全 文 ：的细胞，在荧光显微镜下可见 Annexin-V 作为荧光探针标记
的磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧翻转到细胞膜外侧的典型的
形态学变化。流式细胞仪进一步证实了 EG 具有诱导 MDA-
MB-231 细胞凋亡作用，凋亡率可达(39． 77 ± 5． 42)%。
Bcl-2 和 Bax蛋白是调节细胞凋亡的关键因子，发挥着细
胞凋亡“主开关”作用。细胞凋亡的各种信号转导途径受
Bcl-2 /Bax调节。目前，Bcl-2 和 Bax 蛋白常常是研究药物诱
导细胞凋亡机制靶分子。本研究结果表明，EG可通过下调凋
亡抑制蛋白 Bcl-2 表达，上调促凋亡蛋白 Bax 表达，表明 EG
可下调 Bcl-2 /Bax 表达诱导 MDA-MB-231 细胞凋亡，从而抑
制乳腺癌细胞增殖。EG 也是狼毒大戟治疗乳腺癌的一个非
常重要的生物活性成分之一。
参 考 文 献
［1］ Qin GW，Xu ＲS． Ｒecent advances on bioactive natural products
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［7］ Wang Y，Ma X，Yan S，et al． 17-Hydroxy- jolkinolide B inhibits
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covalently cross-link ing Janus kinases and induces apoptosis of
human cancer cells［J］． Cancer Ｒes，2009，69(18) :7302-7310．
(收稿日期:2015-06-09)
岩大戟内酯 B诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究
林宇 田华
【摘要】 目的 探讨岩大戟内酯 B对乳腺癌细胞 MDA-MB-435S凋亡的影响。方法 将不同浓度的
岩大戟内酯 B作用于 MDA-MB-435S细胞，采用流式细胞仪检测其诱导的细胞凋亡情况;电镜观察细胞形
态。结果 随着岩大戟内酯 B浓度增加，细胞凋亡率明显增加;电镜显示药物处理后细胞出现核固缩，细
胞器空泡变性，出现凋亡小体，甚至坏死。结论 岩大戟内酯 B 可诱导乳腺癌细胞凋亡，为临床开发新药
提供理论依据。
【关键词】 岩大戟内酯 B; MDA-MB-435S; 细胞凋亡
Effect of Jolkinolide B on apoptosis of breast cancer MDA-MB-435S cells LIN Yu，et al． Qiqihar Medical
University，Qiqihar，Heilongjiang 161006，China．
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Jolkinolide B induced apoptosis of breast cancer
MDA-MB-435S cells．Methods Apoptosis was detects by AnnexinⅤ-FITC /PI staining by flow Cytometry． Cell
morphology was observed by electronic microscopy． Ｒesults Treated with Jolkinolide B ，the rates of cell
apoptosis were increased significantly(P ＜ 0． 01)． Many nuclei had become pyknotic by electronic microscopy，
organelles empty bubble degeneration， appeared apoptotic body， even necrosis after dosing the different
concentration of drug． Conclusions Jolkinolide B can significantly induced apoptosis of MDA-MB-435S breast
cancer cell． It provides the theoretical basis for a new drug with the development of clinical therapy．
【Key words】 Jolkinolide B; MDA-MB-435S; Apoptosis
岩大戟内酯(jolkinolide)是从狼毒大戟(euphorbia
fischeriana steud)根部分离提取的二萜类化合物［1］。国内外
学者对狼毒大戟成分的抗肿瘤作用及机制研究逐渐成为热
点，有研究岩大戟内酯 B可诱导人白血病 K562、U937 细胞凋
亡［2-3］，本文对岩大戟内酯 B 对 MDA-MB-435S 乳腺癌细胞抑
瘤作用进行探索，为以后 临 床 治 疗 提 供 实 验 依 据。
基金项目:黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划
(1252G004)
作者单位:161006 齐齐哈尔医学院药理教研室
材料与方法
1．药物和试剂:MDA-MB-435S细胞购自上海中科院细胞
库，ATCC细胞。岩大戟内酯 B 由齐齐哈尔大学化工学院提
供，相对分子质量 330． 42，纯度大于 99%，白色粉末，体外实
验用 DMSO配制。主要试剂 DMEM培养基购于美国 Gibco公
司，胎牛血清购于美国 Hyclone，AnnexinV-FITC /PI 细胞凋亡
检测试剂盒购自南京凯基，其它生化试剂均为分析纯。
2．细胞培养:人乳腺癌细胞 MDA-MB-435S 用含 10%胎
牛血清的 DMEM 培养基，37 ℃、5%CO2 培养箱中常规培养，
·7254·齐齐哈尔医学院学报 2015 年第 36 卷第 30 期 Journal of Qiqihar University of Medicine，2015，Vol． 36，No． 30
0． 25%胰酶消化传代。
