全 文 ：收稿日期:2007-05-08
基金项目:科技部国际合作项目(2006DFA32380)
作者简介:王永(1977-),男,助理研究员,主要从事农产品安全质量分子检验技术研究
自 1993年第一个转基因作物转基因晚熟番茄正式投放美国市场以来,转基因作物已由 1996年的 190
万 hm2增加到 2005年的 9000万 hm2,市场产值从最初 1995年的 0.75亿美元增加到 2005年的 52.5亿美
元,10年间增加约 70倍。目前已有 21个国家 850万农民正在种植转基因作物,其中转基因大豆占全部种
植面积的 60%,玉米占 24%,棉花占 11%和油菜占 5%[1]。然而转基因作物在带来巨大社会和经济效益的同
时也存在许多问题,主要集中在转基因食品的安全性及对生态环境的安全性方面。因此,世界上的很多国
家和地区先后出台了相应的法律和管理方法,对转基因食品实行强制标识或自愿标识[2]。2002年我国农业
部颁布的《农业转基因生物标识管理办法》,规定对 5大类 17种产品必须进行标识[3]。随着转基因食品的大
量涌入市场,建立有效的转基因检测方法,为进一步完善我国在转基因食品标识管理制度,保护消费者知
情权方面的提供重要技术保障。
Chelex-100快速提取用于转基因检测DNA模板的研究
王永 1 张莉 2 兰青阔 1 赵新 1 程奕 1
(1天津市农业科学院中心实验室,天津 300384;2天津市畜牧兽医研究所,天津 300112)
摘 要: 目的:建立从转基因作物中快速提取DNA的方法。方法:采用Chelex-100法提取抗草甘膦大豆和非转基
因大豆、转基因抗虫玉米Bt176和非转基因玉米中的DNA,使用PCR扩增大豆和玉米的内源基因(Lectin,zSSIb)及外源
特异性序列(CaMV35S,Bt176)评价提取核酸的质量。结果:Chelex-100法能够快速在1h之内从大豆和玉米中提取DNA,
所提取的DNA可以直接用于PCR扩增反应,PCR扩增产物电泳条带清晰,转基因抗草甘膦大豆样品和转基因抗虫玉
米Bt176检测均出现强阳性结果。结论:Chelex-100法提取DNA可以作为转基因检测的模板,该方法具有经济、简便、快
速的特点,适合于转基因检测工作。
关键词: Chelex-100 DNA提取 PCR CaMV35S Bt176
StudyonRapidMethodforExtractingDNAfrom Transgenic
CropsbyChelex-100
WangYong1 ZhangLi2 LanQingkuo1 ZhaoXin1 ChengYi1
(1CentralLabofTianjinAcademyofAgriculturalSciences,Tianjin300384;
2TianjinInstrutionofAnimalHusbandry,Tianjin300112)
Abstract: Objective:ToestablisharapidmethodforextractingDNA from transgeniccrops.Methods:DNA was
extractedDNAfrom transgenicroundupreadysoybeanandtransgenicBt176MaizebyChelex-100.Thequalityofthe
extractionbyendogenousgene(LectinandzSSIb)andforeignspecificsequence(CaMV35SandBt176)wilbeevaluated
withPCR technique.ThePCR productofCaMV35SandBt176wasusedasamarkfragment.Results:TheChlex-100
canquicklyextracttheDNAfrom transgeniccropsabout1hour.TheDNAcanbedirectlyappliedtothefolowing
step-PCR amplification asDNAtemplate.ElectrophoresisresultsofthePCR productsareveryclear,andthedetection
resultsoftransgenicroundupreadysoybeanandtransgenicBt176Maizeshowedstrongpositive.Conclusions:Chelex-100
extractionmethodcouldbeaneficientandreliablemethodtoextractfrom transgeniccropsasDNAtemplateforPCR
detection.
