全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 11期
光裸星虫 ISSRPCR反应体系的单因素优化试验
彭银辉 宋忠魁 蔡小辉 杨家林 刘丽梅
(广西海洋研究所 广西海洋生物技术重点实验室, 北海 536000)
摘 要: 以光裸星虫为试验材料, 通过单因素方法对影响其 ISSRPCR扩增效果的因子 (模板 DNA、M g2+、dNTPs、引物、
Taq DNA聚合酶、甲酰胺和二甲基亚砜 )浓度进行研究。确立适合光裸星虫 ISSRPCR的反应体系: 25L体积含 1 PCR buff
e r、模板 DNA用量为 10- 50 ng、Taq DNA聚合酶为 075- 1 75 U、Mg2+浓度为 1 5- 25 mm ol/L、dNTP浓度为 0 20 mm o l/L,
引物浓度为 0 8- 12 m o l/L,甲酰胺和二甲基亚砜的添加并不能优化光裸星虫 ISSRPCR反应结果。利用所建立的体系对
广西北海群体的 20个光裸星虫个体基因组 DNA进行 ISSRPCR扫描, 结果表明, 优化后的体系均能扩增出清晰、多态性高的
条带。
关键词: 光裸星虫 ISSR 优化 单因素
Optim ization for ISSRPCR Reaction Conditions of
Sipunculus nudus by Single Factor
Peng Y inhui Song Zhongkui Ca iX iaohui Yang Jialin L iu L mi e i
(Guangx i Institute of O ceanology, Guangx iK ey Laboratory of M arine Biotechno logy, Beihai 536000)
Abstrac:t Fac to rsw hich affected the ISSRPCR analysis in the study o f g enetic d iversity of Sipunculus nudus, such as concentra
tion scope o f tem plate DNA, Taq DNA po lyme rase, M g2+ , dNTPs, pr im ers, fo rm am ide and d im ethy l su lfox idewe re studied. The opti
m al ISSRPCR o fS ipuncu lus nudus w ere determ ined. Each 25L amp lifica tion reaction system consisted o f 1 PCR buffer, 1050 ng
tem plate DNA, 075- 1 75 U Taq DNA po lym erase, 1 5- 2 5 mm o l/L Mg2+ , 020 mm o l/L each of dNTP , 08- 1 2m o l/L pr im
e r. The add ition o f form am ide and d im ethy l sulfox ide cou ld no t optim ize the band type. The ISSR fingerpr intw ere de tec ted in 20 S ipuncu
lus nudus indiv iduals by using the optim al ISSRPCR reaction system, which ind icated that it cou ld amplify c lear ly and po lymorphic band.
Key words: S ipunculus nudus ISSRPCR Optim ization S ing le facto r
收稿日期: 20100617
基金项目:广西海洋生物技术重点实验室主任基金课题 ( GKLMBTD0801)
作者简介:彭银辉,男,助理研究员,研究方向:海水养殖遗传育种; Em ai:l pyinhu@i 163. com
通讯作者:宋忠魁,男,副教授,研究方向:海洋生物技术; Em ai:l songsir2003@ yah oo. com. cn
光裸星虫 (S ipuncu lus nudus Linnaeus, 1766) ,亦
称方格星虫, 俗称 沙虫 , 属方格星虫纲 ( S ipuncu
lidea)方格星虫目 ( Sipunculifom es)方格星虫科 ( S ip
uncu lidae)方格星虫 ( S ipuncu lus ) , 为暖水性世界广
布种, 我国沿海均有分布, 尤以广西海区资源较为丰
富 [ 1]。简单重度序列区间 ( inter simple sequence re