3．细胞凋亡检测:取对数生长期的人乳腺癌 MDA-MB-
435S细胞，以浓度为 5 × 105 个·ml －1接种于细胞培养瓶中，
培养 24 h后加入不同浓度培养液配制的岩大戟内酯 B，使最
终浓度为 0、5、10、20 μg·ml －1继续培养 24 h。胰酶消化，离
心收集细胞，用 4 ℃预冷 PBS洗细胞 2 次，加入 400 μl Binding
Buffer和 FITC标记的 AnnexinV(20 μg·ml －1)5 μl，室温避光
混匀，再加入 PI(50 μg·ml －1)5 μl，混匀，避光染色 10 min
后，流式细胞仪(BD公司，美国)定量检测。
4．透射电镜观察凋亡细胞形态特征:10、20、40 μg·ml －1
岩大戟内酯 B 作用细胞 24 h 后，细胞刮下，2 500 rpm 离心
3 次，5 min /次，弃去上清，2． 5%戊二醛 4 ℃冰箱中固定过夜。
缓冲液漂洗 3 次，1%锇酸固定 2 ～ 3 h，缓冲液漂洗 3 次，梯度
脱水(4 ℃冰箱内进行:50%乙醇 15 ～ 20 min，70%乙醇 15 ～
20 min，90%乙醇 15 ～ 20 min，90%乙醇与 90%丙酮 1∶ 1 比例
15 ～ 20 min，90%丙酮 15 ～ 20 min;室温 100%丙酮脱水 15 ～
20 min三次)，包埋液包埋，固化，超薄切片，3%醋酸铀-枸橼
酸铅双染色，透射电镜观察，拍片。
5．统计学处理:实验数据运用 SPSS 13． 0 软件进行统计
学处理，以(珋x ± s)表示，P ＜ 0． 05 为差异有显著性。
结 果
1．岩大戟内酯 B 对 MDA-MB-435S 细胞凋亡率的影响:
不同剂量的岩大戟内酯 B(10、20、40 μg·ml －1)预处理 24 h
后，MDA-MB-435S细胞凋亡率增加。见表 1。
表 1 岩大戟内酯 B对 MDA-MB-435S细胞
凋亡率的影响(珋x ± s)
岩大戟内酯 B(μg·ml －1) 孔数 凋亡率(%)
0 5 5． 23 ± 1． 23
10 5 9． 10 ± 2． 16
20 5 22． 16 ± 2． 34*
40 5 33． 89 ± 2． 81*
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 01
2．电镜结果分析:对照组细胞形态规整，胞膜结构完整，
核大，线粒体丰富，核染色质分布均匀，细胞表面有微绒毛突
起(图 1A);不同浓度的岩大戟内酯 B作用细胞 24 h后，随着
岩大戟内酯 B作用浓度增大可观察到凋亡细胞数逐渐增多，
并出现一系列特征性的凋亡形态学改变，细胞核染色质固缩、
边集甚至破碎，有新月状小体形成，胞浆浓缩、内现空泡，线粒
体肿胀，有凋亡小体出现(图 1B，C，D)。
图 1 透射电镜观察岩大戟内酯 B作用 MDA-MB-435S细胞超微结构改变
讨 论
狼毒大戟临床上用于治疗恶性肿瘤已有悠久历史，其中
含有多种化学成分，如二萜及三萜类，甾醇类、黄酮类等，其中
二萜类抗肿瘤作用研究最为丰富。如 17-羟基岩大戟内酯 B
(17-Hydroxy-jolkinolideB)、17-乙酰氧基岩大戟内酯 B(17-
Acetoxyjolkinolide B)、岩大戟内酯 B、岩大戟内酯 A 等均是由
狼毒的干燥根部分离提取的化合物［4-5］。国内外学者对其成
分的抗肿瘤作用及机制研究逐渐成为热点。本实验采用流式
细胞术和电镜技术观察了岩大戟内酯 B 对 MDA-MB-435S 细
胞凋亡的影响。细胞凋亡是基因控制的细胞自主有序的死
亡，肿瘤细胞凋亡受阻是肿瘤发生的原因之一，通过诱导肿瘤
细胞凋亡来筛选抗肿瘤有效药物已经成为新的研究方向。
本研究结果显示，岩大戟内酯 B 可剂量依赖性诱导肿瘤
细胞凋亡，透射电镜观察发现岩大戟内酯 B 明显促进 MDA-
MB-435S细胞核固缩，空泡变性，染色体凝集、边集，并可见凋
亡小体。有效诱导肿瘤细胞凋亡，可能是岩大戟内酯 B抗肿
瘤作用的机理之一，对于其抗肿瘤机制及其他抗肿瘤途径，本
实验室正在进一步研究。
参 考 文 献
［1］ Wang HB，Chu WJ，Wang Y，et al． Diterpenoids from the roots of
Euphorbia fischeriana［J］． J Asian Nat Prod Ｒes，2010，12:1038-
1043．
［2］ Luo H and Wang A． Induction of apoptosis in K562 cells by
jolkinolide B［J］． Can J Physiol Pharmacol，2006，84:959-965．
［3］ Wang JH，Zhou YJ，Bai X，et al． Jolkinolide B from Euphorbia
fischeriana Steud induces apoptosis in human leukemic U937 cells
through PI3K /Akt and XIAP pathways［J］． Mol Cells，2011，32:
451-457．
［4］ Wang Y，Ma X，Yan S，et al． 17-hydroxy-jolkinolideB inhibits signal
transducers and activators of transcription 3 siganling by covalently
cross linking janus kinases and induces apoptosis of human cancer
cells［J］． Cancer Ｒes，2009，69(18):7302-7310．
［5］ Yan SS，Li Y，Wang Y，et al． 17-Acetoxyjolkinolide B irreversibly
inhibits IKappa B kinase and induces apoptosis of tumor cells［J］．
Mol Cancer Ther，2008，7(6) :1523-1532．
(收稿日期:2015-09-29)
·8254· 齐齐哈尔医学院学报 2015 年第 36 卷第 30 期 Journal of Qiqihar University of Medicine，2015，Vol． 36，No． 30