Keywords: Chelex-100 DNAextraction PCR CaMV35S Bt176
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
对转基因食品的检测,目前多采用 PCR方法检测产品中是否含有外源基因成分,其中 PCR扩增前的
DNA提取至关重要。对从转基因作物中 DNA提取技术进行深入研究,以建立经济、简便、快速的 DNA提取
方法。应用的 Chelex-100是一种化学整合树脂,由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。Chelex-100能结合许多可
能影响下一步分析的其他外源物质,并能通过结合金属离子,防止 DNA降解[4~6]。
1 材料与方法
1.1 材料
转基因大豆、玉米阳性对照购于 Fluka公司,抗草甘膦大豆和抗虫玉米 Bt176为本室保存,非转基因大
豆阴性对照由市场购买。
1.2 主要仪器、试剂
水浴锅,旋涡振荡器,定性PCR仪等;PCR引物由上海生工公司合成,Taq酶和 dNTP等试剂购自 Promega
公司,Chelex-100购自sigma公司。
1.3 方法
1.3.1 DNA提取试剂的配制 所需试剂包括:CTAB提取缓冲液,1000ml水中溶解 CTAB20g,Tris12.11g,
NaC181.82g,Na2EDTA7.44g,PVP20g,高压灭菌;10%Chelex-100,100ml水中溶解 Chelex-10010g,高压灭
菌;乙酸钠溶液(3mol/L):408.1g三水乙酸钠,用冰乙酸调节 pH值至 5.2,加水定容至 1L,高压灭菌。
1.3.2 DNA提取方法 取预处理样转移至无菌 EP管,加 CTAB提取缓冲液,混合均匀后于 65℃水浴
30min~50min,12000r/min离心 5min,转移上层液至 EP管,加入 1/10体积的 3mol/L乙酸钠溶液和 0.7倍体
积的预冷异丙醇,离心取沉淀,沉淀加入 200μl10%Chelex-100,12000r/min离心 3min,取上清用于 PCR扩
增。
1.3.3 PCR检测 PCR反应体系组成:10×PCR反应缓冲液 (含 Mg2+)2.5μl,dNTP溶液 (各为 10mmol/μl)
0.5μl,正反引物(10pmol/μl)各 0.5μl,Taq酶(5U/μl)0.5μl,模板 1μl,水补足反应体系,使总体积为 25μl。循
环参数为 94℃预变性 5min,再按 94℃变性 40s、55℃复性 40s、72℃延伸 40s,40个循环,最后 72℃延伸
5min。产物鉴定:扩增产物于加入 EB的 2.0%琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察,用 DL2000做分子量标
记,用 ddH2O做空白对照,每个样品检测设置 3个重复,并以已知阴性样品和阳性样品做对照。所选用的引
物序列见表 1。
表 1 转基因大豆、玉米的内源基因和外源基因的引物序列
2 结果
2.1 PCR扩增效果
对提取到的 DNA经 PCR扩增 Lectin和 zSSIb后,琼脂糖凝胶电泳结果如图 1、图 2所示。由图 1可见
用 Chelex-100法从两份大豆提取的 DNA都能稳定扩增出 118bp的 Lectin特异性条带;由图 2可见用
Chelex-100法从两份玉米提取的 DNA都能稳定扩增出 88bp的 zSSIb特异性条带,阴性及空白对照正常。
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2.2 转基因检测效果
对 Chelex-100法提取的大豆转基因样品和非转基因样品 DNA进行 CaMV35S启动子 PCR检测,对转
基因玉米和非转基玉米进行 Bt176PCR检测,结果转基因大豆样品和转基因玉米样品均出现稳定阳性结
果,非转基因样品未产生阳性条带,阴性、阳性及空白对照正常(图 3、图 4)。
图 1 大豆内源基因 Lectin的扩增结果
M:DL2000 1:水空白对照 2:阴性对照 3:阳性对照
4~6:已知阴性样品 7~9:已知阳性样品
图 2 玉米内源基因 zSSIb的扩增结果
M:DL2000 1:水空白对照 2:阴性对照 3:阳性对照
4~6:已知阴性样品 7~9:已知阳性样品
图 3 CaMV35S的扩增结果
M:DL2000 1:水空白对照 2:阴性对照 3:阳性对照
4~6:已知阴性样品 7~9:已知阳性样品
图 4 Bt176的扩增结果
M:DL2000 1:阴性对照 2:阳性对照 3~5:已知
阴性样品 6~8:已知阳性样品
3 讨论
有关转基因检测中 DNA提取,国内外一般采用 CTAB与有机溶剂抽提结合或者是 SDS与有机溶剂抽
提结合的办法,两种方法操作过程中共同特点是操作步骤繁琐,费时费力,而且在提取过程中加入的酚类
物质或者 SDS严重干扰 PCR反应,往往出现假阴性的结果。另外,酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂的有损操作
者健康,对周边环境会产生一定污染,同时也会加大转基因检测的成本。ChelexDNA提取方法国内外多应
用于从动物和微生物中 PCR扩增反应模板的制备,在植物组织 DNA提取方面鲜有报道。采用 Chelex-100
法制备的模板用于 PCR扩增效果非常理想,与上述两种方法相比,提取非常简便、快速,经济,又避免了使
用有毒化学试剂酚和氯仿。以上结果说明 Chelex-100法提取一般作物中的 DNA用于转基因检测效果理
想。
参考 文献
1 htp:/www.apqchina.org/cn/docs/GRTransgenicCrops2005CN.pdf.
2 吕山花,邱丽娟,等.生物技术通报,2002,(4):34~38.
3 曹泽虹,高明侠.中国食品添加剂,2005,(4):100~105.
4 赵秀玲,文伟刚,等.上海交通大学学报,2004,22(1):82~85.
5 GarcíaGonzálezLA,RodrigoTapiaJP,etal.ActaOtorinolaringolEsp,2004,55(3):139~44.
6 GirafaG,RossetiL,NevianiE.JMicrobiolMethods,2000,42(2):175~84.
王永等:Chelex-100快速提取用于转基因检测DNA模板的研究 145