding a protein of 377 amino acids，which shows more than of 77% nucleotide sequence similarity and more than of 93% a-
mino acid sequence similarity to other plant actin genes． Genomic DNA of the Lg-act contains 2 564 bp，including 4 introns and 5 ex-
ons． The phylogenetic tree generated from the deduced amino acid sequences of plant actins revealed that the L． gmelinii and Picea abies
actins is in a sister group to the clade of angiosperms，corresponding to plant evolutionary history．
Key words: Larix gmelinii Actin Gene cloning Sequence analysis
肌动蛋白是在真核生物中普遍存在的一种古老
的蛋白质，是构成细胞骨架和肌肉肌小节的主要成
分，执行着重要的生理功能和多种细胞运动，如细胞
分裂、细胞运动、细胞形态变化、内吞作用、胞饮作用
以及顶端生长、细胞器运动、胞质环流、花粉管生长
等［1，2］。在高等动植物中，肌动蛋白都是由多基因
编码［3］，这些基因高度相似，通过多轮复制由一个
基因祖先进化而来［4］。常规的植物肌动蛋白通常
由 376 － 377 个氨基酸残基组成，具有高度的保守性
和表达稳定性。自 1973 年 Elzinga等［5］首次测定兔
肌肉肌动蛋白的氨基酸序列至今，已经有百余种生
物的 200 多个肌动蛋白核苷酸序列和氨基酸序列存
在于国际数据库中［6］。由于肌动蛋白基因在各种
组织中恒定表达，因而常被作为一种重要的管家基
因以比较不同来源的目的基因表达量的差异。目
前，该基因作为一种广泛参与真核生物生理过程的
管家基因，被广泛用作在基因表达调控研究中的分
子内标［7 － 9］。
兴安落叶松是一个寒温带及温带的树种，其天
然分布较广，垂直分布达到森林分布的最上限，在针
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
叶树种中是最耐寒的，冬季可忍受 － 70℃ 的低
温［10，11］。目前，对兴安落叶松抗寒基因资源的开发
及抗寒分子机理的研究已受到广泛的关注。对于基
因表达调控机理的研究需要一个理想的分子内标，
而兴安落叶松肌动蛋白基因还没有被克隆。
本研究以兴安落叶松实生苗为材料，分离其肌
动蛋白基因的 cDNA和基因组 DNA序列，并对其基
因结构和系统进化关系进行分析。该研究以此基因
为内标，以期为研究兴安落叶松其他基因的表达和
调控奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 植物材料与试剂
本研究的初始材料兴安落叶松(Larix gmelinii)
的种子由内蒙古大兴安岭管理局甘河林业局提供。
用自来水(4℃)浸泡种子 48 h，然后播种于蛭石中，
定期浇水，出苗后 2 周的幼苗用于提取总 RNA和基
因组 DNA。
主要试剂 TaKaRa RNA PCR kit (AMV)Ver 3. 0
(TaKaRa)、克隆载体 pMD18-T (TaKaRa)、AxyPrep
DNA Gel Extraction Kit (AXYGEN)、Taq DNA 聚合
酶(TaKaRa)、SMART RACE cDNA Amplication Kit
(Clontech)和感受态 Escherichia coli DH5α 细胞等
购自 TaKaRa公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 总 RNA 和基因组 DNA 的提取 采用改良
的 CTAB 法［12］从兴安落叶松的实生苗中提取总
RNA，利用紫外分光光度计测定其纯度和浓度，并通
过变性琼脂糖凝胶电泳进行浓度和完整性检测。使
用 Genomic DNA Isolation Kit (Isoplant，Nippon
Gene，日本)提取基因组 DNA，提取过程根据该试剂
盒的说明书进行。
1. 2. 2 Lg-act基因的克隆
1. 2. 2. 1 兼并 PCR 扩增 Lg-act 基因片段 cDNA
第一链的合成按照 TaKaRa RNA PCR kit (AMV)
Ver 3. 0 操作说明进行。以 cDNA第 1 链为模板，用
兼并引物 Act /F:5-ATGGTIAARGCIGGITTYGC-3和
Act /R:5-CCACATYTGYTGRAAIGTIS-3 进行 PCR
反应。该 PCR反应体系为 50 μL，包括 5 μL cDNA
模板、20 μmol /L的上游引物和下游引物各 5 μL、10
× PCR缓冲液 5 μL、2. 0 mmol /L的 dNTPs 5 μL、1 U
的 Taq DNA 聚合酶和去离子水。PCR 反应程序:
94℃预变性 1 min;94℃ 30 s，45℃ 1 min，72℃
1 min，循环 35 次;72℃延伸 2 min。反应产物用 1%
琼脂糖凝胶电泳检测。
将含有目的片段的凝胶用 AxyPrep DNA Gel
Extraction Kit (AXYGEN)进行回收纯化，克隆到