pea,t ISSR)标记技术是 Zietkiew iez等 [ 2]于 1994年
创建的一种基于 PCR反应的分子标记技术, 具有模
板用量少、成本低廉、多态性丰富、试验结果稳定等
诸多优点,自问世以来已被迅速应用于品种鉴定、遗
传多样性和 DNA指纹图谱绘制等研究中 [ 3 ]。
ISSR标记技术受各种因子影响较大。因此, 对
物种进行 ISSR标记的前提是对扩增体系的优化, 通
常需要优化的因子包括 Mg2+、Taq DNA 聚合酶、
dNTPs、引物、模板 DNA等。本研究利用单因素试
验方法优化光裸星虫 ISSRPCR反应体系, 为 ISSR
标记在光裸星虫遗传多样性和种质资源等方面的应
用奠定技术基础。
1 材料和方法
11 试验材料
试验用光裸星虫购自广西壮族自治区北海市南
珠市场。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
12 主要试剂
饱和酚、EDTA、T ris、SDS、蛋白酶 K、RNaseA及
引物 850( 5GTGTGTGTGTGTGTGTYC3, Y = C或
T)均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品,
Taq DNA聚合酶、10 buffer、Mg2+及 dNTPs m ix ture
购于上海申能博彩技术服务有限公司, 其它生化试
剂均为国产分析纯。
13 光裸星虫基因组 DNA的提取
参考王庆恒等 [ 4 ]光裸星虫基因组的提取方
法, 稍加修改。使用消毒眼科剪剪取体壁肌肉约
100 mg,剪碎后加入 STE缓冲液 ( 10 mmo l /L T ris
HC,l 100 mmo l /L EDTA, pH 80 ) 600 L, 10% SDS
50 L和蛋白酶 K ( 10 mg /mL) 10 L, 混匀, 55
消化 3 - 4 h至完全, 加入 RN ase A ( 20 mg /mL )
1 L, 37 水浴 30 m in。酚 /氯仿 /异戊醇 ( 25 /24 /
1)等体积抽提两次,氯仿 2倍体积抽提 1次, 抽取
上清液,加入两倍体积无水乙醇, - 20 下沉淀 2
h, 75%乙醇洗涤两次, 室温干燥, 无菌超纯水溶
解。采用核酸蛋白测定仪 ( Eppendor,f Germeny)测
定其浓度, 以 10%琼脂糖凝胶电泳 ( 05 TBE )
检测其质量, - 20 保存备用。使用前以灭菌超
纯水稀释要合适浓度。
14 光裸星虫 ISSRPCR扩增体系优化
141 起始 ISSRPCR扩增体系和反应程序 扩
增体系: 25 L反应体积含 1 PCR bu ffer, Taq DNA
聚合酶 15U,引物 06mmo l/L, dNTPs 02mmo l/L,
M g
2 +
15 mmo l/L,模板 DNA 50 ng。 PCR起始反应
程序: 94 预变性 5 m in; 94 变性 45 s, 525 退火
45 s, 72 延伸 90 s, 35个循环; 72 延伸 10 m in,
4 保存。PCR扩增在 EDC810型 PCR扩增仪 (北
京东胜创新生物科技有限公司 )上进行。扩增产物
以 15%琼脂糖凝胶电泳 ( 05 TBE )检测, 自动凝
胶成像仪 (A lpha inno tech, USA )观察拍照。
142 引物的初步筛选及退火温度确定 以起始
反应体系和反应条件筛选出条带清晰的 850作为光
裸星虫 ISSR试验条件优化首选引物。依据其理论
Tm值 ( 5612 )设计温度梯度确定最佳退火温度
( 46- 62 )。
143 ISSR反应条件优化 在引物 850的最佳退
火温度下, 对 DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物和 Taq
DNA聚合酶等因子的浓度进行单因素优化试验, 并
分析甲酰胺和二甲基亚砜 ( DMSO )对 PCR扩增的
影响。每个试验改变一个 PCR因子的浓度,其他因
子溶度及反应条件不变, 每一个合适条件确定后作
为后续试验的一个条件,最终确定合适的反应体系。
2 结果与分析
21 退火温度
首先根据理论 Tm值进行初筛, 对可扩增出清
晰稳定条带的引物 850进行退火温度梯度试验 (图
1)。从图 1中可看出, 502 、525 条件下条带较
清晰、稳定、数目多, 461 、479 条件下则出现
大片段条带模糊、甚至消失, 这可能是因为退火温度
过低或过高使引物与模板的结合性差、产生非特异
扩增。因此, 采用 525 为光裸星虫 ISSRPCR扩
增 850引物的最适退火温度。
110. 461 、479 、502 、525 、543 、564 、
