全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 2期·研究报告·
收稿日期：2008-07-14
基金项目：黑龙江省科技攻关重点项目（GB06B303）
作者简介：刘明坤（1983-），男，硕士，主要从事植物分子生物学研究；E-mail：liumk8311@163.com
通讯作者：刘关君，E-mail：liuguanjun2003@126.com
随着生物技术迅速发展，通过基因工程对植物
进行有目的的改造已经成为了可能，但多是对单个
基因操作转化。然而自然界中生物许多性状往往是
由多个基因控制，一般生化代谢途径需要多种酶催
化作用才能完成，并且有时单个基因转化常表现为
超强表达或抑制沉默，同时转入两个或两个以上起
协同作用的基因对于植物转基因是迫切需要的 [1]。
将目的基因构建在同一个表达载体上，多基因表达
载体构建完成后，只需要一次转化就可方便地获得
多价基因同时表达的转基因植物 [2]，然而传统方法
在构建这样载体时，往往设计、操作较麻烦需要构
建中间载体，然后多次连接转化，即费时又费力 [3，4]。
通过对 35S 组成型植物表达载体比对后设计了一
对通用引物， 由于引物本身可以更换酶切位点，解
决了中间载体单一性克隆位点的问题，为多基因转
化提供了新方法，此方法和传统方法相比 ，具有明
显速度快和兼容性高等特点，为 35S 组成型植物双
价表达载体的构建提供了一个新方法。
1 材料方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 植物表达载体 Coil-pROKⅡ由本实
验室保存，大肠杆菌 Top10 购自 TianGen 公司，几丁
质酶基因（Chi）和 β-1，3-葡聚糖酶基因（Gluc）来自
刘关君 [5]构建的西伯利亚蓼抑制性消减文库（SSH）。
一种快速构建 35S组成型植物双价表达载体的方法
刘明坤 刘昌财 许志茹 魏志刚 阎秀峰 刘关君
（东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室，哈尔滨 150040）
摘 要： 通过对几种常用植物表达载体的35S和Tnos序列进行比对，设计带有酶切位点的引物35S和Tnos，通过
PCR克隆了同时带有35S和Tnos序列的目的基因片段，通过定向的酶切、连接获得双价表达载体。此方法简化了植物双
价表达载体构建过程，具有明显时间短、效率高、不需要中间载体、检测简单等特点，而且引物对于多数常用35S组成型植
物表达载体是通用的，为快速构建35S组成型植物双价表达载体提供了一种新方法。
关键词： 35S Tnos pROKⅡ 双价表达载体
A Fast Method of Constructing 35S Constitutive Plant Dual-gene
Expresses Vectors
Liu Mingkun Liu Changcai Xu Zhiru Wei Zhigang Yan Xiufeng Liu Guanjun
（The Laboratory of Forest Genetics and Breeding and Biotechnology of Ministry of Education，Northeast Forestry
University，Harbin 150040）
Abstract： This article reported a simple，general，effective dual-gene xpression vector construction method. After
comparing 35S and Tnos sequence with several kinds of commonly plants expresses vectors，35S and Tnos primers with
restriction enzyme cutting sites were designed. Then the gene fragment with aim gene as well as 35S and the Tnos
were cloned by using PCR and the directional enzyme cutting and connection were used to acquire the dual-gene
expresses vectors. This method which simplified the process of plant dual-gene expresses vectors construction，has apparent
improved qualities，such as short period，high efficiency，no intermediate vectors needed，and easy-testing.