pMD18-T载体上，转化 E. coli DH5α 感受态细胞，选
取阳性克隆做菌落 PCR 鉴定，并扩大培养，提取质
粒 DNA，进行酶切检测。结合菌落 PCR与酶切鉴定
的结果，选择可能带有目的片段的菌落摇菌，测序。
1. 2. 2. 2 5和 3RACE 扩增基因末端 根据兼并
PCR扩增的中间片段的测序结果和 SMART RACE
cDNA Amplication Kit(Clontech)要求设计 5RACE
用基因特异引物 R1:5-TCGCTTCGATTGAGCTTCAT-
CT-3及 R2:5-CCCCATACCAACCATCACACCAGT-3，
3RACE 基因特异引物 F1:5-AATTACTTCACTGGC-
CCCCAGC-3， F2: 5-GGTGGCGCCTCCAGAAAGA-
AAATA-3。扩增反应按 SMART RACE cDNA Ampli-
cation Kit所提供的试剂和说明书要求进行操作。反
应产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，用 AXYGEN凝胶
回收试剂盒对目的条带进行回收，回收产物与
pMD18-T载体连接，转化感受态细胞并测序。
1. 2. 2. 3 cDNA 及基因组 DNA 全长序列的克隆
根据 5和 3RACE-PCR扩增得到的 Lg-act cDNA 末
端序列，在其上下游分别设计正向引物:Full-F:5-
GCTCTTTCTCTATCATCAAGAG-3、反向引物:Full-
R:5-CCCAATCCATATGAATATATATAAG-3。分别
使用 cDNA第一链和基因组 DNA为模板，通过 PCR
反应扩增该基因的 cDNA 和基因组 DNA 的全长序
列。反应体系:1 μL 基因组 DNA(100 ng /μL)或
cDNA、5 μL 10 × LA缓冲液、5 μL MgCl2、2. 5 mmol /L
的 dNTPs 4 μL、20 μmol /L 的上游引物和下游引物
各 0. 5 μL、LA Taq 0. 5 U，加去离子水至 50 μL。反
应程序:94℃预变性 2 min;98℃ 20 s，66℃ 4 min，循
环 15 次;98℃ 20 s，66℃ 4 min，循环 20 次;72℃延
伸 7 min。反应产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，
回收、连接、转化并测序。
1. 2. 3 Lg-act 序列及基因结构分析 在 GenBank
中用 Blast X 进行同源性比较，使用 Genetyx 软件进
行核酸序列的翻译、ORF识别，并通过该基因 cDNA
69
2011 年第 7 期 朱雯雯等:兴安落叶松肌动蛋白基因的分离与序列分析
序列与基因组 DNA序列的比较进行基因结构分析。
系统进化树的构建首先用 Blast 2. 1 Program［13］
与 GenBank 中已报道的序列进行相似性比较，用
BLAST软件在 GenBank 中搜集已发表的植物肌动
蛋白序列，将其输入 Clustal W［14］进行多重比较，并
用邻接法(Neighbor joining，NJ 法)［15］绘制进化树，
用自展法(Bootstraping)对进化树进行评估，最后用
TreeView1. 5 软件［16］观看、输出图形化的进化树。
2 结果
2. 1 Lg-act基因克隆
以兴安落叶松总 RNA 反转录所得到的 cDNA
第一链为模板，用在肌动蛋白基因家族保守区内设
计的简并引物 Act /F和 Act /R扩增得到一个长度为
1 023 bp的片段(图 1-A)。BLAST 比对的结果显
示，该片段的 DNA及其编码的氨基酸序列与其他植
物的肌动蛋白基因高度同源，可初步确定其为兴安
落叶松的肌动蛋白基因片段。根据已经获得的
1 023 bp的 Lg-act 序列设计该基因特异引物 R1、
R2，采用 5 RACE 法扩增该基因的 5-末端，得到
398 bp的 DNA片段(图 1-B) ;另外，根据已经获得
的 Lg-act 基因序列设计该基因特异引物 F1 和 F2，
采用 3RACE的方法扩增该基因的 3-末端，得到为
503 bp的 DNA片段(图 1-C)。测序后经 BLAST 比
对证实所克隆的片段为 Lg-act的 5-末端和 3-末端
序列。根据 5和 3 RACE-PCR 扩增得到的 Lg-act
cDNA末端序列，在其上下游分别设计正向引物
Full-F和反向引物 Full-R，分别使用 cDNA第一链和
基因组 DNA 为模板，通过 PCR 扩增得到 1 662 bp
和 2 564 bp的扩增产物(图 2)。经测序、检索后证
实它们是 Lg-act cDNA 和基因组 DNA 的全长序列。
这两条序列已经被登录在基因库 DDBJ 中，登录号
分别为 AB523401 和 AB602839。
2. 2 序列及基因结构分析
该基因 cDNA全长为 1 662 bp，包含一个 1 134
bp的开放阅读框(ORF) ，编码 377 个氨基酸，5非
编码区 206 bp，3非编码区 322 bp。该基因的基因
组 DNA 全长为 2 564 bp，基因结构分析的结果显
示，该基因包含 4 个内含子，5 个外显子，第 1 个外
显子 183 bp，第 2 个外显子 83 bp，第 3 个外显子 394
bp，第 4 个外显子 614 bp，第 5 个外显子 369 bp;第 1
个内含子 310 bp，第 2 个内含子 315 bp，第 3 个内含
子 173 bp，第 4 个内含子 123 bp(图 3)。图 4 显示