586 、604 、620 ; M100 bp DNA M arker
图 1 引物 850退火温度梯度
22 DNA模板浓度
模板 DNA质量浓度设置 8个梯度: 1、5、10、20、
30、40、50和 60 ng /L。结果 (图 2)显示,光裸星虫
ISSRPCR对模板浓度要求范围较宽,在 1- 60 ng /L
之间, ISSR条带带型无明显变化; 40- 60 ng /L时,
条带更为清晰稳定; 低于 10 ng /L时, 亮度较弱。
因此,后续筛选体系选用质量浓度为 40- 60 ng /L
的模板 DNA作为 PCR反应用量。
23 Mg2+浓度
本试验设计 8个 Mg2+浓度梯度, 即 01、05、
10、15、20、25、30和 40 mmo l /L。结果 (图 3)
表明, M g2+浓度变化对扩增结果影响较大。Mg2+浓
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2011年第 1期 彭银辉等:光裸星虫 ISSRPCR反应体系的单因素优化试验
度为 01 - 10 mmo l/L时, 无扩增条带; M g2+浓度
25- 40 mmol /L时, 条带出现明显的渐变模糊;
M g
2 +浓度为 15- 25 mmol /L时, 条带较清晰、稳
定。试验确定光裸星虫合适的 Mg2+ 浓度范围为
15- 25mmo l/L。
24 引物浓度
设置 6个不同引物浓度梯度 ( 02、04、06、08、
10和 12 mo l/L )进行 ISSRPCR反应体系优化。
结果 (图 4)显示,浓度为 02- 04 mo l/L时,扩增条
带为较大片段且条 带数量少; 浓度为 06 -
12 mol/L时,扩增条带带型相对稳定;浓度为 08-
12 mo l/L时,条带较清晰。故本试验确定合适引
物浓度为 08- 12 mo l/L。
25 dNTPs浓度
本试验设置 8个 dNTPs浓度梯度 ( 005、010、
015、020、025、030、040和 050 mmo l/L )对反
应体系进行优化。结果 (图 5)表明, dNTPs的浓度
过低 (低于 020 mmo l/L )条带不清晰、出现非特异
扩增条带,浓度高于 020 mmo l/L时,条带数量急剧
减少甚至全部消失,这可能是因为 dNTP浓度过高会
螯和大量Mg2+而造成 Taq DNA聚合酶活性降低最终
导致扩增量减少甚至整个反应失败 [ 5 ]。基于 dNTPs
浓度梯度对扩增结果影响,确定光裸星虫 ISSRPCR
反应体系中 dNTPs合适的浓度是 020mmol /L。
26 Taq DNA聚合酶浓度
本试验使用上海申能博彩技术服务有限公司的
Taq DNA聚合酶。设置 5个 05、075、10、125、
15和 175U Taq DNA聚合酶含量梯度进行优化。
从图 6可以看出, Taq DNA聚合酶的不同梯度对引
物 UBC850带型影响不明显, Taq DNA聚合酶的含
量越高、带型越亮。本着节约成本的原则,本试验中
Taq DNA聚合酶用量为 10U。
27 甲酰胺与二甲基亚砜 ( DM SO)浓度
PCR反应体系中, 加入适当浓度的甲酰胺和
DMSO通常可提高 PCR反应的稳定性和产物特异
性,降低反应背景 [ 6, 7]。本试验设置了甲酰胺和
DMSO 7个梯度浓度,结果如图 7所示。由图 7可看
出,添加甲酰胺和 DMSO并未有效地降低背景; 当
甲酰胺浓度大于 3%时条带逐渐变少; 不同浓度的
DMSO对扩增条带影响较小。
18.模板 DNA质量浓度分别为 1、5、10、20、30、40、50、60
ng /L; M100 bp DNA M arker
图 2 模板 DNA质量浓度对 ISSRPCR扩增结果
18. Mg2+浓度分别为 01、05、10、15、20、25、30、40
mmo l/L; M100 bp DNA M arker
图 3 Mg2+浓度对 ISSRPCR结果的影响
16.引物浓度分别为 02、04、06、08、10、12 mo l/L;
M100 bp DNA Marker
图 4 引物浓度对 ISSRPCR结果的影响
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
18.引物浓度分别为 005、010、015、020、025、030、
040、050 mm ol /L; M. 100 bp DNA M ark er
图 5 dNTPs浓度对 ISSRPCR结果的影响
16. Taq DNA聚合酶浓度分别为 050、075、100、125、
150、175 U; M. 100 bpDNA M arker
图 6 Taq DNA聚合酶量对 ISSRPCR结果的影响
17.甲酰胺浓度分别为 0、1%、2%、3%、4%、5%、6% ;
