全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
乙型肝炎病毒 HBx蛋白抑制 TTRAP
启动子活性的体外研究
张小花 张磊 田园园 王丽英 黄爱龙 汤华
(重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆 400016 )
摘 要: 旨在探讨体外培养条件下 HBx蛋白对 TTRAP( TRAF and TNF receptorassoc iated prote in)基因转录水平表达的
影响。用 RTPCR及 Rea ltim e PCR检测 TTRAP在 H epG2细胞和 H epG2. 2. 15细胞中的表达;构建 TTRAP启动子虫荧光素酶
报告质粒; 分别与 HBV、HBs、HBp、HB c、HBx表达质粒共转染 H epG2细胞, 比较虫荧光素酶活性。 RTPCR和 Rea ltim e PCR
结果显示, TTRAP在 H epG2. 2. 15细胞中的表达量分别是其在 H epG2细胞中表达量的 44. 9%和 27. 8% (P < 0. 05)。TTRAP
启动子虫荧光素酶报告质粒与 HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性, 与对照组相比下降了 43. 8%。转染 HBx表达质
粒组的相对荧光素酶活性与其对照组相比下降了 35% , 而转染 HB c、HBs及 HBp表达质粒组对相对荧光素酶活性没有影响。
因此证实 HBx蛋白能抑制 TTRAP启动子活性。
关键词: HBx蛋白 抑制 TTRAP 启动子活性 H epG2. 2. 15细胞 H epG2细胞
Repression of TRAP Promoter byHBx Activity in vitro
Zhang X iaohua Zhang L ei T ian Yuanyuan W ang L iy ing Huang A ilong TangH ua
(K ey Laboratory of M olecular InfectiousD iseases, M inistry of Education,
Chongqing M edical University, Chongqing 400016)
Abstrac:t It was to study the e ffect o f HBx on TTRAP transcr iptiona l leve l expression in vitro, and explore the relationship be
tween HBx and transcr iptional leve l express ion o f TTRAP. RTPCR and Realtim e PCR w ere performed to check TTRAP expression in
H epG2 and H epG2. 2. 15 ce ll lines. TTRAP prom oter luc iferase repo rter p lasm id, pGL3BasicTTRAPP, w as constructed. H epG2 ce lls
w ere trans iently cotransfec ted w ith the sam e amoun t of pGL3BasicTTRAPP and HBV orHBx, HB s, HB c, H Bp expression p lasm ids,
respectively. Then the lucife rase activ ity was detec ted. RTPCR and Rea ltim e PCR results show ed tha t the am ounts o f TTRAP expres
sion in H epG2. 2. 15 ce lls a re 44. 9% and 27. 8% , low er than tha t in H epG2 ce lls, respective ly. The re lative luciferase activ ity in
H epG2 ce lls, wh ich w ere transiently cotransfec ted w ith pGL3BasicTTRAPP and HBV express ion plasm id, reduced 43. 8% low er than
tha t in contro l group. The re la tive lucife rase ac tiv ity in H epG2 ce lls transfected w ith H Bx express ion p lasm id reduced 35% com parison
to the contro l group. H ow ever, H Bs, HBc and HBp expression plasm ids had no e ffect on luc iferase activ ity. W e found tha t HBx can
repress TTRAP prom o ter activ ity in vitro.
