全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 2期·研究报告·
收稿日期：2008-07-11
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划重大项目“农药、兽药抗体库建立”资助（2006BAK02A21/1）
作者简介：张海棠（1966-），女，河南偃师人，副教授，研究方向：动物营养与饲料科学
通讯作者：王自良（1966-），男，博士，教授，主要从事动物性食品安全生物技术研究；Tel：0373-3693196，E-mail：wangzl_2008@yahoo.com.cn
氨苄青霉素（Ampicillin，AMP）对人体具有过敏
反应、扰乱机体微生态、诱导产生耐药菌株等危害
作用 [1]，世界各国均对 AMP 在动物生产中的应用制
定了最高残留限量 （MRL），我国农业部规定 AMP
在动物可食组织中的 MRL 为 50 μg/kg， 牛奶中为
10 μg/kg。目前，AMP 残留检测已有 LC/MS[2]、HPLC[3]
和微生物学杯碟法 [4]等 ，但由于仪器设备昂贵 ，或
操作烦琐费时，或检测限太高等缺陷，不能满足实
际检测工作的需求。 免疫学分析方法具有灵敏、快
速、特异、简便等优点，目前国外已有多家公司开发
出相关产品， 国内虽然已有关于 AMP 抗体研制的
报道 [5，6]，但其免疫学特性尚不能满足免疫学检测
方法的建立。
1 材料与方法
1.1 实验动物、试剂与溶液
3 月龄、体重 2.0±0.2 kg 新西兰白兔 5 只，购自
郑州大学医学院，本实验室饲养。氨苄青霉素钠，纯
度≥99.0% ，分子量 371.39，Amresco 产品 ；弗氏佐
剂 FCA、FIA 和碳化二亚胺 （EDC），Pierce 产品；牛
血清白蛋白 （BSA）和鸡卵清蛋白 （OVA），Sigma 产
氨苄青霉素人工抗原的制备及抗体特性鉴定
张海棠 1 李桂平 2 季跃光 2 王自良 1
（1河南科技学院动物科学学院，新乡 453003；2新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）
摘 要： 根据氨苄青霉素（AMP）分子结构上存在的化学活性基团羧基，用碳化二亚胺法（EDC）将AMP偶联于载
体蛋白BSA，合成人工抗原BSA-AMP，用紫外扫描（UV）和SDS-PAGE进行鉴定，推算分子结合比；用BSA-AMP免疫新
西兰白兔，间接ELISA测定多抗血清（pAb）效价，阻断ELISA鉴定其敏感性，琼脂双扩散试验和交叉反应试验鉴定其特异
性。结果表明，BSA- MP偶联成功，分子结合比为1∶17.6，获得了高效价、敏感、特异的AMP pAb，为AMP残留免疫学
检测方法的建立奠定了基础。
关键词： 氨苄青霉素 半抗原 人工抗原 抗体 特性
Studies on Synthesis of Artificial Antigen and Characteristics of
Polyclonal Antibody of Ampicillin
Zhang Haitang1 Li Guiping2 J Yueguang2 W Ziliang1
（1The Animal Science College，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003；2The Animal Science College，
Xinjiang Agricultural University，Urumchi 830052）
Abstract： According to the chemical active group carboxyl in Ampicillin（AMP） molecular structure，the EDC
method was used to conjugate AMP to BSA，and artificial antigen BSA-AMP was obtained. UV d SDS-PAGE were
used to identify BSA-AMP，and the molecular conjugation ratio of which was calculated. New Zealand white rabbits
were immunized with BSA-AMP，and the titres of polyclonal antibody （pAb） were detected by indirect ELISA，the
sensitivity and the specificity of which were identified by blocking ELISA and test of agar bidirectional pervasion and
cross-reaction respectively. The results showed that BSA-AMP wa synthesized successfully with conjugation ratio of AMP
to BSA about 17.6∶1，and the high-titer，sensitive and specific AMP pAb were produced in sera of immunized New
Zealand white rabbits，thus making it possible to establish immunoassay of RAC residues in animal food.