Key words： 35S Tnos pROKⅡ Dual-gene expression vectors
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
1.1.2 试剂 T4 DNA 连接酶 、 胶回收试剂盒和
pGEM-T Easy 载体购于 Promega 公司，Taq plus DNA
聚合酶（高保真型）、质粒提取试剂盒和 RNase 购自
TianGen 公司，限制性内切酶购自 Takara 公司，其他
均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 pROKⅡ-Chi 和 pROKⅡ-Gluc 单价表达载体
的构建 设计 XbaI 和 SacI 酶切位点的引物进行
Chi 基因 PCR 扩增（引物见表 1）。 PCR 产物与植物
表达载体 pROKⅡ质粒分别用 XbaI 和 SacI 双酶切
后回收目的片段并连接，转化大肠杆菌 Top10 感受
态，提取转化子质粒进行酶切和 PCR 鉴定，即获得
pROKⅡ-Chi 单价表达载体。设计引入 XbaI 和 KpnI
酶切位点的引物进行 Gluc 基因的 PCR 扩增 （引物
见表 1）。 PCR 产物与植物表达载体 pROKⅡ质粒分
别用 XbaI 和 KpnI 双酶切后回收目的片段并连接，
转化大肠杆菌 Top10 感受态，提取转化子质粒进行
酶切和 PCR 鉴定， 即获得 pROKⅡ-Gluc 单价表达
载体。
1.2.2 中间载体更换酶切位点法构建植物双价表
达载体 用 HindⅢ和 EcoRⅠ双酶切单价表达载体
pROKⅡ-Chi，得到 35S-Chi-Tnos 片段，用 LA Taq 酶
补平加 A， 并和克隆载体 pGEM-T Easy 进行 TA 连
接 。 将连接产物转化大肠杆菌 Top10 的感受态细
胞，通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒酶切
鉴定，构建了 pGEM-35S-Chi-Tnos 载体。 用 EcoRⅠ
酶切 pGEM-35S-Chi-Tnos 载体，获得两边带有 EcoR
Ⅰ酶切位点的 35S-Chi-Tnos。 用 EcoRⅠ酶切 pROK
Ⅱ-Gluc，获得的片段和 35S-Chi-Tnos 片段进行末端
磷酸化，用 T4 DNA 连接酶连接，即获得双价表达载
体 pROKⅡ-Gluc-Chi（图 1）
1.2.3 35S 和 Tnos 引物 PCR 方法构建植物双价表
达载体 该方法对常用植物表达载体 pBI121、pROK
Ⅱ 、pCAMBIA-1301、pCAMBIA-2300 和 CaMV35S 启
动子进行了序列比对， 这些表达载体 CaMV35S 启
动子一致性很高。 因此，设计扩增 35S-Chi-Tnos 片
段带有 EcoRⅠ酶切位点引物序列 （表 1 ） 。 扩增
35S-Chi-Tnos 片段的反应体系为 10 ×buffer 2 μl，
dNTP（10 μmol/L）0.5 μl，35S-S（10 μmol/L）1 μl，Tnos-
A（10 μmol/L）1 μl，pROKⅡ-Chi 质粒模板 0.5 μl，
TaqDNA 聚合酶 0.5 μl， 加水至总体积 20 μl。 PCR
的反应程序为 94℃ 5 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃
1 min，30 个循环， 最后 72℃ 延伸 7 min，PCR 产物
回收按琼脂糖凝胶试剂盒说明书进行。 EcoRⅠ分
别酶切 35S-Chi-Tnos 片段和 pROKⅡ-Gluc 单价表
达载体， 获得的目的片段和载体片段末端磷酸化，
用 T4 DNA 连接酶连接 ， 即获得双价表达载体
pROKⅡ-Gluc-Chi（图 2）。
2 结果
2.1 pROKⅡ-Chi 和 pROKⅡ-Gluc 单价表达载体
的验证
pROKⅡ-Chi 和 pROKⅡ-Gluc 单价表达载体分
别用引物 Chi-S 与 Chi-A 和引物 Gluc-S 与 Gluc-A
进行 PCR 扩增， 结果显示两个基因均能扩增出目
的条带（图 3）。 提取 pROKⅡ-Chi 单价表达载体质
粒 ，进行 XbaⅠ和 SacⅠ双酶切 ，分别得到 10.3 kb
的载体片段和 800 bp 的 Chi 基因片段（图 4）。 提取
pROKⅡ-Gluc 单价表达载体质粒 ， 进行 XbaⅠ和
KpnⅠ双酶切，分别获得 10.3 kb 的载体片段和 720
bp 的 Gluc 基因片段 （图 4），两个单价载体经测序
结果与预期相一致， 说明 pROKⅡ-Chi 和 pROKⅡ-
