全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
甜菜叶柄高效直接再生体系的建立
殷东林 祝建波 张彦伟 向本春
(石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子 832003 )
摘 要: 通过预试验,从 4中不同基因型甜菜中选取 KWS9103作为试验材料,建立其叶柄高效直接再生体系。通过种
植无菌苗、预培养、诱导分化培养, 获得了再生植株, 建立了甜菜快速繁殖体系。结果表明, 甜菜种子经过消毒处理后培养,取
幼苗在 MS附加 6BA 0. 5 m g /L和 NAA 0. 05 m g /L的培养基中预培养, 再取叶柄作为外植体转入诱导培养基 M S附加 6BA
0 5 mg /L和 NAA 0. 05 m g /L中诱导不定芽,不定芽诱导率为 50%以上。在 MS附加 IBA 2. 0 m g /L生根培养基中生根,诱导生
根率在 90℅以上,移栽成活率高达 95%。
关键词: 甜菜 叶柄 植株再生
The Establishment ofH igh Efficient DirectRegeneration
System of Sugar Beet Petioles
Yin Donglin Zhu Jianbo ZhangYanwei X iang Benchun
(K ey Laboratory of AgriculturalB iotechnology of Shihezi University, Shihez i 832003 )
Abstrac:t The KWS9103 as experim enta l ma teria ls from four sugar beet breeding lines w ith different genotypes w as selected
through pretesting, and a high effic ient d irec t regeneration system of its petio les w as setup. Through planting free vacc ine seed lings, pre
cu ltivating, induction o f diffe rentia tion cu ltivating, regenerated plants w ere obta ined, and a rap id propagation system o f sugar beet w as
established. The resu lts show ed that sugar bee t seeds w ere ster ilized and germ inated, then the ir seed lings w ere transferred to theMSm e
d ium add itiona l 6BA 0. 5 m g /L and NAA 0. 05 m g /L for precu lture. The ir petioles w ere cut as exp lants and were transferred to the
shootinducing med ium MS add itional 6BA 0. 5 mg /L and NAA, and 0. 05 mg /L for induction o f adventitious buds, w ith induction rate
o f adventitious buds m ore than 50% . Budsw ere p laced onto the rootingm ed ium MS add itiona l IBA 2. 0 m g /L for roo ting, induction rate
o f rooting was m ore than 90% , and surv iva l rate of transp lanting w as as high as 95% .
Key words: Sugar bee t Petio le P lant reg eneration
收稿日期: 20100315
基金项目:石河子大学科学研究发展计划 动植物育种专项 ! ( gxjs2007yz13)
作者简介:殷东林,男,硕士,研究方向:分子生物学; Ema i:l yd l669@ 126. com
