全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
环羟基化双加氧酶 亚基保守序列的克隆及基因定位
钟鸣 裴铁浓 李浩戈 陈丽静 马慧 郭志富 张丽
(沈阳农业大学 辽宁省农业生物技术重点实验室,沈阳 110161)
摘 要: 利用 PCR法成功地克隆了不动杆菌 (A cinetobacter ) L2菌株的环羟基化双加氧酶 亚基保守序列 310 bp片
段, 并对其进行测序。序列分析结果表明该片段与 3苯基丙酸盐双加氧酶 亚基、苯 1, 2双加氧酶 亚基、甲苯 2, 3双加氧
酶 亚基的氨基酸序列同源性分别为 72%、75%和 78%。 Southern杂交将菌株 L2的环羟基化双加氧酶 亚基基因定位在 L2
质粒的不同酶切片段上。
关键词: 环羟基化双加氧酶 亚基 克隆 基因定位
Conservative Sequence Cloning and Gene Location of Subunit
R inghydroxylation of D ioxygenase
ZhongM ing Pe iT ienong L iH aoge Chen L ijing M aH ui Guo Zh ifu Zhang L i
(K ey Laboratory of Agricultural Biotechnology of Liaoning Province, Shenyang Agr icultural University, Shenyang 110161)
Abstrac:t A 310 bp fragm en t of convserva tive sequence o f subunit ringhydroxy lation of diox ygenase ofA cinetobacter L2 strain
w as c loned by PCR m ethod, and sequenced The highest hom o logy of sequence of am ino acid w ith subrad ica l o f 3pheny l propionate
d ioxygenase, benzene 1, 2d ioxygenase, to luene 2, 3 d ioxygenasew ere 72% , 75% and 78% , respective ly The resu lt showed that
subunit gene o f r inghydroxy la tion o f dioxygenasew as located on d iffe rent fragm ents o f L2 plasm id d igested w ith restriction enzym es by
sou thern hybr id iza tion
Key words: R inghydroxy lation dioxygenase subun it C lon ing Gene location
收稿日期: 20090316
基金项目:辽宁省自然科学基金 ( 20062111) ,辽宁省重点实验室专项资金计划项目,中国科学院陆地生态过程重点实验室开放课题资助项目
作者简介:钟鸣 ( 1971) ,女,博士,副教授,从事污染土壤生物修复研究
多 环芳烃 ( po lycyclic aromatic hydrocarbons,
PAHs)是指分子中含有两个或者两个以上苯环的化合
物 [ 1]。PAHs来源广泛,主要是煤炭,石油, 天然气,木
材,垃圾或其它有机物在不完全燃烧过程中形成,由于
PAHs具有致癌、致突变和致畸性,一般难以用生物降
解,对人类健康和生态环境造成很大的危害性 [ 2~ 4]。
有关研究表明,芳香环羟基化双加氧酶是微生物降解
多环芳烃的关键酶,该酶含有几个亚基,包括一个电子
传递链和一个末端双加氧酶,末端双加氧酶包括一个
大的 亚基和一个小的 的亚基与双加氧酶的催化功
能密切相关 [ 5]。本研究成功克隆环羟基化双加氧酶的
亚基保守序列,并且根据该亚基的保守序用 PCR的
方法标记探针,采用 Southern杂交的方法对双加氧酶
