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zoos年·，月 周里塑量!堕堕坌墨塑些塑塑塑壁—— ’!二一一一的核酸疫苗则为预防一些长期以来无法预防或预防效果不佳的传染病带来r曙光。疫苗的发展简史如表1所示。 表l疫苗发展简史TableJ Thekd}listory0fvat：【_i叫deveh甲呲nt
目前，通过FDA认证的疫苗已有上百种，与此
同时正在研制开发的疫苗达数千种之多⋯。有关疫
苗研究的科学论文和专利文献逐年递增，近年来呈
现出指数增长态势(图1)。
冒1疫苗研究的论文和簧国专利统计
¨g 1 Statistics0ftlleanjdesandpa坼nbfor eseaH^invaccine
历史上由简单提纯得到的疫苗曾发生过多起重
大疫苗事故和灾难，这促使人们对疫苗纯度、无菌性
和安全性等提出了更高要求。传统的那些疫苗分离
纯化方法已远不能适应新疫苗生产的需要。正因
此，疫苗分离纯化的研究方兴未艾，国内外关于疫苗
及其分离纯化的论文和专利也相应逐年递增(图
2)。
各种疫苗在研制方式、组成成分和物理、化学性
质及原始来源等诸多方面存在着或大或小的差异，
各种疫苗的分离纯化方法也具有相对特异性。本文
拟就近年来新疫苗，尤其是基因工程疫苗分离纯化
的研究进展、存在的问题和发展方向进行综述。
图2疫苗分离纯化的研究论文和美国专利统计
Fig2 statistics0fa击clesandpatenbforls【，latlonandpun6caLlon
ofvaccir坨
1传统的疫苗分离纯化方法进展
灭活疫苗或减毒疫苗来源于经减毒或灭活T艺
而得的活病原体，或者从被感染的病原体中分离得
到的不具传染性的病
?x
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生物加工过程 笼l卷第2期
(PEG)等沉降技术在疫苗的分离纯化中应用广泛，
近年来又发展了微分硫酸铵沉降(di仃e-∞tmammo—
TliurnsLdfaleprecipi眦ion)等技术”。。
不过，随着层析技术的日臻成熟，沉淀、离心和
过滤技术在疫苗的分离纯化过程中虽仍被广泛应
用，但更多的只是作为起始步骤，用于初步提纯过
程。层析技术已逐渐替代沉淀和离心等传统技术并
与之相结合成为疫苗分离纯化的主流。
2利用层析技术纯化基因工程疫苗
除部分灭活疫苗、减毒疫苗、多糖抗原疫苗和蛋
白质．多糖结合疫苗仍有少量报道仅用离心、过滤和
沉降技术以及萃取、酶降解等方法分离纯化外，各类
疫苗均采用离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤等层
析方法分离纯化。层析技术在疫苗(尤其蛋白抗原疫
苗)的分离纯化中扮演着越来越不可或缺的角色。
无论疫苗抗原组分是存在于细胞内还是分泌至
培养物上清中，蛋白抗原纯化前均需要进行发酵培
养物的固液相分离。离心、过滤、超滤和硫酸铵沉降
技术已成为达此目的的常规手段。如果目的蛋白存
在于细胞内，还必须存纯化前将细胞破碎，破碎方法
以细胞本身的结构及目的蛋白抗原在细胞内所处的
位置而定。常用的细胞破碎方法见表2。除表2所
示方法外，对易于破碎的动物细胞和某些革兰氏阴
性菌还可采用微流体化仪(fIlicmnuidizer)”⋯、反复
冻溶法。’“等来破碎细胞。对于较难破碎的细胞，常
常联用上述两种或两种以上方法。此外，为防止蛋
白酶等对蛋白抗原的作用，常常在离心后得到的收
获液中加人PMsF，EDl’A，DTrr等化学或生物学试
剂。
在完成发酵培养物的固液相分离得到含有目的
蛋白抗原的澄清抽提液后，蛋白抗原疫苗的分离纯
化过程一般可分作初分离(captum)、中间纯化(inier-
n1。dia”pudncation)和精制(poli3hi“g)三步。层析技
术在疫苗分离纯化的全过程中具有举足轻重的地
位，不同层析阶段应根据具体情况选用不同的层析
方法(见表3)。
表2常用的细胞破碎方法
mle2 C0mmon(1i删pt抽nmeIhodsforceus
表3各种层析技术对不同纯化阶段的适应性
mIe3 Thesuitabillty0fv鲥。usc}Irollm吣舯p}lictech掣8sfortll。pu^6c“帆s咖tegies
技术 主要特征 初分离 中间分离 精制 参考文献
IE 分辨率高，交换容量大，高速度 ★★★ ★★★ ★★★ [4，5，13，16，18～22]
Hlc 分辨率较高，交换容量较大，高速 ★★ ★★★ ★ [4，5．20～23]
Ac 分辨率较高．交换容量较大，高速 ★★★ ★★★ ★★ [7～lo，12，18，19，24～28]
塑： 堕坌塑垩!旦皇墨兰型竺!!堕! ± 查盘查 !!二!!!!!：!兰：垫：望：翌j
蛋白抗原纯化的基本过程如图3所示。
基因工程亚单位疫苗由蛋白质或多肽构成，表
面上看来，其分离纯化过程应与一般基因工程蛋白
质的分离纯化相仿，也可根据起始样品的体积、目的
蛋白抗原的大致含量、起始样品的来源(胞内还是上
清)以及目的蛋白的物理、化学、生物学、和免疫学等
性质来选择合适的色谱法纯化精制产物。但疫苗和
其它基因工程蛋白的最大不同在于其分子量往往高
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2003年11月 周卫斌等：疫苗分离纯化研究进展 ’儿’———————————一————————————————一————————————————一③值得沣意的是，目前文献中所报道的基因工程亚单位疫苗大多采用大肠杆菌来表达，在变性的分离纯化过程中采用的一些恶劣条件可能会使抗原
的免疫原性减弱甚至丧失；疫苗本身的某些性质在
吸附．解吸等纯化过程中的变化也可能影响免疫原
性；
④目前采用的一些分离纯化材料和设备比较
昂贵，尤其是被广泛采用的超离心和亲和层析造价
仍旧较高，不利于规模化生产；
⑤亲和层析在基因1二程亚单位疫苗的分离纯
化中作用硅著，但亲和配基本身需要高度纯化，成本
昂贵且生物化学性质不稳定，在分离纯化中维持结
合活性有一定难度。
此外，有些纯化工艺使用蛋白酶抑制剂、洗涤剂
等化学或生物学试剂，这些试剂本身及内毒素等能
否彻底去除以及是否会对疫苗的生物学活性和免疫
原性产生不良影响等方面也是潜在的问题。
尽管面临一些困难，但新疫苗分离纯化的发展
和应用前景相当广阔。对疫苗结构和免疫原性及其
相互关系研究的不断深入将有助于设汁更具有针对
性的纯化方案。基因_[程技术、蛋白质化学和化学
等技术的发展及其与分离纯化的有机结合将对疫苗
研制产生重大影响。分离纯化技术本身的发展更将
进一步推动疫苗的规模化生产而使更多、更有效的
疫苗在人群中广泛使用。
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