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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
肠上皮细胞 RNA干扰 Hsp70 基因转染条件的研究
钟翔 李兴美 李伟 黄雪新 张莉莉 王恬
(南京农业大学动物科技学院，南京 210095)
摘 要: 旨在研究肠上皮细胞(IEC-6)RNA干扰效率的转染条件，并对 4 对 Hsp70 干扰序列进行筛选，为进一步以 RNA
干扰(RNAi)技术研究 Hsp70 对胃肠道的保护功能以及介导信号通路的机理打下基础。以 24 孔培养板培养 IEC-6 细胞，利用
阳离子脂质体转染 FAM-siRNA片段进入 IEC-6 细胞，采用荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测 FAM-siRNA 和转染试剂 Lipo-
fectamine 2000 不同剂量比例对转染效率的影响，并进一步采用 RT-PCR 和 Western blotting 方法对 Hsp70 干扰序列进行筛选。
试验结果表明，采用脂质体转染法可获得较高的转染效率，其中以 80 nmol /L FAM-siRNA + 1 μL Lipofectamine 2000 组的转染
效率最高(85. 77%)。针对 4 个不同靶位点，进行 Hsp70 基因干涉，结果表明，4 个组中 Hsp70 mRNA的表达显著下降，其中 ol-
igo 4 组的基因表达极显著降低。Western blotting的结果表明，oligo 2、oligo 3 和 oligo 4 组中的 Hsp70 蛋白表达极显著降低。最
终确定 80 nmol /L FAM-siRNA + 1 μL Lipofectamine 2000 为最佳转染条件，以 oligo 4(Hsp70 的基因位点为 3672 － 3692)为最
佳 RNA干扰靶基因。
关键词: 肠上皮细胞 RNA干扰 Hsp70 转染
Research on Transfection Condition of RNA Interference Targeting
Hsp70 Gene in Intestinal Epithelial Cells
Zhong Xiang Li Xingmei Li Wei Huang Xuexin Zhang Lili Wang Tian
(College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095)
Abstract: This study was conducted to investigate the transfection condition for affecting RNA interference efficiency on intestinal
epithelial cells(IEC-6)cells，and determine the highest efficiency of RNA interference targeting Hsp70，therefore，it could lay a founda-
tion for the further research on the protection of Hsp70 in gastro-intestinal tract and cell signal transduction of Hsp70 by the method of
RNA interference． IEC-6 cells were cultured in 24 － well plate． With the help of cation liposome，the transfection of FAM-siRNA frag-
ment into IEC-6 was carried out，and the effect of FAM-siRNA and Lipofectamine 2000 in different proportions on the transfection effi-
ciency was examined with fluorescence microscope and flow cytometry． Expression of Hsp70 was determined by RT-PCR and Western
blotting． The results showed that transfect efficiency was the highest(85. 77%)in the group of 80 nmol /L FAM-siRNA + 1 μL Lipo-