814. DMSO浓度分别为 0、1%、2%、3%、4%、5%、6% ; M.
100 bp DNA M arker
图 7 甲酰胺和二甲基亚砜浓度对 ISSRPCR结果的影响
28 光裸星虫 ISSRPCR反应体系
图 8是用引物 UBC850在优化后的体系下对广
西北海 20个光裸星虫基因组 DNA的 PCR扩增结
果。 25 L反应体积含 1 PCR bu ffer, Taq DNA聚
合酶 10 U, 引物 12 mmo l/L, dNTPs 02 mmol /L,
M g
2+
25mmol /L,模板 DNA 50 ng。结果显示,均能
得到清晰可辨的条带,说明本试验优化体系适合光
裸星虫 ISSRPCR扩增。
120. 20个个体光裸星虫; M. 100 bp DNA M arker
图 8 优化 ISSRPCR体系对光裸星虫 20个
模板 DNA的扩增结果 (引物 UBC850)
3 讨论
影响 ISSRPCR扩增结果的因子很多, 例如,
DNA模板、Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、甲
酰胺和 DMSO等。本试验采用单因素方法优化光
裸星虫 ISSR反应条件发现, DNA模板浓度 ( 10 -
50 ng)、引物 ( 08- 12 mo l/L )和 Taq DNA聚合
酶 ( 075- 175U )适用范围较宽, 这与孙始威等 [ 8]
对扁玉螺 ISSRPCR反应体系单因素优化结果一
致。Mg2+和 dNTPs浓度微小变化对扩增效果影响
较大,原因可能是 Mg2+作为 Taq DNA聚合酶的辅助
因子,其浓度影响 Taq DNA聚合酶活性 [ 9] , dNTP浓
度过高,则会螯和大量 Mg2+而造成 Taq DNA聚合酶
活性降低最终导致扩增量减少甚至整个反应失败 [ 5 ]。
吕林兰等 [ 6]发现 Mg2+对马氏珠母贝 ISSR扩增结果
有较大影响: M g2 +浓度过低 (小于 15mmo l/L )则扩
增条带较少, M g2+浓度过高 (大于 15 mmo l/L ), 非
特异扩增产物增多,使得扩增谱带模糊难辩,与本研
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2011年第 1期 彭银辉等:光裸星虫 ISSRPCR反应体系的单因素优化试验
究结果一致。
甲酰胺通过降低熔解温度, 有助于引物退火并
辅助 DNA聚合酶延伸通过二级结构区,从而有效防
止 ISSR引物由于包含简单重复序列而易形成的二
级结构。DMSO改善 G + C含量高的 DNA的变性情
况,使聚合酶更容易在二级结构处延伸。因此,很多
专家在反应体系中加入适量甲酰胺和 DMSO以降
低扩增产物的背景干扰 [ 6, 7]。本研究发现, 在光裸
星虫 ISSRPCR反应体系中, 添加甲酰胺和 DMSO
并未有效地降低背景, 故在光裸星虫 ISSRPCR反
应体系中,将不添加甲酰胺和 DMSO。
优化后光裸星虫 ISSRPCR较适宜的反应体系
为 25 L体积含 1 PCR buffer, 模板 DNA用量为
10- 50 ng, Taq DNA聚合酶为 075- 175U, M g2+浓
度为 15- 25mmo l/L, dNTP浓度为 020 mmo l/L,
引物浓度为 08 - 12 mo l/L。采用此优化体系,
以引物 850对广西北海群体的 20个光裸星虫个体
基因组 DNA进行 ISSRPCR扫描,均能扩增出清晰、
多态性高的 ISSR条带,并具有较好的重复性。
参 考 文 献
[ 1] 李凤鲁,孔庆兰,史贵田, 等.中国沿海方格星虫属 (星虫动物
门 )的研究.青岛海洋大学学报, 1990, 20( 1 ) : 9399.
[ 2] Z ietk iew icz E, Rafalsk iA, Labud a D. Gen om e f ingerp rint ing by sim
p le sequence repeats( SSR) anchored polym erase ch ain reaction am
p iif icat ion. Genom ics, 1994, 20 ( 2) : 176183.
[ 3] 张玉星,马艳芝,赵国芳.简单重复序列间扩增分子标记技术及
其应用.生物技术通报, 2009 ( 9) : 5456.
[ 4] 王庆恒,杜晓冬,李康.光裸星虫遗传多样性的 RAPD分析.海洋
水产研究, 2006, 27( 3) : 5761.
[ 5] 文晓鹏,邓秀新.刺梨及其近缘种 PCR实验体系的建立与优化.
果树学报, 2003, 20 ( 1) : 3539.
[ 6] 吕林兰,杜晓东,王嫣,等.马氏珠母贝 ISSRPCR反应条件优化.
安徽农业科学, 2006, 34 ( 22) : 58065807, 5855.
[ 7] L i A, Ge S. G enetic variation and clonal d ivers ity of P samm och loa
vi llosa ( Poaceae) detected by ISSR m ark ers. Annals of Botany, 2001
( 87) : 585590.
[ 8] 孙始威,孙振兴,陈燕妮,等. 扁玉螺 ISSRPCR反应体系的建立
及其优化.湖北农业科学, 2008, 47 ( 5) : 575577.
[ 9] 杨浩,陈宏喜,陈欣.黄鳝 ISSRPCR反应体系的建立及条件优
化.生物技术通报, 2009, ( 7 ): 113116.
(责任编辑 李楠 )
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