Key words： Ampicillin Hapten Artificial antigen Antibody Characteristics
2009年第 2期
品；四甲基联苯胺（TMB），上海五联化工厂；试验用
水为超纯水；羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP），本实
验室制备；其它试剂市售所得，AR 级。 洗液（PBST）
为 0.01 mol/L pH7.4 的磷酸盐缓冲液 （PBS）含
0.05%Tween-20； 包被液为 0.1 mol/L pH9.6 的碳酸
盐缓冲液 （CBS）；间接 ELISA 的封闭液 、稀释液为
含 5%猪血清的 PBST；酶底物为 TMB 的磷酸-柠檬
酸缓冲液；终止液为 2 mol/L 的 H2SO4。
1.2 主要仪器
U-3000 紫外扫描仪（UV），日本岛津产品 ；DU-
600 核酸蛋白分析仪， 德国 Beckman 产品；Bio-rad-
550 型酶标仪，美国 Bio-rad 产品；AE260 电子天平，
德国 Mettler 产品 ；HI9321 酸度计 ， 美国 Hanna 产
品；3K-18 高速冷冻离心机 ，德国 Sigma 产品 ；凝胶
成像系统及分析软件 ，Syngene 产品 ；JM-250 电泳
仪，大连捷迈科贸有限公司；DK-8D 电热恒温水槽，
上海一恒科技有限公司；SZ-93 自动双重纯水蒸馏
器，93-3 定时恒温双向磁力搅拌器， 上海亚荣生化
仪器厂。
1.3 人工抗原的合成
采用 EDC 法合成人工抗原 [7]。 称取 10 mg BSA
溶于 1 ml 0.05 M pH7.4 PBS 缓冲液中，记为 A 液 ；
20 mg EDC 溶于 0.5 ml PBS 缓冲液中， 记为 B 液；
40 mg 氨苄青素钠盐溶于 0.5 ml PBS 缓冲液中，记
为 C 液；将 B 液、C 液混合，室温下避光搅拌反应 6
h，缓慢加入 A 液，避光搅拌反应 12 h，然后用 0.05
M pH 7.4PBS 缓冲液中透析 3 d，收集后-20℃冻存
备用（图 1）。
1.4 人工抗原的鉴定
1.4.1 UV 鉴定 用 PBS 配制 AMP 和 BSA 标准溶
液，取一定量的 BSA-AMP 溶于 PBS，用 Bradford 法 [8]
测定其蛋白质的浓度， 据此浓度调节 BSA-AMP 溶
液中蛋白质的浓度与 BSA 标准溶液一致， 在波长
200～350 nm 范围内进行紫外扫描。 参照杨利国 [9]所
述方法计算 BSA 与 AMP 的分子结合比。
1.4.2 SDS-PAGE 鉴定 选择浓缩胶浓度为 5% ，
分离胶浓度为 12%，浓缩胶电压为 120 V，分离胶
电压为 60 V；考马斯亮蓝染色；紫外凝胶成像系统
分析软件估算 BSA 与 AMP 的分子结合比 [10]。
1.5 多抗血清（pAb）的制备
用 BSA-AMP 免疫 5 只 6 周龄雌性 Balb/C 小
鼠。 首免，用无菌 PBS 溶解 BSA-AMP，与等量 FCA
混合，充分乳化，免疫剂量为 50 μg·0.2 ml/只，背部
皮下分 4～6 点注射； 加强免疫， 用无菌 PBS 溶解
BSA-AMP，与等量 FIA 混合，充分乳化，首免后 4 周
进行 ，共免 5 次 ，每次间隔 2～6 周 ，免疫剂量为 50
μg·0.2 ml/只，背部皮下分 4～6 点注射；最后 1 次免
疫后 10 d 断尾采血，分离血清。
1.6 pAb 的鉴定
1.6.1 效价测定 采用间接 ELISA 测定 pAb 效
价。 基本程序参照 Tijssen[11]所述方法。
1.6.2 敏感性鉴定 阻断 ELISA 测定 pAb 对 AMP
的半数抑制浓度（IC50），并以 IC50 作为敏感度，阻断
ELISA。 基本程序参照王自良等 [12]所述方法。
1.6.3 特异性鉴定 （1）琼脂双扩散试验 ：在 1%
琼脂糖凝胶上打出梅花孔，中央孔加入 80 μl pAb，
周围孔分别加 入 80 μl 的 BSA-AMP、BSA、OVA-
AMP、OVA、AMP 和 PBS，37℃温育 72 h，0.1%考马
斯亮蓝染色，生理盐水漂洗 72 h 脱色后照相。 （2）
交叉反应试验： 选择 AMP 及其它抗生素作为抑制
剂 ，用阻断 ELISA 测定各抑制物的 IC50，按照公式
CR（%）＝AMP 的 IC50/抑制物的 IC50×100 计算交叉反
应率（CR%）。
2 结果与分析
2.1 人工抗原的鉴定结果
2.1.1 UV 鉴定 结果见图 2。 BSA 最大吸收峰在
280 nm，AMP 在 245～275 nm 之间都有吸收但无明