fectamine 2000． The results of transfection of a small interfering RNA targeting Hsp70 showed that the expression of Hsp70 mRNA were
significantly decreased in four groups and expression of Hsp70 proteins were significantly decreased in oligo 2，oligo 3 and oligo 4
groups． In conclusion，under the transfection condition of 80 nmol /L FAM-siRNA + 1 μL Lipofectamine 2000，IEC-6 has the highest
transfection efficiency during RNA interference and oligo 4(Target site:3 672 － 3 692)has the highest interference efficiency targeting
Hsp70 gene．
Key words: Intestinal epithelial cells RNA interference Hsp70 Transfection
收稿日期:2011-01-25
基金项目:国家自然科学基金项目(30771569，30972116)
作者简介:钟翔，男，博士，研究方向:单胃动物营养;E-mail:xiangzhongyr@163． com
通讯作者:王恬，男，教授，博士生导师，E-mail:tianwang@ njau． edu． cn
Hsp70 是 HSPs家族中表达最广泛的蛋白，它具
有促进蛋白质的合成、折叠、运输，清除变性蛋白，保
护细胞免受刺激损伤，抗细胞凋亡和增强细胞免疫
功能以及信号传导因子的作用［1］。热应激、手术创
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
伤、缺氧、饥饿、环境应激、病理性应激及生理性应激
等都会诱导细胞中 Hsp70 的表达［2］。研究表明，
Hsp70 对胃肠道的保护具有重要作用，但是其作用
机理尚未完全清楚，特别是 Hsp70 介导的免疫调控
中的作用机理［3］。因此，利用基因沉默技术研究
Hsp70 对肠上皮细胞的保护作用以及其在免疫调控
中的作用机理具有重要意义，同时为其在分子营养
学中的研究打下基础。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是真核生物
中普遍存在的一种自然现象，是由双链 RNA(double
stranded RNA，dsRNA)启动序列特异地转录后基因沉
默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达
的调控机制。典型的内源性 siRNA是由 19 －23 个碱
基构成的双链寡核苷酸 RNA，由 RNase 蛋白复合物
聚集降解靶 mRNA 产生［3，4］。RNAi 广泛存在于真
菌、植物和动物中，作为一种研究基因功能的最常用
工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗及药
物开发等方面有着巨大的潜力［5 － 7］。
控制 RNA 干扰效率的关键因素是小型干扰
RNA(small interfering RNA，siRNA)的序列及转染效
率，而影响转染效率的关键是转染试剂和 siRNA 的
比例，但不同种类的细胞该比例不同。IEC-6 细胞
株是由 Quaroni 等［8］研究建立，其来源于新生的正
常大鼠小肠隐窝，在组织学和免疫学方面具有隐窝
样上皮细胞的特征，为未分化的上皮干细胞，无特异
性基因表达及无致瘤性。目前将 RNAi技术应用于
研究 Hsp70 对肠上皮细胞保护功能和免疫调节功
能的研究国内较少报道。本试验采用荧光倒置显微
镜和流式细胞仪观察转染效率的方法，优化阳离子
脂质体转染 siRNA 进入 IEC-6 细胞的条件，同时采
用 RT-PCR和 Western blotting方法筛选出具有最佳
沉默效率的 Hsp70 的干涉序列，为后续试验提供
参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 细胞株 IEC-6 细胞株购于 The American
Type Culture Collection(ATCC)。
1. 1. 2 主要试剂 Dulbecco’s Modified Eagle Medi-