Gluc 单价载体构建成功。
2.2 中间载体更换酶切位点法构建双价表达载
体的验证
用 EcoRⅠ酶切 pGEM-35S-Chi-Tnos 载体，获得
了目的片段 35S-Chi-Tnos 为 2.1 kb，大小同预计结
果一致（图 5）。 经测序进一步证实了所获得的基因
片段是正确的。 双价表达载体 pROKⅡ-Glu-Chi 质
粒经 EcoRⅠ酶切后， 经电泳分析有 2.1 kb 的片段
被切下，此片段为 35S-Chi-Tnos（图 6）。 双价表达载
体 pROKⅡ-Gluc-Chi 质粒分别以 Chi 正反引物 、




 

Chi-S 5-AGCATCTAGAATCAACCATGGCTCTCAAC- 3 XbaI
Chi-A 5-CGACGAGCTCATATAAATTAGCAAGAGAGG- 3 SacI
Gluc-S 5-CAGTTCTAGAATGGCAGGCCAATCTCACTG- 3 XbaI
Gluc-A 5-ATCAGGTACCTTAAACATGGATGGCGAGCC- 3 KpnI
35S-S 5-GGCGAATTCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCC- 3 EcoRI
Tnos-A 5-GGCGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3 EcoRI


表 1 引物
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2009年第 2期
图 1 中间载体更换酶切位点法构建双价载体流程
刘明坤等：一种快速构建 35S组成型植物双价表达载体的方法 89
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
Gluc 正反引物和 Gluc 的正向引物、Chi 的反向引物
3 组引物做 PCR 分析， 结果得到了 800 bp、720 pb
和 2.6 kb 的目的片段（图 7）。
2.3 35S 和 Tnos 引物 PCR 方法构建植物双价表
达载体的验证
以带有 EcoRⅠ酶切位点引物 P35S-S 和 Tnos-
A 扩增 35S-Chi-Tnos 片段 ， 结果显示能够扩增出
2.1 kb 的目的片段（图 8）。 双价表达载体 pROKⅡ-
Glu-Chi 经 EcoRⅠ酶切后，经电泳分析有 2.1 kb 的
片段被切下，此片段为 35S-Chi-Tnos（图 9）。 双价表
达载体 pROKⅡ-Gluc-Chi 分别以 Chi 正反引物、Gluc
正反引物和 Gluc 的正向引物、Chi 的反向引物 3 组
引物做 PCR 分析 ， 结果得到了 720 pb、800 bp 和
2.6 kb 的目的片段（图 10）。
3 讨论
和中间载体更换酶切位点法构建植物双价表
达载体过程相比 ，35S 和 Tnos 引物 PCR 法构建植
物双价表达载体方法是一种简便、通用、高效的双
价表达载体载体构建方法，利用此法构建双价载体
具有以下优点。
图 2 35S 和 Tnos 引物 PCR 法构建双价载体流程
HindIII
PstI
SphI
XbaI SacI
Tnos
EcoRI
npt
SphI
PstI
Pnos
RB ori
pROKII-Chi
11 800 bp
P35S
35S 和 Tnos 引物 PCR
35S
EcoRI
Chi Tnos
Tnos Chi LB
Km
EcoRI 酶切
35S-Chi-Tnos
EcoRI
HindIII
PstI
SphI
XbaI KpnI
Tnos
EcoRI
npt
SphI
PstI
Pnos
RB ori
pROKII-Gluc
11 720 bp
P35S
Tnos
Gluc
LB
Km
HindIII
PstI
SphI
XbaI SacI
Tnos
EcoRI
npt
SphI
PstI
Pnos
RB ori
pROKII-Gluc
11 720 bp
P35S
Tnos GlucLB
Km
EcoRI
KpnI
T4 DNA 连接酶连接
HindIII
PstI
SphI
XbaI SacI
Tnos
EcoRI
npt
SphI
PstI
Pnos RB
ori
pROKII-Gluc-Chi
13 580 bp
P35S
Tnos
Gluc
LB
Km
KpnI
35S-Chi-Tnos
EcoRI
90
2009年第 2期
M.DL2000 分子量标准 ；1.Gluc-S 和 Chi-A 为引物的
PCR 产物 ；2.Chi-S 和 Chi-A 为引物的 PCR 产物 ；3.