Key words: HBx Repress TRAF and TNF receptorassoc iated pro tein P romo ter activ ity H epG2 215 ce lls H epG2 ce lls
收稿日期: 20091015
基金项目:国家自然科学基金 ( 30771924 )
作者简介:张小花,硕士研究生,研究方向:乙肝病毒致病的分子生物学机制; Em ai:l fm zhangxiaohua@ 163. com
通讯作者:汤华, Em ai:l tanghua86162003@ yahoo. com. cn
乙型肝炎病毒 (HBV )感染是一个世界性的健
康问题, HBV感染可导致急、慢性肝炎及肝细胞癌
的发生 [ 1]。HBV慢性感染是肝癌 ( HCC )发生的主
要原因,而在 HBV感染所致的肝癌中, HBV X基因
的编码蛋白 HBx在 HCC的发生过程中起着重要作
用 [ 2]。HBx是一种反式激活蛋白, 与宿主细胞的多
种蛋白质相互作用, 调节基因的转录、表达, 进而影
响病毒自身的复制、细胞增殖与分化、细胞凋亡及癌
变等 [ 3, 4]。Ye等 [ 5]用基因芯片的方法检测到一些
基因在稳定转染了 HBx基因的肝癌细胞与未转染
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
HBx基因的肝癌细胞中表达存在差异, 其中一个有
显著差异的基因为 TTRAP。
TTRAP能与肿瘤坏死因子受体 ( TNFR)超家族成
员相互作用,并且抑制 NFkB的激活 [ 6]。TTRAP能与
APE1相互作用, 可能参与 DNA修复及转录因子的
激活等多种生物学过程 [ 7]。它能与 ETS1相互作用
并且调节其转录活性, 因而也被命名为 EAPII
( ETS1assoc ia ted protein II) [ 8] , 表明 TTRAP可以进
入核内发挥转录调控功能。 TTRAP抑制上皮癌细
胞的迁移, 但是不影响细胞活力, 不影响细胞增
殖。由此可见 TTRAP可能是晚期肿瘤事件 (如转
移 )的重要调节基因 [ 8]。TTRAP与病毒蛋白之间
的关系已经有研究,通过酵母双杂交筛选试验, 汉
坦病毒核壳体蛋白与 TTRAP的相互关系已经被鉴
定 [ 9]。但是 TTRAP与 HBV蛋白之间的关系至今
尚不清楚。本研究 HBV蛋白对 TTRAP转录水平
表达的影响, 探讨 HBV在 TTRAP基因转录中的
作用。
1 材料和方法
1. 1 材料
人肝癌细胞系 H epG2及 HepG2. 2. 15由本实验
室保存,大肠杆菌 DH5由本实验室保存。HBV表
达质粒 pCH9 /3091由德国海德堡大学M ichaelNas
sal等构建,第三军医大学西南医院兰林博士转赠。
质粒 pCH9 /3091含 1. 1 HBV基因组 ( ayw亚型 ) ,
在 CMV启动子作用下能合成 HBVpgRNA [ 10]。质粒
pGL3Basic、pRLTK及双荧光素酶检测系统购自
Promega公司。 pCMV SPORT6PTB购于 ATCC ( A
merican type cu lture co llection)公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养 人肝癌细胞系 H epG2及
HepG2. 2. 15培养于含 10%胎牛血清, 1%青 /链霉
素的 MEM 培养基中, 培养条件: 含 5% CO2, 37!
孵箱。
1. 2. 2 RTPCR Trizol提取 H epG2及 H epG2. 2.
15细胞总 RNA,变性电泳鉴定 RNA完整性并测定
其浓度和纯度。以 2 g RNA, O ligo ( dT )及 M MLV
Reverse Transcriptase进行逆转录, 合成 cDNA,然后
进行 PCR扩增。引物序列为 TTRAPF: 5∀aacaatct
gtcagagaggg3∀, TTRAPR: 5∀atctgg taacctctcgatcc3∀,
反应产物为 439 bp; actinF: 5∀g tggatcagcaagcag
gag t3∀和 actinR: 5∀tgtg tggacttgggagagga3∀, 反应
产物为 416 bp。 PCR反应条件: 94! 预变性 5m in,
94! 变性 1 m in, 58! 退火 1 m in, 72! 延伸 45 s, 30
个循环; 72! 后延伸 8m in。PCR产物通过 1%琼脂
糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后, 用凝胶成像仪记录
图像。
1. 2. 3 Realt ime PCR Realt ime PCR采用 IQ5
mu lt icolor Realtime PCR detection system ( B ioRad)
测定, 用 Pow er SYBR Green PCR M asterM ix在 25
L反应体系中进行, 采用 AB I Primer Express软件
设计的引物: TTRAPF: 5∀AGAAACCTTTTATGTGT
GCATGTGA 3∀, TTRAPR: 5∀TGGGATGTCATAAG
GCAAAGC3∀; actinF: 5∀CCTGGCACCCAGCA
CAAT∀3∀, actinR: 5∀GCCGATCCACACGGAGTA
3∀。Realtime PCR反应条件: 50! 2 m in, 95! 5
m in; 95! 20 s, 55! 20 s, 40个循环。通过计算阈
值 ( C t值 )来评估 mRNA水平, C t值用 actin来标
化, 目的基因 ( GT)的 mRNA相对量 = 2!!Ct, 所有试