Lg-act核苷酸序列及推测的氨基酸序列，大写和小
写字母分别代表外显子和内含子区域的核苷酸序
列。该基因的 cDNA 序列还包含一个 19 个核苷酸
的 polyA尾。
A．兼并 PCR结果;B． 5RACE-PCR 结果;C． 3RACE-PCR
结果;M．100 bp Marker;1．兼并 PCR产物;2．以 R1为引物
5RACE-PCR 结果;3．以 R2 为引物 5RACE-PCR 结果;
4．以F1 为引物 3 RACE-PCR 结果;5． 以 F2 为引物 3
RACE-PCR结果
图 1 兼并 PCR及 RACE-PCR产物凝胶电泳图
M． 1 kb Marker;1． cDNA;2．基因组 DNA
图 2 获取 Lg-act cDNA与基因组 DNA
全长序列的 PCR产物电泳图
用 Lg-act基因 cDNA 序列在 GenBank 中进行同
源搜索，选取挪威云杉(Picea abies，ACP19075. 1)、鳄
梨(Persea americana，ADA70361)、番木瓜(Carica pa-
paya，ACN54541)、杨树(Populus trichocarpa，XP _
002298710)、甘草(Glycyrrhiza uralensis，ABW71681)、
红三叶(Trifolium pratense，AAQ74875)、小米(Setar-
79
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
ia italica，AAG10041)、大麦(Hordeum vulgare，AAN5-
9956. 1)、烟草(Nicotiana tabacum，BAD27408)、油菜
(Brassica napus，AAD03741. 1)、向日葵(Helianthus
annuus，AAF82805)、棉 花 (Gossypium hirsutum，
AAP73457. 1)12种植物的肌动蛋白氨基酸序列与之
进行比对，发现 Lg-act与挪威云杉肌动蛋白基因核苷
酸序列的相似性最高达到 99%;与杨树相似性为
95%;与禾本科的大麦相似性为 93%;与十字花科的
油菜相似性为 93%。运用 Clustal W将这 12 种植物
的肌动蛋白与 Lg-act 进行氨基酸多重性比较，并用
TreeView软件输出进化树。结果(图 5)显示，Lg-act
与挪威云杉肌动蛋白的相似性最高，在进化中分化时
间最为接近。由此可见，肌动蛋白在氨基酸组成上是
高度保守的，这与它参与构成细胞骨架的重要功能是
紧密相关的，也进一步证实了高等植物的 Actin 基因
是一种高度保守的管家基因。
图 3 Lg-act基因结构示意图
图 4 Lg-act的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
89
2011 年第 7 期 朱雯雯等:兴安落叶松肌动蛋白基因的分离与序列分析
图 5 兴安落叶松与其他植物肌动蛋白基因的氨基酸序列同源性分析
3 讨论
大多数多细胞动物包含少于 10 个肌动蛋白基
因，许多真菌、原生动物仅有一个或很少的肌动蛋白
基因;而矮牵牛的基因组中至少有 100 个肌动蛋白
基因;大豆、烟草、马铃薯、水稻等也有多个肌动蛋白
基因［17］。Hightower等［18］的研究表明，植物与动物
肌动蛋白之间的氨基酸序列差异在 11% － 15%。
植物肌动蛋白基因编码序列是高度保守的，而非编
码序列有较大的差异，可反映其进化上的时间进
程［19］。Tourasse和 Li［20］研究了影响蛋白质进化的
主要因素以后认为蛋白质进化速率主要取决于功能
上的需要或是选择压力，而较少受氨基酸组成的影
响。Xia和 Li［21］对影响蛋白质进化的氨基酸 10 种
性质的研究表明，遗传密码的进化趋向于以最大限
度地降低氨基酸的极性。所以，从分子水平来研究
生物进化看，肌动蛋白无疑是一个较好的工具，它可
以反映出生物进化的先后顺序，使人们能够了解生
物进化的真正进程。本试验中得到的兴安落叶松肌
动蛋白基因组 DNA序列的非编码区，可为研究不同
物种在进化上的时间进程提供依据。
另一方面，actin 基因不仅在核苷酸及氨基酸水
平上具有高度的保守性和同源性，而且该基因在各
种组织中恒定表达，因此常常被用作分子内标，广泛
应用于基因表达调控研究中。
兴安落叶松是我国东北、内蒙古林区以及华北、
西南的高山针叶林的主要森林组成树种，具有很强
的耐寒性，而且作为三大针叶用材树种之一，具有重
要的经济价值。本研究获得的兴安落叶松的肌动蛋
白基因具有高度的保守性，显示该基因可作为重要
的分子内标，为今后开发兴安落叶松的有用基因资
源、研究基因的表达和调控、优质基因筛选等提供
依据。
参 考 文 献
［1］ Sheterline P，Sharrow JC． Protein profile:Actin［M］． Lordon:Aca-
demic Press，1994，1(1) :1-11．
［2］ Staiger CJ，Schliwa M． Actin localization and function in higher
plants． Protoplasma，1987，141(1) :1-12．
［3］ Firtel R． Multigene family encoding actin and tubulin． Cell，1981，
24:6-7．
［4］Mange A，Prudhomme JC． Comparison of Bombyx mori and Helicover-