通讯作者:向本春,男,教授,博士生导师, Em ai:l xbc@ shzu. edu. cn
甜菜是两年生异交草本植物, 由于其栽培驯化
时间较短,遗传背景狭窄,资源贫乏, 特别是自交高
度不亲和性,往往使得优良单株基因型很容易丢失,
给优良品种选育材料的繁殖和保存带来了不少的困
难 [ 1 ]。因此可以通过植物组织培养为甜菜基因工
程育种提供新的途径。
目前关于甜菜组织培养的众多研究表明, 器官
发生植株再生途径与体细胞胚发生植株途径相比更
加方便、有效。直接分化形成器官再生系统具有如
下特点:获得再生植株的周期短, 操作简单; 由于未
经脱分化的细胞直接分化芽, 因此体细胞无性系变
异小,能较好地保持受体植物的遗传稳定性 [ 2 ]。因
此, 采取直接器官发生再生植株方式 (未经历愈伤
组织阶段 )获得的再生苗更适合作为转化外源基因
的受体植物。
基于此,本试验拟对 4个甜菜品种进行离体培
养, 旨在建立以叶柄为外植体高效直接诱导不定芽,
再诱导芽生根进而长成完整植株的快繁体系, 为甜
菜遗传转化奠定了试验基础。
2010年第 8期 殷东林等:甜菜叶柄高效直接再生体系的建立
1 材料和方法
1. 1 材料
4个甜菜品种分别为 STD0725, STD2071, KWS
9103, 218。
1. 2 种子消毒与接种
种子剥去外壳后选取饱满的种子,用自来水浸
泡 1 h。在超净工作台中转移到灭过菌的三角瓶
中,分别采用两种方法进行消毒: ( 1)先用 70%乙醇
处理 30- 60 s,然后用 0. 1%的升汞处理 8- 10m in,
再用无菌水漂洗 5- 6次。 ( 2) 先用 10%的 H 2O 2处
理 3 m in,然后用 0. 1%的升汞处理 8- 10m in, 再用
无菌水漂洗 5- 6次。将消过毒的种子接种于含琼
脂 0. 7%、蔗糖 3%的 1 /2M S ( pH58)基本培养基
上,在 ( 24 ∀ 2) # 下暗培养,使种子萌发。
1. 3 预培养
取发芽 10 d左右的小苗剪掉根部,分别转移至
3种预培养培养基中进行预培养: ( 1 ) M S + 6BA
05mg /L + NAA 0025 mg /L; ( 2 ) M S + 6BA 05
mg /L+ NAA 005 mg /L; ( 3 ) MS + 6BA 05 mg /L
+ NAA 01 mg /L。培养条件: ( 24 ∀ 2) # , 2 000 lx,
16 h /d。
1. 4 不定芽诱导
分别选取在预培养基中生长 30- 40 d, 50- 60
d, 80- 90 d的幼苗,取其叶柄 1 cm (从基部包括叶
片连接处即 3 mm叶子和 7 mm叶柄 )作为外植体,
分别接种到上述 3种培养基中进行不定芽诱导。培
养条件: ( 24 ∀ 2) # , 2 000 lx, 16 h /d。
1. 5 诱导生根
待不定芽长成 4- 5片叶子的幼苗时,切下转入
MS生根培养基中 (附加 2. 0 mg /L IBA )诱导生根,
发育成完整植株。
1. 6 植株移栽
1个月左右后,将长有 2 cm以上的粗壮根系的
试管苗炼苗 8 d,取出植株, 用自来水洗去根部琼脂
块,种植于装有花土和蛭石 ( 3∃1)的花盆中,在 15#
的阴凉环境中保湿 10 d即可成活。
2 结果与分析
2. 1 基因型筛选
通过种子的种植以及苗的预培养和叶柄的诱导
分化,发现只有 KWS9103这一品种种子消毒后污
染率低,发芽率高, 苗在预培养基中茁壮生长, 且不
定芽诱导率最高, 故选其为最佳试验材料。在试验
中发现先用 10%的 H2O 2处理 3 m in, 然后用 0. 1%
的升汞处理 8m in,再用无菌水漂洗 5- 6次,这样处
理消毒效果最好,发芽率在 60%以上 (图 1)。如果
用 70%酒精处理不易掌握时间, 消毒时间过短, 污
染严重; 消毒时间过长则会抑制种子发芽。用
01%的升汞消毒时间不宜过长, 否则发芽率会
降低。
2. 2 预培养对幼苗生长的影响
在不同培养基及不同激素组合的预培养基上幼
苗生长表现不同, 通过试验证明只有在 MS+ 6BA
0. 5mg /L+ NAA 0. 05mg /L的预培养基中幼苗长势
最好 (表 1,图 2)。
表 1 预培养时激素组合对幼苗生长的影响
预培养培养基 幼苗数 预培养无菌苗数 无菌苗长势
MS + 6BA 0. 5m g /L+ NAA 0. 025m g /L 20 16 较好
MS + 6BA 0. 5m g /L+ NAA 0. 05m g /L 20 18 最好