验都是同时做 3份,并进行 3次独立试验。
!!C t= [ C tGT( sam ple) - C t - actin( samp le) ] - [ T( con tro l) -
C t - actin ( con tro l) ]
1. 2. 4 TTRAP启动子的荧光素酶表达质粒的构建
及鉴定 从 Promoter 2. 0 Prediction Server( http: / /
www. cbs. dtu. dk /serv ices/Promoter/ )中获得 TTRAP
启动子的 DNA序列,提取 H epG2. 2. 15细胞基因组
DNA作为模板, PCR扩增 TTRAP启动子片段。引
物序列: 5∀aagg taccTTGGAACTGTCTCCACGAGTC3∀
和 5∀aactcgagAAGTAGGAGTTCAGAGCCC3∀(划线
部分分别表示 Kpn I和 Xho I酶切位点 ) ,反应产物
为 1 000 bp。 PCR反应条件: 94! 预变性 5 m in,
94! 变性 1 m in, 58! 退火 1m in, 72! 延伸 1m in, 30
个循环, 72! 后延伸 10m in。PCR产物和 pGL3Bas
ic载体同时用 Kpn I和 Xho I双酶切,胶回收约 1 kb
的 TTRAP启动子片段和约 4. 8 kb的 pGL3Basic载
体片段, T4连接酶 16! 过夜连接, 产物转化 DH 5
感受态菌。挑选阳性克隆, 扩增后小量提取质粒进
行酶切鉴定并测序。构建成功的重组质粒命名为
pGL3BasicTTRAPP。
1. 2. 5 HBV 4个开放读码框的重组质粒的构建及
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2010年第 2期 张小花等:乙型肝炎病毒 HBx蛋白抑制 TTRAP启动子活性的体外研究
鉴定 以含 1. 1 HBV基因组的质粒 pCH9 /3091
为模板,用 PCR的方法分别扩增 HBV 4个开放读码
框的基因片段, 引物序列及产物长度见表 1。 PCR
反应条件: 94! 预变性 5 m in, 94! 变性 1 m in, 58!
退火 1m in, 72! 延伸 1 m in, 30个循环, 72! 后延伸
8 m in。PCR产物经 N ot I和 Sal I双酶切处理后分
别与同样双酶切处理的载体 pCMV SPORT6连接,
转化感受态 DH 5大肠杆菌。经 Amp抗性筛选,
挑选阳性克隆, 扩增后小量提取质粒进行酶切鉴
定及测序。测序结果证明序列正确, 将构建成功的
重组质粒分别命名为 pCMVSPORT6HBx、pCMV
SPORT6HBs、pCMV SPORT6HBc以及 pCMVSPO
RT6HBp。
表 1 PCR扩增引物序列及产物大小
引物 引物序列 ( 5∀- 3∀) 产物大小 ( bp)
HBs forw ard: AAGTCGACATGGAGAACATCACATCAGG 681
reverse: AAGCGGCCGCAATGTATACCCAGAGACAAAA
HBc forw ard: AAGTCGACATGCAACTTTTTCACCTCTG 552
reverse: AAGCGGCCGCCTAACATTGAGATTCCCGAG
HBx forw ard: AAGTCGACATGGCTGCTAGGCTGTACTG 465
reverse: AAGCGGCCGCGGCAGAGGTGAAAAAGTTGCA HBp
forw ard: AAGTCGACATGCCCCTATCTTATCAACCAC 2532
reverse: AAGCGGCCGCCGGTGGTCTCCATGCAACGTG
注: 划线部分别为 Sal I和 Not I酶切位点, Sal I酶切位点:
GTCGAC,N ot I酶切位点: GCGGCCGC
1. 2. 6 细胞转染及双荧光素酶报告系统检测
HepG2细胞按每孔 2 105铺入 24孔板, 18 - 24 h
后用 Lipofectam ine 2000TM进行转染, 具体操作按试
剂盒说明书进行。 pRLTK质粒用量为 0. 1 g, 质
粒 pGL3BasicTTRAPP、 pCMVSPORT6、 pCH9/
3091、pCMVSPORT6HBx、pCMVSPORT6HBs、pC
MVSPORT6HBc及 pCMVSPORT6HBp分别用 0.
4 g。所有转染都在 24孔板中进行,每组同时转染
三孔, 并进行 3次独立试验。转染后 48 h收集细
胞,提取蛋白,进行双荧光素酶报告系统检测。按照
Promega试剂盒 DualLuciferase Reporter Assay Sys
tem技术手册操作。所用仪器为 Turner TD20 /20 lu
m inom eter, pRLTK质粒作为内参用来标化转染效
率, 每组的相对荧光素酶活性用虫荧光素酶活性与
海肾荧光素酶活性的比值 ( FL /RL)来表示。
1. 2. 7 统计学分析 所有试验都是同时做 3份, 并
进行 3次独立试验。采用 t检验 ( Exce,l M icrosoft)
进行显著性分析, P < 0. 05则认为差异有统计学意
义。数据以均数 #标准差的形式表示。
2 结果
2. 1 TTRAP在 H epG2和 HepG2. 2. 15细胞中转录
水平的表达
为了确定 TTRAP在 H epG2和 HepG2. 2. 15细
胞中转录水平的表达是否存在差异, 用 RTPCR和
Realtime PCR检测了 TTRAP在这两种细胞中的表
达。RTPCR结果显示, TTRAP在 H epG2. 2. 15细
胞中的表达量是其在 H epG2细胞中表达量的 44.
