全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
实时荧光定量 PCR在固氮酶基因检测中的应用
孙傲雪1 徐凤花1 刘洋3 郭慧娟2 曹艳花1 张晓霞2
(1东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030;2中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081;
3首都师范大学生命科学学院，北京 100048)
摘 要: 实时荧光定量 PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术，它是核酸探针技术、荧光共振能
量传递技术和 PCR技术的有机结合。与常规 PCR 相比，它具有特异性更强、能有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等特
点，扩大了 PCR的应用范围。概述实时荧光定量 PCR技术在固氮酶(nifH)基因检测中的应用与研究进展，并探讨该技术的发
展和应用前景。
关键词: 实时荧光定量 PCR 固氮酶(nifH)基因 检测技术
Application of Real-time Fluorescent Quantitative PCR for
Detection of Nitrogenase(nifH)Gene
Sun Aoxue1 Xu Fenghua1 Liu Yang3 Guo Huijuan2 Cao Yanhua1 Zhang Xiaoxia2
(1College of Resources and Environment，Northeast Agricultural University，Harbin 150030;2 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081;3College of Life Sciences，Capital Normal University，Beijing 100048)
Abstract: In recent years，real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR)is a new kind of real-time quanti-
tative test specific DNA technology． It is made up of three parts:oligonucleotide probe，fluorescence resonance energy transfer (FRET) ，
and the PCR． It can be used to analysis the quantity of information of nucleic acid，and avoiding the pollution in traditional PCR． On the
other hand，it has such excellences as high sensibility，specificity and accuracy． Future trends of FQ-PCR techniques in detection of ni-
trogenase(nifH)gene were discussed in this paper． The application and prospects of FQ-PCR in this field were reviewed．
Key words: Real-time fluorescent quantitative PCR Nitrogenase(nifH)gene Measurement technique
收稿日期:2010-11-08
基金项目:国家自然科学基金项目(30900001)
作者简介:孙傲雪，硕士研究生，研究方向:微生物学与细菌多样性;E-mail:sunaoxue211314@ 163． com
通讯作者:徐凤花，教授，硕士生导师，E-mail:xfh00001@ 126． com;张晓霞，博士，副研究员，E-mail:xxzhang@ caas． ac． cn
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，
PCR)技术，自 1985 年由美国 Cetus公司 Mullis等建
立以来，随着 PCR 技术的日趋完善，已经被广泛应
用于生命科学研究、食品卫生、医疗及环境监测等诸
多方面。1996 年，美国 Applied Biosystems公司推出
了一种在 PCR 定性技术基础上发展起来的新的核
酸定量技术，即实时荧光定量 PCR 技术(real-time
fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)。该技术不仅
实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规 PCR
相比，具有特异性更强、有效解决 PCR污染问题、自
动化程度高及全封闭反应等优点，成为分子生物学
研究中的重要工具，并已得到广泛应用［1］。随着分
子生物学及其技术的不断发展，实时荧光定量 PCR