pa armigera cytoplasmic actin genes provides clues to the evolution
of actin genes in insects． Molecular Biology and Evolution，1999，16
(2) :165-172．
［5］Eizinga M，Collins JH，Kuehl WM，Adelstein RS． Complete amino
acid sequence of actin of rabbit skeletal muscle． Proc Natl Acad Sci
USA，1973，70(9) :2687-2691．
［6］胡松年，阎隆飞．肌动蛋白与真核生物的进化． 动物学报，1999，
45(4) :440．
［7］Thellin O，Zorzi W，Lakaye B，et al． Housekeeping genes as internal
standards:use and limits． Journal of Biotechnology，1999，75(2-3) :
99
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
291-295．
［8］Thomas C，Meyer D，Wolff M，et al． Molecular characterization and
spatial expression of the sunflower ABP1 gene． Plant Molecular Biol-
ogy，2003，52(5) :1025-1036．
［9］Xia LX，Cheng HH，Guo YQ． Characterization of the β-actin gene of
the rice fieldeel and its phylogeny in fish． Acta Genetica Sinica，
2005，32(7) :689-695．
［10］任书杰，于贵瑞，陶波，等．兴安落叶松(Larix gmelinii Rupr．)叶
片养分的空间分布格局．生态学报，2009，4(29) :1899-1906．
［11］周以良． 中国大兴安岭植被［M］． 北京:科学出版社，1991:
3-18．
［12］Chang S，Puryear T，Caimey I． A simple and efficient method for i-
solating RNA from pine trees． Plant Molecular Biology Reporter，
1993，11(2) :113-116．
［13］ Altschul SF，Madden TL，Schaffer AA，et al． Gapped BLAST and
PSI_BLAST:a new generation of protein database search programs．
Nucleic Acids Research，1997，25(17) :3389-3402．
［14］Thompson J，Higgins D，Gibson T． CLUSTAL-W:Improving the sen-
sitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting position specific gap penalties and weight matrix choice．
Nucleic Acid Research，1994，22(22) :4673-4680．
［15］Saitou N，Nei M． The neighbor-joining method:a newmethod for re-
constructing phylogenetic trees． Mol Bio Evol，1987，4(4):406-425．
［16］Page RD． TreeView:an application to display phylogenetic trees on
personal computers． Computer Applications in the Biosciences，
1996，12:357-358．
［17］Mcdowell JM，Huang S，Mckinney EC，et al． Structure and evolution
of the actin gene family in Arabidopsis thaliana． Genetics，1996，142
(2) :587-602．
［18］Hightower RC，Meagher RB． The molecular evolution of actin． Ge-
netics，1986，114(1) :315-332．
［19］贺淹才．肌动蛋白和肌动蛋白基因的研究进展． 生命的化学，
2002，22(3) :248-250．
［20］Tourasse NJ，Li WH． Selective constraints，amino acid composition，
and the rate of protein evolution． Mol Biol Evol，2000，17(4) :656-
664．
［21］Xia XH，Li WH． What amino acid properties affect protein evolu-
tion?． Journal of Molecular Evolution，1998，47(5) :557-564．
(责任编辑 李楠)
001