9% (图 1A ), Realt ime PCR结果显示, TTRAP在
H epG2. 2. 15细胞中的表达量是其在 HepG2细胞中
表达量的 27. 8% (P < 0. 05) (图 1B )。
A. RTPCR检测结果, actin作为对照; B. R ealt im e
检测结果,将 TTRAP在 H epG2细胞中的相对值标化为
1, H epG2. 2. 15中的相对值 = H epG2. 2. 15细胞中表达
量 /H epG2细胞中表达量,﹡ P < 0. 05
图 1 TTRAP在 H epG2和 HepG2. 2. 15
细胞中转录水平的表达
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
这些结果表明, 在 mRNA 水平上, TTRAP在
HepG2和 HepG2. 2. 15细胞中表达存在差异。因为
HepG2. 2. 15细胞系是在 H epG2细胞中整合了 HBV
全长基因组,能表达 HBV各种蛋白的稳定细胞系,
所以 TTRAP在这两种细胞中的转录水平表达差异
可能是因为 HBV影响了 TTRAP启动子活性或某些
转录因子活性。
2. 2 TTRAP启动子的虫荧光素酶表达质粒的构建
及鉴定
为了进一步探讨 TTRAP转录水平差异表达的
原因,构建了 TTRAP启动子的虫荧光素酶表达质粒
pGL3BasicTTRAPP,经 Kpn I和 Xho I双酶切, 可
获得大小约 1 kb和 4. 8 kb的两个片段, 与预期一
致 (图 2)。测序结果证实序列正确。表明 TTRAP
启动子已成功克隆入 pGL3Basic质粒中。
1. ∀E coT14 I digestDNA Marker; 2. pGL3BasicTTRAPP质
粒; 3. pGL3Basic质粒; 4. TTRAP p rom oter PCR 片段;
5. DL2000 DNA M arker
图 2 pGL3BasicTTRAPP质粒的 Kpn I
和 Xho I双酶切鉴定
2. 3 HBV下调 TTRAP启动子活性
将 pGL3BasicTTRAPP、pCH9 /3091和 pRL
TK共转染 H epG2细胞, 同时以 pGL3BasicTTRAP
P、pCMVSPORT6和 pRLTK共转染为对照组。结
果如图 3所示, pGL3BasicTTRAPP、pCH9 /3091
和 pRLTK共转染 H epG2细胞组的相对荧光素酶活
性与对照组相比下降了的 43. 8% (P < 0. 01)。结果
表明 HBV能下调 TTRAP启动子活性。
pRLTK质粒作为内参用来标化转染效率,相对荧光素酶活
性用虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值 ( FL /
RL)来、表示;﹡ P < 0. 05表示第 3组与第 5组相比,﹡﹡ P
< 0. 01表示第 4组与第 5组相比; 15分别表示 5组不同
试验处理; +、-分别表示试验组中是否含有该质粒
图 3 转染后 48 h双荧光素酶的活性检测结果
2. 4 HBx抑制 TTRAP启动子活性
HBV基因组包含了 C、P、S和 X 4个基因开放
读码框,编码 4种蛋白。为了进一步分析各种蛋白
对 TTRAP启动子活性的影响,我们构建了这 4种蛋
白的表达质粒。将 pGL3BasicTTRAPP分别与
HBs、HBx、HBp、HBc表达质粒及 pRLTK共转染
H epG2细胞,同时以 pGL3BasicTTRAPP、载体 pC
MVSPORT6及 pRLTK共转染为对照组。结果显
示, 转染 HBx表达质粒组的相对荧光素酶活性与对
照组相比下降了 35%, 统计学分析差异有显著性 (P
< 0. 05),而转染 HBc、HBs、HBp表达质粒组的相对
荧光素酶活性与对照组相比无显著性差异 (图 4)。
双荧光素酶活性检测结果表明 HBx蛋白能抑制
TTRAP启动子活性。
pRLTK质粒作为内参用来标化转染效率,相对荧光素酶活
性用虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值 ( FL /
RL)来表示;﹡ P < 0. 05表示 HBx组与对照组相比