技术已逐步应用于固氮微生物中固氮酶(nifH)基因
的检测，既定性又定量，使全面快速准确地检测和分
析鉴定 nifH基因成为可能。
1 固氮酶基因的研究
固氮酶是生物固氮功能的关键酶，它由两种酶组
成:组分 I和组分Ⅱ。组分 I 是由两种亚基(分别由
nifD和 nifK基因编码)组成的异聚体蛋白，并且含有
Fe、Mo元素，故又称作 Fe-Mo 蛋白;组分Ⅱ是由一种
亚基(由 nifH基因编码)组成的同聚体蛋白，并且含有
Fe元素，故又称作 Fe蛋白［2 －4］。nifH基因是一种古老
的基因，高度保守，同时又存在相当可变的 DNA序列
2011 年第 3 期 孙傲雪等:实时荧光定量 PCR在固氮酶基因检测中的应用
区，可以作为固氮微生物的分子标记［5］。以 nifH基因
作为分子标记有两个优点:一是 nifH编码的蛋白质序
列高度保守;二是与其他固氮基因相比，在目前获得的
固氮相关功能基因中，nifH基因序列数据最多(包括纯
培养和非培养)，这是应用分子生物学研究微生物多样
性的基础［6］。研究还发现，由 nifH基因和16S rRNA基
因分别构建的系统发育树具有相当的一致性［7］。
2 固氮酶基因检测方法的研究
目前，针对纯培养固氮微生物筛选的方法主要
以无氮培养基进行初筛得到菌株，再测定菌株的固
氮酶活性，确定其是否具有固氮能力［8，9］。乙炔还
原法是一种简单而有效的间接测定固氮酶活性的技
术，测定的灵敏度比 N15示踪提高了 103倍，比凯氏
定氮法提高 106倍［10］。而在对初筛过程中得到的大
量菌株进行固氮酶活性测定时，由于酶促反应时间
与固氮酶活性并非呈线性关系［11］，即不同菌株的酶
促反应时间不一定相同，因此，很难确保测定结果具
有可比性和准确性。根据固氮酶基因的特性，可以
采用分子生物学的方法对初筛菌株的 nifH 基因进
行定性和定量的分析，来弥补乙炔还原法在固氮酶
活性测定中的不足。常用的分子生物学技术多以
PCR和分子杂交为基础。PCR 的应用使 nifH 基因
的研究得到迅速发展，通过 PCR 得到不同 nifH 序
列，对比各 nifH 间的碱基差异，用邻近归并(neigh-
bor-joining)法建立相关的基因系统树，基因系统树
能够直观地显示基因之间的差异［12］，由此可以了解
固氮微生物的物种和分布。分子杂交基于分子变性
和复性的性质，使作为探针的寡核苷酸序列与 DNA
杂交，杂交反应后得到指纹图谱，通过分析指纹图谱
得到目的基因信息。此方法可以重复利用，且可以
同时检测大量样品，但不能准确区分拷贝数较小的
基因，操作过程中应用的技术繁多。
克隆 －测序法(clone-sequencing)、DGGE、T-RFLP
以及基因芯片技术等已应用于森林土壤、植物根际、
水体、极地蓝藻和白蚁肠道等环境样品中固氮酶
nifH基因的检测，并进一步研究分析固氮微生物类
群的多样性［2，3，6，13 － 15］。克隆 －测序法其文库构建
及测序费时费力，不适于对多个样品分析［2，16］;T-
RFLP技术可快速分析环境样品固氮微生物多样性
以及微生物群落的变化［13］，但不能检测具体哪个类
群的 nifH基因发生了变化［14］;DGGE法也可以同时
完成对多个样品的固氮微生物多样性分析，同时将
DGGE凝胶上的 DNA带回收，可对 DNA 带测序，获
得更多的 nifH 基因序列信息［14］;在需要确定究竟
哪些固氮微生物表现固氮活性时，可以应用反转录-
PCR 法(reverse transcription-polymerase chain reac-
tion，RT-PCR)［17］，但此方法在操作中 RNA 的制备
过程难度较大，结果分析较复杂，检测费用也相对昂
贵;基因芯片可以高通量检测环境样品中固氮微生
物的多样性，但不能用于发现新的固氮微生物 nifH
基因［16］，且费用昂贵。
目前，以核酸作为分子标记的分子生物学方法
大都依赖于 PCR技术。以环境总 DNA为模板 PCR
扩增 nifH基因，存在模板的竞争性扩增，某些类群
可能不能被成功扩增［18］。为了更多地扩增 nifH 基
因，需要设计高简并性引物，但导致非特异性扩增，
而特异性引物则会局限于小部分固氮类群［15］。因
此，分子生物学方法，可能会丢失部分固氮微生物信
息，这是在作判断时需要考虑的。自然界环境样品
种类繁多，只有对大量的样品固氮微生物多样性进
行研究，获得足够多的 nifH 序列数据，才能根据这
些数据，作出比较客观的判断。这就需要高效、快速
的获取 nifH基因序列的方法。
3 实时荧光定量 PCR在固氮酶基因检测中
的应用
实时荧光定量 PCR是将荧光能量传递技术(flu-
orescence resonance energy transfer，FRET)应用于常
规 PCR仪中，指在 PCR反应体系中加入荧光基团或
荧光染料，利用荧光信号积累，从而实时监测整个
PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行
定量分析的方法［19］。实时荧光定量 PCR 技术利用
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历
的循环数(Ct 值)与起始模板拷贝数之间的线性关
系做标准曲线，根据 Ct 值标准曲线对 nifH 进行定
量分析。Ct值越小，基因拷贝数越大［20，21］。Ct值标