MS + 6BA 0. 5m g /L+ NAA 0. 1m g /L 20 6 较好 、易污染
2. 3 外植体不经过愈伤阶段直接诱导出不定芽
R itch ie等 [ 3, 4 ]研究表明,芽的再生频率受到供
体植株材料预培养条件和时间的影响, 培养 8- 12
周的供体植株顶端取下的叶柄可得到最佳的芽再
生。这可能是由不同发育时间外植体内源激素水平
变化和对生长调节物质的敏感性不同所致。通过试
验表明,选取预培养 50- 60 d的幼苗, 取其叶柄作
外植体在 MS + 6BA 0. 5 mg /L + NAA 0. 05 mg /L
的培养基中培养诱导出不定芽的频率最高 (表 2, 图
3)。
2. 4 生根和移栽
用解剖刀分割不定芽成单苗转入 MS生根培养
161
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
基中 (附加 2. 0 mg /L IBA)诱导生根, 15 d左右就有
细根出现 (图 4), 进而成为完整的植株 (图 5)。 1个
月左右将试管苗炼苗 8 d后, 取出植株, 用自来水洗
去根部琼脂块,种植于花土和蛭石 ( 3∃1)的花盆中,
在 15# 的阴凉环境中保湿 10 d即可成活。
表 2 激素组合和预培养时间对外植体生长的影响
不定芽诱导培养基 预培养时间 ( d)
30- 40 50- 60 80- 90
诱导率 外植体形态 诱导率 外植体形态 诱导率 外植体形态
MS+ 6BA 0. 5 mg /L + NAA 0. 025 mg /L _ 膨大、变脆 _ 出现愈伤化 + 褐化
MS+ 6BA 0. 5 mg /L + NAA 0. 05 mg /L _ 同上 + + + 绿色、不膨大 + + 部分褐化
MS+ 6BA 0. 5 mg /L + NAA 0. 1 m g/L _ 同上 + 偏黄 _ 褐化较重
+诱导率 20%以下; + +诱导率 ( 20- 40)% ; + + +诱导率 ( 40- 90)%
图 1 种子发芽 图 2 预培养无菌苗
图 3 诱导的不定芽 图 4 生根
图 5 再生植株 图 6 子叶节的预培养
3 讨论
本试验参考前人研究结果,对甜菜再生体系的条
件加以摸索,建立了 KWS9103这一品种的叶柄直接
再生体系,并且得出一些经验, 归纳为以下几点: ( 1)
10%的H 2O 2比 70%的酒精消毒效果好。用 70%酒精
处理不易掌握时间,消毒时间过短,污染严重;消毒时
间过长则会抑制种子发芽。 ( 2)预培养对外植体 (叶
柄 )产生不定芽的影响很大,这与大多数的研究者得
出的结论一致。R itch ie等 [ 4 ]研究表明,培养 8- 12周
的供体植株顶端取下的叶柄可得到最佳的芽再生。
本试验的研究证明了这一点,只有预培养50- 60 d的
无菌苗取下的叶柄才有大量不定芽诱导出来。张剑
锋等 [ 1 ]研究表明,经激素处理后的整株叶柄和离体
叶柄诱导不定芽均比较容易,提高了叶柄外植体诱导
不定芽的频率。本试验选取不经激素处理的无菌苗
和经过不同激素组合处理的无菌苗切取叶柄作外植
体诱导不定芽,结果只有经过 MS+ 6BA 0. 5 mg /L+
NAA 0. 05mg /L预培养才能获得大量不定芽。而与
张生学 [ 3 ]所用 MS+ 6BA 0. 5 mg /L预培养无菌苗不
同,这可能与甜菜的基因型不同有关。 ( 3)在试验中
发现,外植体选取后剩下的子叶节,再次接入诱导培
养基中可以获得新的甜菜苗 (图 6),进而再次得到叶
柄外植体;并且此外植体诱导不定芽的频率更高,这
可能是同化作用的原因。因此,将剩下的子叶节再次
预培养不仅可以获得更多数量的外植体,而且第二次
切取的外植体诱导率更高。 ( 4)在生根时要把丛生
芽切成单芽,这样不仅易于生根,而且能获得更多的
再生植株。
甜菜 KWS9103叶柄高效直接再生体系的建立
为甜菜快速繁殖,以及今后通过转基因手段改良甜
(下转第 167页 )
162
2010年第 5期 路晓萌等 :三株芸豆叶际拮抗细菌的筛选与鉴定
参 考 文 献
[ 1] 王晓云. 菜豆锈病的发生及防治. 安徽农学通报, 2006, 12
( 3) : 108.
[ 2] 刘阳.菜豆锈病的发生及防治技术. 内蒙古农业科技, 2005, 10
( 3) : 56.
[ 3] 萨姆布鲁克 J,拉塞尔 DW.分子克隆实验指南 (第 3版 ) [M ] .北
京:科学出版社, 2002: 15641594.