图 4 转染后 48 h双荧光素酶的活性检测结果
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2010年第 2期 张小花等:乙型肝炎病毒 HBx蛋白抑制 TTRAP启动子活性的体外研究
3 总结与讨论
Y e等 [ 5]报道,他们用基因芯片的方法检测到一
些基因在稳定转染了 HBx基因的肝癌细胞与未转
染 HBx基因的肝癌细胞中表达存在差异, TTRAP就
是其中有变化的基因之一。TTRAP与 HBV蛋白之
间的关系至今尚不清楚。为此,想探讨 HBV蛋白对
TTRAP转录水平表达的影响, 揭示 HBV 蛋白与
TTRAP转录水平表达的关系。为了研究这个问题,
我们应用了两个细胞系 HepG2和 HepG2. 2. 15。
HepG2是人肝癌细胞系, 而 H epG2. 2. 15是 H epG2
衍生的细胞系,它是将含有 HBV基因组 ( 4个 HBV
头对尾串联的四聚体 )的重组载体质粒转染 H epG2
细胞, 经 G418筛选,得到的克隆。HepG2. 2. 15不仅
分泌高水平的 HBsAg和 HBeAg入培养上清, 而且
细胞中含有 HBV DNA复制中间体和 Dane颗粒。
也就是说, H epG2. 2. 15细胞株能稳定地支持 HBV
的复制, 所以被认为是一个体外研究 HBV 的好
模型 [ 11]。
本研究采用 RTPCR和 Realtime PCR证明目
的基因 TTRAP在 HepG2和 HepG2. 2. 15细胞中
mRNA水平表达存在差异。 RTPCR 结果显示
TTRAP在 H epG2. 2. 15细胞中的表达量是其在
HepG2细胞中表达量的 44. 9% (图 1A ), Realt ime
PCR结果显示 TTRAP在 H epG2. 2. 15细胞中的表
达量是其在 H epG2细胞中表达量的 27. 8% (图 1
B )。Ye等 [ 5 ]用基因芯片方法观察到 TTRAP在稳
定转染了 HBx基因的肝癌细胞中转录水平表达比
在未转染 HBx基因的肝癌细胞中低, 本试验结果与
其一致。鉴于其在 H epG2和 HepG2. 2. 15细胞中的
转录水平表达差异,推测 TTRAP转录水平这种差异
可能是因为 HBV影响了 TTRAP启动子的活性。
为了进一步分析 TTRAP转录水平表达的差异
是否是由于 HBV影响了 TTRAP启动子活性,构建
了 TTRAP启动子的虫荧光素酶表达质粒, 将其与
HBV表达质粒 pCH9 /3091共转染 H epG2细胞,通
过双荧光素酶活性检测来评价 HBV对 TTRAP启动
子活性的影响。结果显示,转染 HBV表达质粒组的
相对荧光素酶活性与对照组相比下降了的 43. 8% ,
说明 HBV能下调 TTRAP启动子活性 (图 3), 这与
之前的 TTRAP在 mRNA水平上, 在能稳定表达
HBV基因组的 HepG2. 2. 15细胞中的表达比在
H epG2细胞中低的结论一致。
HBV基因组由一个约 3. 2 kb的环形 DNA组
成, 包含 C、P、S和 X共 4个基因开放读码框, 编码
相应的四种蛋白。本研究构建了这 4个基因的表达
质粒,分别与 TTRAP启动子的虫荧光素酶表达质粒
共转染 H epG2细胞, 观察它们的表达对 TTRAP启
动子活性的影响。结果表明 (图 4) ,转染 HBx表达
质粒组的相对荧光素酶活性与其对照组相比下降了
35% ,而转染 HBc、HBs及 HBp表达质粒对相对荧
光素酶活性没有影响。而转染 HBV表达质粒组的
相对荧光素酶活性与对照组相比下降了的 43. 8%。
这就暗示 HBx下调 TTRAP基因转录水平表达不完
全是通过下调 TTRAP启动子活性, 还可能影响了
TTRAP的某些转录因子或信号途径。为此, 需要进
一步研究来证明这一推论。
总之,本研究发现在体外培养条件下, HBx蛋
白抑制 TTRAP启动子活性从而抑制 TTRAP转录水
平的表达。此研究表明 HBx蛋白参与 TTRAP转录
水平表达的调节, 然而其具体分子机制有待于进一
步研究。
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