um(DMEM)、Fetal Bovine Serum(FBS)购于 Gibco公
司，胰蛋白酶 Trypsin(1∶ 250)为 Amresco 公司产品;
牛胰岛素(insulin)为 Sigma 产品;化学合成 Hsp70
siRNA及 NC-control-FAM由上海吉玛制药技术有限
公司(Shanghai GenePharma Co．，Ltd)提供;转染试
剂 LipofectamineTM2000 和 Opti-MEM为 Invitrogen 公
司产品;鼠抗 Hsp70 单克隆抗体购买于加拿大
Stressgen公司(SPA-810) ;HRP 标记二抗(羊抗鼠，
羊抗兔)为上海明睿生物技术公司产品;预染 Mark-
er为 Fermentas MBI产品;硝酸纤维素膜为 Pall Cor-
poration产品;ECL 发光液为 Pierce 产品;裂解液，
BCA蛋白浓度测定试剂盒均购于碧云天生物技术
研究所;Trizol(Invitrogen) ;M-MLV(Promega，美国) ;
SYBR Premix ExTaqTM kit(TaKaRa，中国大连) ;RT-
PCR检测系统为 ABI 7300。
1. 1. 3 siRNA 序列 根据 RNAi 靶点选择原则和
siRNA设计的要求，针对 Hsp70(NM_031971. 2)基
因 4 个位点分别设计干涉序列、阴性对照以及带荧
光标记基团的阴性对照(表 1，表 2) ，并由上海吉玛
生物制药有限公司化学合成。
表 1 Hsp70 基因靶序列
序列(5 － 3) 靶位点
Target 1 CAGATCCTCTGATTCCTAAAT 472 － 492
Target 2 AGGGGAAGTTATAACCCTTAA 599 － 619
Target 3 CAGTCAGAGCTATATTGATAT- 3445 － 3465
Target 4 TTCTCCTTCCCTGTATAATCT 3672 － 3692
表 2 合成的寡核苷酸
对应的寡核苷酸(5 － 3)
Oligo 1
Sense:GAUCCUCUGAUUCCUAAAUTT
Anti-Sense:AUUUAGGAAUCAGAGGAUCTT
Oligo 2
Sense:GGGAAGUUAUAACCCUUAATT
Anti-Sense:UUAAGGGUUAUAACUUCCCTT
Oligo 3
Sense:GUCAGAGCUAUAUUGAUAUTT
Anti-Sense:AUAUCAAUAUAGCUCUGACTT
Oligo 4
Sense:CUCCUUCCCUGUAUAAUCUTT
Anti-Sense:AGAUUAUACAGGGAAGGAGTT
NC-control-FAM
Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
Anti-Sense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT
Negative Control
Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
Anti-Sense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT
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2011 年第 9 期 钟翔等:肠上皮细胞 RNA干扰 Hsp70 基因转染条件的研究
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养 取出保存在液氮中的 IEC-6 细
胞，迅速将冻存管投入到37℃水浴中，并不断摇动，使
管中的液体迅速融化。将冻存管以3 000 r /min离心
5 min，去掉上清液，加入 2 mL DMEM 完全培养液
(90%高糖DMEM + 10%胎牛血清 + 5 μg /μL 胰岛
素 + 100 U/mL青霉素 + 100 μg /mL 链霉素)重新
悬浮沉淀的细胞，接种于培养瓶，在 5% CO2和 37℃
条件下培养。每 2 －3 d传代培养。
1. 2. 2 种植细胞 取生长至 90% － 100%的 IEC-
6 细胞，用 PBS洗两次，再用 0. 25%胰蛋白酶液消化
细胞，加入 10%胎牛血清阻断消化，3 000 r /min 离
心 5 min，去掉上清液，用不含双抗的完全培养基
DMEM制作单细胞悬液。按 1 × 105 cells /mL，每孔
1 mL密度种植到 24 孔培养板上，以保证 24 h 后生
长至 50%。
1. 2. 3 转染 NC-control-FAM siRNA 严格按照 Li-