[ 4 ] 魏景超.真菌鉴定手册 [M ] .上海:上海科学技术出版社, 1979:
278331.
[ 5] 许志刚.普通植物病理学 [M ] .北京:中国农业出版社, 2006:
215230.
[ 6] 方中达. 植病研究方法 [ M ] . 北京: 中国农业出版社, 2004:
249253.
[ 7] Garrity, GM, B ell A, L ilburn TG. Taxonom ic ou tlin e of the pro
karyotes bergey% sm anual of sys tem at ic bacteriology( 2nd ed ) [M ] .
New York, Berlin, H eid elberg: Springerverlag, 2004: 172184.
[ 8] 东秀珠,蔡妙英,等.常见细菌系统鉴定手册 [ M ] .北京:科学出
版社, 1996: 370399.
[ 9] 郭俊涛. 微生物的鉴别与图谱 [M ]. 北京: 人民卫生出版社,
2007: 1836.
[ 10 ] 奥斯伯 F,布伦特 R,金思特 RE,等.精编分子生物学实验指南
[M ] .北京:科学出版社, 1998: 187213.
[ 11 ] Gurtler V, S tan is ich VA. N ew approach es to typ ing and iden tif ica
t ion of bacteria us ing the 16S23S rDNA spacer reg ion. M icrob iolo
gy, 1996, 14 ( 2 ): 316.
[ 12] W eissbu rg WG, Barns SM. 16S ribosoma l DNA am p lification for
phylogenetic study. Jou rnal of Bacterial, 1991, 17( 3) : 697703.
[ 13] Chun J, Lee JH, Jung Y, et a.l E zT axon: a w ebbased tool for the i
d ent if icat ion of prokaryotes based on 16S ribosom al RNA gene se
quen ces. In tern at ion al Journal of System atic and E volut ionary M i
crob iology, 2007, 57: 22592261.
[ 14] Edw ards SG, Seddon B. M od e of antagon ism of B acillus brevis a
gain stB otrytis c inerea in vitro. Jou rnal of App lied M icrob iology,
2001, 91( 4 ): 652659.
[ 15] L iS, Zhao ZA, L iM, et a.l Pu rification and characterization of a no
vel ch it inase from Ba cillus brev is. Acta B ioch im ica et B iophys ica
S in ica, 2002, 34( 6 ): 690696.
[ 16] 郝晓娟,刘波,周先治,等.短短芽孢杆菌 JK2菌株抑菌活性物
质产生条件的优化.河北农业科学, 2009, 13( 6) : 4649.
[ 17] W ich it ra L, PunpenH, Sam erch aiC. G row th inh ib itory prop erties of
B acillus subtilis strain s and theirm etabolites again st the green m old
p athogen (P en icillium d ig itatum Sacc. ) of cit ru s fru it. Postharvest
B io logy and Technology, 2008, 48( 1 ): 113121.
[ 18] E em an M, Pegadob L, Du frthe YF, et a.l In fluen ce of environm en tal
cond itions on the interfacial organ isation of fengycin, a b ioactive li
popept ide produced by B acil lus subtil is. Jou rn al of Colloid and In
terface S cien ce, 2009, 32 ( 9) : 253264.
[ 19] 姜莉莉,陈彦闯,辛明秀,等.枯草芽孢杆菌在防治植物病害上
的应用及研究进展.安徽农学通报, 2009, 15( 7) : 3739.
(上接第 162页 )
菜品质建立了一套良好的试验系统。
参 考 文 献
[ 1] 张剑锋,李天然,邓香兰.高效诱导甜菜再生植株的研究.生物工
程学报, 1997, 13( 3 ) : 273278.
[ 2] 段肖霞.甜菜离体培养直接器官发生及遗传转化的研究 [ D ] .乌
鲁木齐:新疆农业大学, 2007.
[ 3] 张生学.不同基因型甜菜叶柄直接再生体系的建立及影响因素
的研究 [ D] .北京:中国农业科学院, 2007.
[ 4] Ritch ie GA, ShortKC, DaveMR. In v itro shoot regeneration from cal
lu s, leaf ax ils and petio les of sugar beet ( Be ta vu lgaris L. ). J E xp
Bot, 1989, 40: 277283.
167