亚基基因进行定位。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株 PAH s降解不动杆菌 (A cinetobacter )
L2为本实验室筛选保存。
112 试剂 D IG DNA标记试剂盒 、地高辛杂
交检测试剂盒 、Hyb高效杂交液、Hybond+尼龙膜
购自深圳依诺金生物科技有限公司。BamH I、H in
dIII、Pvu II和 N ot I均购自北京赛百盛基因技术有限
公司。质粒小提中量试剂盒购自北京天根有限
公司。
113 PCR引物 根据菲环羟基化双加氧酶 亚基
的保守氨基酸序列设计 1对简并引物。引物 1: 5TC
( AGCT) ( GA ) C ( AGCT ) GC ( AC ) AA ( CT ) TTCCA
( AG)TT3;引物 2: 5TG( CT ) AG ( CT ) T ( AT) ( CT)
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
CA ( CT) GG (AGCT) TGG3; 根据环羟基化双加氧酶
的 亚基 PCR扩增获得的 310 bp片段的保守序列设
计引物, 引物 P1: 5ATTACACTCGATTTCCCACTTG
3, 引物 P2: 5TACGGCATTGACGGTTCTT3。引物
均有上海生工公司合成。
12 方法
121 PAH s降解不动杆菌质粒提取 按照质粒小
提中量试剂盒的说明书上的方法提取不动杆菌质粒
DNA,作为探针的制备和酶切的模板。
122 PCR反应 25 l PCR反应体系模板 DNA 2
,l引物 1、引物 2各 2 ,l Taq酶 025 ,l 10 PCR
buffer 25 ,lM gC l2 2 ,l dNTP 035 ,l ddH2O 159 l。
PCR反应条件:预变性 94 5m in;预扩增 94 1m in,
50 1m in, 72 2m in, 5个循环; 94 1 m in, 54 1
m in, 72 2m in, 36个循环;最后 72延伸 10m in。
123 PCR产物的克隆及序列测定 琼脂糖凝胶
电泳检测扩增片段,用 DNA凝胶回收试剂盒回收特
异片段,连接克隆质粒载体 pMD18T,对获得的阳性
重组质粒测序,由大连宝生物工程有限公司完成。
124 探针的制备 20 l PCR反应体系,含 ddH 2O 1
l、MgC l2 2 ,l引物 P1、引物 P2各 15 ,l 10 PCR缓
冲液 2 l、B iotindUTP标记混合物 1 ,l质粒 DNA模
板 10 ,l Taq DNA聚合酶 1 l。PCR反应条件:预变
性 94 4m in;预扩增 94 30 s, 58 40 s, 72 60 s,
30个循环;最后 72 延伸 10m in, 4 保存。
125 酶切菌株 L2质粒 用 DNA man软件对环
羟基化双加氧酶 a亚基全基因序列进行酶切位点分
析,然后选用 BamH I、H indIII、Pvu II和 N ot I等不包
含双加氧酶 a亚基基因酶切位点的限制性内切酶完
全酶切菌株 L2质粒。
126 转膜、Southern杂交和洗膜 将酶切后的菌
株 L2质粒 DNA的印迹转到带正电荷的尼龙膜上,
转移 24 h。 65 预杂交 2 h,然后 65 杂交过夜,洗
膜具体步骤严格按照试剂盒说明书操作。
2 结果与分析
21 环羟基化双加氧酶 亚基片段扩增及测序结果
以菌株 L2质粒为模板, 引物 1、引物 2为引物
扩增菲环羟基化双加氧酶 亚基,得到一个大小为
310 bp左右的特异扩增片段,如图 ( 1) ,回收特异条
带并与载体 pMD18T连接后测序,测序结果如下:
GATTTCCGCCGCGAACTTTCCAATTACACTCGA
TTTCCCACTTGTGTACACCACCGATGATTTCAGTACC
ACCTTGACGACGGTCAACAACGCCATCTAAGTACCA
CGCGATATCGCCCATGTATTCTTCAAGATCAGGCGT
GGTTTCATCCCAACAAGCGAATACCAAGCCTTTGTA
AGACTTCACACGATTCACTTCAACAGACCCCATTGC
TCTTTACATGCACCATGCGGATAAAGCACGATCTTC
CAGCGGGATATCTTTTAAAGAACCGTCAATGCCGTA