pofectamine 2000 protocol操作，以下为 6 孔板 1 孔的
添加量和体积:用 50 μL Opti-MEM 稀释 1 μL NC-
control-FAM siRNA(20 pmol，添加到细胞中后 siRNA
的最终浓度为 33 nmol /L) ，用移液枪轻轻混匀。Li-
pofectamine 2000 使用前轻轻混匀，然后将 1 μL Li-
pofectamine 2000 用 50 μL Opti-MEM 稀释，轻轻混
匀并室温孵育 5 min。孵育后，将稀释的 NC-control-
FAM siRNA和 Lipofectamine 2000 混合，轻轻混匀，
室温孵育 20 min(在 25 min 之内进行此步骤)。孵
育期间，用 Opti-MEM 洗细胞两遍，最后将混合好的
NC-control-FAM siRNA和 Lipofectamine 2000 混合液
添加到 24 孔培养板中，加入 500 μL 不含胎牛血清
和双抗的 DMEM 培养基，轻轻前后混匀，置培养箱
中培养 24 － 96 h。4 － 6 h 后可考虑更换成完全
培养基。
1. 2. 4 荧光显微镜检测转染效率 设置 NC-control-
FAM siRNA 4个水平(A) :0、40、80 和 120 nmol /L，同
时设 Lipofectamine 2000(B) :0、1. 0 和 1. 5 μL 剂量，
每组 3 个复孔。转染 6 h 后，分别在明场和荧光下
采用荧光倒置显微镜进行拍照，确认 NC-control-
FAM siRNA的转染情况。
1. 2. 5 流式细胞仪检测转染效率 转染细胞 12 h
后，用 PBS冲洗细胞 2 次，每孔加入 500 μL消化液，
孵育 2 min 后，加入等量完全培养基终止消化，混
匀，离心，弃上清，PBS 重悬，计数，调整细胞至同一
密度，在激发波 488 nm，发射波 525 nm上机检测。
1. 2. 6 Hsp70 基因干涉序列的转染 通过 NC-con-
trol-FAM siRNA转染优化筛选，确定最佳的转染条
件之后，对 Hsp70 基因的 4 对干涉序列以及 Nega-
tive control siRNA 进行转染，进一步筛选出最佳的
干涉序列。按 2 × 105cells /mL，每孔 1 mL 密度种植
到 6 孔培养板上。转染方法同 1. 2. 3。
1. 2. 7 RT-PCR 检测 Hsp70 mRNA 的表达 利用
TRIZOL提取仔猪肠道黏膜样品的总 RNA，测定
RNA浓度及纯度，用琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA 的
质量。将 RNA溶液稀释为 0. 5 μg /μL，取各个样品
总 RNA 2 μg，在 25 μL 的反应混合液体系中进行
42℃，60 min反转录合成 cDNA。
从 GenBank 中查找 Hsp70 mRNA and GAPDH
mRNA 的序列，并由上海英骏(Invitrogen)生物技术
有限公司合成引物。Hsp70 的上游引物:5-AC-
CAGGACACTGTTGAGTTC-3;下 游 引 物:5-ACT-
CATCTCCGAGTTCACAC-3 (NM-031971) ;GAPDH
的上游引物:5-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-
3;下游引物:5-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3
(NM-017008)。
利用 SYBR Premix ExTaqTM kit(TaKaRa)进行
RT-PCR。20 μL 的反应体系:10 μL SYBR Premix
ExTaqTM，0. 4 μL上游引物(0. 2 μmol /L) ，0. 4 μL下
游引物(0. 2 μmol /L) ，0. 4 μL ROX 荧光染料，2 μL
cDNA模板，6. 8 μL ddH2 O。RT-PCR 的反应条件:
95℃ 10 min，95℃ 15 s 40 个循环，60℃ 1 min。结果
用 2 － ΔΔCt表示，ΔΔCt =［Ct样品 － CtGAPDH］－［Ctcontrol －
CtGAPDH］，每个样品做 2 次重复，同时用三蒸水做阴
性对照，检测是否有污染。
1. 2. 8 Western blotting 检测 Hsp70 蛋白的表达
取适量组织，加入裂解液(0. 15 mol /L NaCl，20
mmol /L Tris-HCl(pH8. 0) ，1 mmol /L EDTA，1 mmol /L
PMSF，0. 1 μmol /L E-46，0. 08 μmol /L aprotinin，