Gluc-S 与 Gluc-A 为引物的 PCR 产物
3.1 简便性
本试验在单价表达载体的基础上通过 PCR 的
方法，只通过一步酶切和连接就构建成了双价表达
载体，简化了传统实验操作过程。 “中间载体更换酶
切位点法”构建双价载体，过程繁琐，周期长，技术
要求较高。 双酶切产物在与中间载体 pGEM-T Easy
连接时需要粘末端补平加 A 后才能与中间载体
pGEM-T Easy 连接；另外，双酶切产物（35S-X-Tnos）
片段较大，35S 和 Tnos 序列本身就超过 1 kb， 而载
体 pGEM-T Easy 只有 3 kb，它们之间较难进行连接
反应，这两点成为“中间载体更换酶切位点法”构建
双价载体方法的瓶颈。 而 35S 和 Tnos 引物 PCR 方
法构建植物双价表达载体不需要中间载体的构建，
依靠 35S 和 Tnos 引物更换不同的酶切位点， 不仅
减少了中间载体单一性酶切位点的缺点，而且减少
图 3 pROKⅡ-Chi 和 pROKⅡ-Gluc 单价表达
载体 PCR 检测
1.Gluc-S 与 Gluc-A 为引物的 PCR 产物 ；2.Chi-S 和
Chi-A 为引物的 PCR 产物；M.DL2000 分子量标准
图 4 pROKⅡ-Chi 和 pROKⅡ-Gluc 单价表达
载体酶切检测
1.XbaⅠ+KpnⅠ双酶切产物 ；2.XbaⅠ+SacⅠ
双酶切产物；M.DL2000 分子量标准
图 5 pGEM-35S-Chi-Tnos 酶切产物
M.DL2000 分子量标准；1.pGEM-T Easy-35S-Chi-Tnos 酶切产物
图 6 pROKⅡ-Gluc-Chi 质粒酶切产物
M.DL2000 分子量标准 ；1.pROKⅡ-Glu-Chi 质粒酶切产
物；2.pROKⅡ-Glu-Chi 质粒对照
图 7 pROKⅡ-Gluc-Chi 质粒 PCR 扩增产物
M.DL2000 分子量标准 ；1.Gluc-S 和 Chi-A 为引物的 PCR 扩增产
物 ；2.Chi-S 和 Chi-A 为引物的 PCR 扩增产物 ；3.Gluc-S 与 Gluc-
A 为引物 PCR 扩增产物
图 8 35S-Chi-Tnos 片段 PCR 扩增
M.DL2000 分子量标准；1.P35S-S 和 Tnos-A 为引物的 PCR 产物
图 9 pROKⅡ-Glu-Chi 质粒酶切产物
M.DL2000 分子量标准 ；1.pROKⅡ-Glu-Chi 质粒
酶切产物；2.pROKⅡ-Glu-Chi 质粒对照
图 10 pROKⅡ-Glu-Chi 质粒 PCR 扩增产物
刘明坤等：一种快速构建 35S组成型植物双价表达载体的方法
2 000
1 000
750
500
250
100
1 2 M bp
2 000
1 000
750
500
250
100
M 2 M
bp
2 000
1 000
750
500
250
100
1 M bp
2 000
1 000
750
500
250
100
1 2 M bp
15 000
2 500
1 000
250
M 1 2 3bp
2 000
1 000
750
500
250
100
M 1
bp
2 000
1 000
750
500
250
100
1 2 M bp
1 500
2 500
1 000
250
M 1 2 3
bp
91
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
连接、转化次数。
3.2 通用性
此方法的另一个优点就是引物 35S 和 Tnos 引
物的通用性，已经用这对引物对几种常见的植物表
达载体做了 PCR 验证， 可以初步断定此引物具有
35S 植物表达载体的兼容性， 为其他 35S 植物双价
表达载体的构建提供了新的方法。 此外，引物可以
更换酶切位点， 不用寻找合适酶切位点的中间载
体；根据 35S 组成型植物表达载体的本身现有的酶
切位点来设计引物，可省去部分酶切；作定向克隆。
3.3 高效性
由于此方法只需要一步连接，因此提高了工作
效率 。 对于筛选鉴定可以用基因特异性引物和
35S、Tnos 两对引物同时进行检测，这样也在一定程
度上避免了假阳性结果。
综上所述，此方法是一种简便、通用、高效的方
法。 利用此方法已经成功构建了几个双价载体，并
在此基础上构建了酿酒酵母表达载体 pYES-2 双价
载体。 但是由于 pROKⅡ表达载体表达框外只有一
个 EcoRⅠ酶切位点适合插入外源片段， 此方法对
于构建两个基因的 ORF 内同时含有 EcoRⅠ酶切位
点双价载体时，则此方法是不可以应用 ，仍需要进
一步研究。
参考文献
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1060~1064.
5 刘关君. EST技术分析西伯利亚蓼耐盐机制及耐盐相关基因
克隆[博士学位论文]. 哈尔滨：东北林业大学，2007.
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