TGACCACCCATGAAAACTACAAAT。
MDNA标准分子量 ( DNA /H indIII+ E coR I) ; S样品
图 1 环羟基化双加氧酶 亚基基因片段的 PCR扩增
22 环羟基化双加氧酶 亚基基因定位结果
MDNA /H indIII Marker; 1菌株 L2质粒; 2~ 5L2质粒依次用 P vu II、
Not I、H indIII、BamH I酶单切; 6~ 9 Southern转印杂交自显影图
图 2 环羟基化双加氧酶 亚基基因定位图谱
(下转第 79页 )
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2009年第 5期 孙燕华等:亚麻脱胶过程中细菌学、酶学及相关参数分析
左 16S rDNA V3区 PCR结果;右 DGGE结果;
( 124 h, 248 h, 372 h, 496 h; 5120 h)
图 7 亚麻发酵过程的细菌多样性
速下降,后期趋于稳定; 脱胶过程中, COD一直在升
高,前期增长迅速,后期缓慢。脱胶过程中 24~ 48 h
时间段内脱胶液中微生物数量相对较多。 48 h后
出现明显优势菌。
参 考 文 献
1 李忠福,徐建国 黑龙江医药, 2002, 15( 6 ) : 428~ 429
2 陈同度,生物化学实验指导 [M ]北京:人民教育出版社, 1979
3 国家环境保护局 中华人民共和国国家标准:水质 总氮的测定
碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法 ( GB 1189489 ) 北京:中国
标准出版社, 1989
4 国家环境保护局 中华人民共和国国家标准:水质 化学需氧量
的测定 重铬酸盐法 ( GB 1191489 ) 北京: 中国标准出版
社, 1989
5 M il lerH, Kan eko S, Chung CH epato logy, 1989, 9: 322~ 327
6 Bassam J, G aetanoAnolles G, Gresshof fM Analytical B iochem ist ry,
1991, 196: 80~ 83
(上接第 70页 )
3 讨论
研究表明编码降 PAH s关键酶的基因有的位于
染色体上,有的位于质粒 DNA上 [ 6, 7]。例如拟诺卡
氏菌 KP7, 利用分子杂交技术检测发现包含 8个降
解基因的 DNA 片段均位于菌株的染色体 DNA
上 [ 8]。张杰在 2003年报道一株鞘鞍醇单胞菌属细
菌含有一个大约 60 kb大小的质粒, 且该质粒与
PAH s降解功能有关 [ 9]。本实验根据得到的环羟基
化双加氧酶的 亚基保守序列 310 bp片段设计探
针,由于菌株 L2质粒双酶切的效果不明显, 所以采
用单酶切菌株 L2质粒的方法做 Southern印迹杂交,
结果表明菌株 L2的双加氧酶 亚基基因定位于约
35 kb的 Pvu、N ot、BamH I和 H ind酶切片段
上。通过这种定位为下一步构建基因文库, 为环羟
基化双加氧酶全长基因序列的获得提供了可能。
参 考 文 献
1 孙娟,郑文教, 陈文田, 等 生态学杂志, 2005, 24 ( 10 ): 1211
~ 1214
2 田蕴,郑天凌,胡忠,等 应用与环境生物学报, 2003, 9 ( 4 ) : 439
~ 443
3 张杰, 刘永生, 孟玲, 等 应用生态学报, 2003, 14( 10 ) : 1783~
1786
4 Ahn Y, Sanseverino J, S ayler GSB iod egradation, 1999, 10: 149
~ 157
5 章俭,夏春谷 化学进展, 2004, 16( 1 ) : 116~ 122
6 郑乐,刘宛,李培军 生态学杂志, 2007, 26( 3 ): 449~ 454
7 曹晓星,田蕴,胡忠,等 生态学杂志, 2007, 26( 6 ): 917~ 924
8 Sa ito A, w abuch i T, H arayam a S C hem osph ere, 1999, 38 ( 6 ):
1331~ 1337
9 张杰, 刘永生, 冯家勋, 等 应用与环境生物学报, 2003, 9( 5 ):
542~ 545
79