0. 1 μmol /L leupetin，0. 1% NP-40)进行匀浆并置冰
上充分裂解 30 min，之后再用超声波破碎仪处理，于
4℃下 12 000 r /min 离心 10 min，取上清用 BCA 法
测定蛋白含量后分装于 0. 5 mL 离心管中并置于
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
－ 20℃保存。取 50 μg 蛋白与 5 × 上样缓冲液
(0. 25 mol /L Tris·HCl pH6. 8，0. 5 mol /L二硫叔糖
醇，10% SDS，0. 5%溴酚蓝，50%甘油)混合并煮沸
5 min。样品经 10% SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分离
后，采用湿转法将蛋白转移到 PVDF 膜上。将膜转
移到封闭液中，室温下脱色摇床上封闭 1 h。将一抗
用 TBST加 5% BSA稀释至 1 000 倍;将膜放入孵育
槽中，倒入稀释好的抗体，并用保鲜膜将孵育槽封
闭，放置于摇床上，4℃冰箱过夜。次日，将二抗用
TBST稀释至 8 000 倍，并与膜在室温下孵育 2 h。
随后滴加 ECL发光液，进行压片曝光显影。最后将
胶片进行扫描，用 ImageJ软件分析目标带的净光密
度值。
1. 2. 9 数据统计分析 试验结果用平均数 ± 标
准误(x－ ± s)表示，采用 SPSS 软件(For Windows
Version 16. 0)进行 t检验。显著性差异水平为 P ＜
0. 05，极显著性差异水平为 P ＜ 0. 01。
2 结果
2. 1 荧光显微镜检测转染效果
荧光显微镜检测转染效果见图 1。荧光显微镜
检测结果表明，在明场下，可观察到部分细胞形态，
但并不明显，这可能与 IEC-6 细胞的特征有关。在
暗场下，在 FAM siRNA和 Lipofectamine 2000 系列浓
度和体积中，均可观察到较多的荧光点，表明 FAM
siRNA已经转染进入 IEC-6 细胞(FAM siRNA 转染
进入的细胞才具有荧光)。
A．明场;B．荧光场
图 1 荧光显微镜检测转染效果
2. 2 流式细胞仪检查转染效率
流式细胞仪检查转染效率见图 2 和表 3。在无
FAM-siRNA时，只有 2. 3%的表达率。在不同浓度
的 FAM-siRNA 和不同体积的 Lipofectamine 2000
时，均具有较高的转染率，其中以 80 nmol /L FAM-
siRNA + 1 μL Lipofectamine 2000 组和 80 nmol /L
FAM-siRNA + 1. 5 μL Lipofectamine 2000 组的转染
效率最高(86. 77% 和 83. 25%) ，但由于高剂量的
Lipofectamine 2000 对细胞具有毒性，因此，本试验选
择了 80 nmol /L FAM-siRNA + 1 μL Lipofectamine
2000 组作为后期的试验条件。
表 3 流式细胞仪检测转染效率
Lipofectamine
2000(μL)
NC-control-FAM siRNA(nmol /L)
0 40 80 120
0 2. 3%
1 58. 14% 86. 77% 79. 68%
1. 5 61. 32% 83. 25% 67. 77%
2. 3 Hsp70 基因的表达
RNA干涉之后，Hsp70 基因的表达见图 3。图 3
的结果表明，对 oligo 干涉 Hsp70 基因之后，与阴性
对照组比较，细胞中 Hsp70 基因的表达分别下调了
59. 8%、37. 94%、85. 73%和 31. 57%，其中 oligo 1、
oligo 2 和 oligo 3 组的基因表达降低差异显著，oligo
4 组的基因表达降低差异极显著。
2. 4 Hsp70 蛋白的表达
RNA干涉之后，Hsp70 蛋白的表达见图 4。与
基因的表达相似，oligo 2、oligo 3 和 oligo 4 组的
Hsp70 的蛋白表达极显著低于阴性对照组，且以
oligo 4组的相对蛋白表达量最低。
3 讨论
RNA干扰指在真核细胞中引入双链 RNA 分子
从而导致具有序列同源性的基因产生特异性基因沉
默(gene silencing)的现象。目前，RNA 干扰技术已
成为基因功能研究的重要工具，并在人类疾病模型、
基因治疗、新药研发以及畜牧遗传育种等诸多领域
展示出了良好的应用前景［9］。该技术首先在线虫
和果蝇等低等生物中取得突破，随之发展成为基因
功能研究的有力工具。
特异性靶向某基因的双链 siRNA 进入细胞内
的核苷酸输送系统包括“病毒载体”和“非病毒载
体”。非病毒载体家族包括许多包裹和输送不同类