准曲线直观地显示不同 nifH 的特征。利用已知起
始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得待测
样品的 Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起
始模板量［22，23］。此方法可精确有效地分析固氮微
生物中的 nifH基因。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
根据 FQ-PCR 的化学发光原理可以分为两大
类:一类为探针，包括 TaqMan 探针和分子信标，利
用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增
加;一类分为非探针类，其中包括如 SYBR Green I
或者特殊设计的引物通过荧光染料来指示产物的增
加。目前最常用的实时荧光定量 PCR 产物的检测
技术都是应用荧光染料或基团，并将 PCR与实时信
号检测相结合，其中最简单的是双链 DNA嵌合荧光
染料技术，本法成本低廉，但 SYBR Green I 荧光染
料能与所有的 DNA 双链相结合，对 DNA 模板没有
选择性，所以特异性不如 TaqMan 探针法［24，25］。荧
光染料法对靶序列的定量检测，对 PCR引物设计的
特异性和 PCR反应质量要求比较高。而 TaqMan 探
针法则是高度特异的定量 PCR技术，其核心是利用
Taq酶的 3→5外切核酸酶活性，切断探针，产生荧
光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光
信号的强弱就代表了模板的数量［26，27］。
Church运用实时定量 PCR 方法研究太平洋海
域 nifH表达时发现，单细胞固氮蓝藻 nifH表达有特
定的时间规律，并因物种不同而不同，真光层水域的
单细胞固氮蓝藻随昼夜光照变化而变化［28，29］。
Short等［30］应用此技术发现，在切萨皮克湾及其附
近水域 907h22 nifH 拷贝最大值约为 140 /mL，912h4
nifH拷贝数最大值约为 340 /mL，912h4 序列的丰度
在切萨皮克湾口附近较大，其丰度值随盐度的增加
而增加，并且在 4 月份正午时出现最大值。具体研
究过程中根据试验目的可选用适合的方法或者两种
方法结合使用。Zehr 等［31］研究夏威夷附近海域的
单细胞蓝藻 nifH时，用 RT-qPCR与 QPCR得到不同
物种的 nifH，发现在一个昼夜周期中，试验培养条件
下的单细胞蓝藻 nifH 与现场环境中的 nifH 表达水
平基本保持一致，36 h 持续试验中，发现营养盐磷
nifH的表达和固氮作用的影响不明显。其他条件
可能会影响 nifH 的表达和细胞的固氮作用。QRT-
PCR等结果发现，某些单细胞蓝藻的固氮作用和光
合作用在细胞水平上并不是空间隔离的［29，31］。此
现象的具体机制还未被证实，可以推测这些细胞之
间可能存在生理状态上的差异。Mrtensson等［32］运
用实时荧光定量 PCR 技术对中国福建地区稻田土
壤中 nifH 基因的表达及多样性进行分析，结果显
示，不论是否施肥的地表土与根际土，或是昼夜更
替，不同样品之间在基因表达上都无显著性差异，固
氮菌群落相对稳定。
综上所述，实时荧光定量 PCR技术已经在固氮
基因研究中的应用日趋广泛，但目前仅限于对环境
样品的检测，迄今尚未在纯培养微生物的固氮基因
的检测中应用。本实验室采用基于 TaqMan 技术的
实时荧光定量 PCR技术，通过对引物和探针的优化
设计，对已知具有固氮功能 10 个属的 20 个种固氮
菌株及 5 个属的 5 个种非固氮菌株的 DNA 样品进
行 nifH基因的检测，并进行重复试验。结果显示，
对 20 株具有固氮功能菌株的 DNA样品鉴定均为阳
性，对 5 株非固氮菌的 DNA 样品鉴定为阴性，重复
试验的结果相同(未发表)。此方法对样品中的固
氮酶(nifH)基因的检测具有特异性强，检出速度快
以及重复性好、费用少等优点，在实际工作中亦可以
作为初步筛选大量标本的检测手段。
4 小结及展望
定量 PCR技术是 PCR由定性技术到定量技术的
一次飞跃，荧光定量 PCR技术又是定量 PCR技术的
一次飞跃。传统的微生物学试验方法用于环境微生
物研究时存在许多不足，而荧光定量 PCR 技术有着
传统方法无法比拟的优势。与其他分子生物学技术
的联合应用［33］，不仅可以定性，还可定量研究微生物
结构组成及数量变化，深入探索微生物群落与环境因
子之间的相互作用及其动态变化过程，并为纯培养固
氮菌株的 nifH 基因的检测提供了一种快速、简便而
准确的方法。随着分子生物学及其相关技术的发展，
相信荧光定量 PCR 技术的不足会逐渐得到改进，将
会成为未来分子生物学实验室必备的研究工具。实
时荧光定量 PCR技术，为固氮生物中 nifH基因研究
提供了强有力的技术支撑，与其他分子生物学及传统
方法相结合，将会为人类研究固氮生物开辟出更为广
阔的应用前景。
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(责任编辑 狄艳红)
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