型的核酸进入细胞内并发挥基因活性的方法，包括
脂质体转染法、阳离子脂质体复合物法、磷酸钙法、
电击法和基因枪法等物理输送法［10］。
481
2011 年第 9 期 钟翔等:肠上皮细胞 RNA干扰 Hsp70 基因转染条件的研究
a． 0 nmol /L FAM siRNA +0 μL Lipofectamine 2000;b． 40 nmol /L FAM siRNA + 1 μL Lipofectamine 2000;c． 80 nmol /L FAM siRNA +
1 μL Lipofectamine 2000;d． 20 nmol /L FAM siRNA + 1 μL Lipofectamine 2000;e． 40 nmol /L FAM siRNA + 1． 5 μL Lipofectamine
2000;f． 80 nmol /L FAM siRNA + 1． 5 μL Lipofectamine 2000;g． 120 nmol /L FAM siRNA + 1． 5 μL Lipofectamine 2000
图 2 流式细胞仪检测转染效率
* 表示与阴性对照比较，差异显著 P ＜ 0． 05，＊＊表示
极显著差异 P ＜ 0． 01
图 3 Hsp70 基因的表达
阳离子脂质体法具有操作简便，转染效率高等
特点，在基因干扰技术中的应用越来越广泛。脂质
体转染法最重要的是防止其毒性并保证细胞较高的
存活率，因此脂质体与 siRNA 的比例、细胞类型、细
胞种植密度等都是影响转染效率的重要因素［11］，但
转染成功的关键还是转染试剂和 siRNA 的比例，不
同种类的细胞该比例不同。本试验采用阳离子脂质
体转染 FAM-siRNA片段进入 IEC-6 细胞内，通过调
整转染试剂 Lipofectamine 2000 和 FAM-siRNA的剂
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
A:1．阴性对照;2． Oligo 1;3． Oligo 2;4． Oligo 3;5． Oligo 4;B:* 表示与阴性对照比较，差异显著 P ＜ 0． 05 ;＊＊表示极显著 P ＜ 0． 01
图 4 Hsp70 蛋白的表达
量，分别采用荧光显微镜和流式细胞仪观察转染后
荧光强度的大小，进而评价转染效率，以期获得后期
试验中针对靶蛋白具有较高干扰效率的条件。
荧光显微镜观察荧光强度的结果表明，不同浓
度的 FAM-siRNA 和不同体积的 Lipofectamine 2000
均能介导 FAM-siRNA进入细胞中，并具有较强的荧
光。荧光显微镜观察荧光只能判断目的片段是否转
染进入细胞，并不能确切地了解目的靶基因的转染
效率。因此，本试验采用流式细胞仪进一步检测转
染效率。流式细胞仪的检测结果表明，低浓度的
FAM-siRNA(40 nmol /L)没有获得较高的转染效率，
80 nmol /L 的 FAM-siRNA 获得高达 85%的转染效
率，但是随着浓度的提高(160 nmol /L) ，转染效率反
而降低，说明 40 nmol /L 的 FAM-siRNA 并不能与细
胞密度配伍，而高浓度的 FAM-siRNA可能对细胞造
成损害反而降低其转染效率。因此，本试验确定
80 nmol /L的 FAM-siRNA，在 2 × 105细胞密度(种植
密度)时，作为转染时目的靶基因浓度。此外，本试
验发现 1 μL 和 1. 5 μL 的 Lipofectamine 2000 对
FAM-siRNA都具有较高的转染效率，但是高体积的
Lipofectamine 2000 对细胞具有毒性，因此，后期试验
可选择 1 μL Lipofectamine 2000 作为参考剂量。
RNAi通过 siRNA片段与靶基因结合并使之降
解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因
同源的 siRNA 序列，是决定 RNAi 特异性的关键所
在。为了找到潜在的靶位点，本试验设计了 4 个
siRNA序列，并通过 RT-PCR 和 Western blotting 方
法筛选出干涉效率最明显的靶位点。通过试验分
析，本试验确定 oligo 4 siRNA具有最高的干涉效率。
Hsp70 对胃肠道的保护具有重要作用，并介导
免疫信号转导通路，但是其作用机理尚未完全清楚。
因此，通过 RNA 干扰技术将细胞中 Hsp70 基因沉
默，研究其基因功能，对胃肠道的保护具有重要
意义。
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(责任编辑 李楠)
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