图 1 BSA-AMP 化学合成路线图
图 2 BSA、AMP 和 BSA-AMP 的紫外扫描光谱
吸
光
值
波长 （nm）
张海棠等：氨苄青霉素人工抗原的制备及抗体特性鉴定 139
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
显的特征峰 ， 二者偶联后其峰叠加并位移至 275
nm， 表明偶联成功； 依据朗伯-比尔定律， 推算出
BSA-AMP 的分子结合比为 1∶17.6。
2.1.2 SDS-PAGE 鉴定 结果见图 3。 BSA 的泳动
速度大于 BSA-AMP，说明 BSA-AMP 的分子量大于
BSA，证明 AMP 与 BSA 已成功偶联；紫外凝胶成像
系统分析软件分析得出，BSA-AMP 的分子量为 7.27×
105，BSA 的分子量为 6.62×105，BSA 与 AMP 的分子
结合比约为 1∶17.5，与 UV 鉴定结果基本一致。
2.2 pAb 鉴定结果
2.2.1 效价测定 结果见表 1。 免疫的 5 只兔血清
抗体效价均达到了 105， 说明获得了较好的免疫效
果，其中 2 号兔血清效价最高为 1∶6.4×105。
2.2.2 敏感性鉴定 结果见表 2、图 4。 AMP 在 0～
640 ng/ml 范围内，5 只免疫兔的阻断 ELISA 曲线呈
良好的线性关系，产生了较好的抑制效果，其中最
好的是 2 号兔 ， 其线性回归方程为 y＝-28.71x＋
89.463，γ2＝0.9936，符合线性关系的判定标准，从曲
线可以计算出 2 号兔的 IC50 为 23.7 ng/ml， 选择 2
号兔的 pAb 进行特异性鉴定。
2.2.3 特异性鉴定 （1）琼脂双扩散试验：以 BSA-图 3 BSA-AMP 和 OVA-AMP 偶联的 SDS-PAGE 鉴定


   

110
210 410 810 1.610 3.210 6.410 1.2810
1 1.368 1.102 0.865 0.639 0.424 0.287 0.186 0.11 0.084 0.067
2 1.614 1.302 0.998 0.765 0.556 0.379 0.243 0.168 0.078 0.062
3 1.232 0.968 0.729 0.517 0.348 0.231 0.149 0.098 0.082 0.072
4 1.091 0.795 0.566 0.389 0.254 0.139 0.087 0.082 0.078 0.068
5 1.476 1.187 0.923 0.714 0.505 0.321 0.194 0.124 0.086 0.061
表 1 pAb 效价测定
AMP
ng/ml

0 1.25 2.5 5 10 20 40 80 160 320 640
1 1.124 1.021 0.974 0.896 0.842 0.768 0.681 0.582 0.501 0.411 0.337
2 1.083 0.921 0.872 0.775 0.679 0.559 0.450 0.349 0.262 0.187 0.134
3 1.114 1.062 0.977 0.889 0.787 0.689 0.569 0.463 0.347 0.281 0.212
4 1.078 0.975 0.918 0.842 0.743 0.615 0.511 0.388 0.313 0.223 0.163
5 1.136 1.091 0.994 0.953 0.887 0.821 0.747 0.662 0.576 0.535 0.483

表 2 AMP 多抗血清的敏感性测定
AMP 免疫家兔， 不仅产生了针对 AMP 的抗体，还
产生了针对 BSA 的抗体。由于 BSA 与 OVA 的抗原
性不同 ，OVA 孔与 pAb 孔之间无沉淀线形成 ，而
OVA-AMP 孔与 pAb 孔之间形成一条清晰的沉淀
线，说明 pAb 中确实含有针对 AMP 的抗体（图 5）。
（2）交叉反应试验：AMP 的 IC50 为 23.7 ng/ml，说明
AMP 对其 pAb 结合反应的特异性很强； 与同类抗
生素羟氨苄青霉素和青霉素有交叉反应，与其它抗
生素药物无交叉反应（表 3）。图 4 AMP pAb 对 AMP 的阻断 ELISA 抑制曲线
97.4
66.2
43.0
31.0
20.0
14.4
Marker BSA-AMP BSAkD
140
2009年第 2期
3 讨论
3.1 AMP 人工抗原的制备方法
自 Nagakura 等 [13]1991 年制备出 AMP 抗体以
来， 已证实 AMP 分子上可用于偶联的活性基团为
氨基和羧基。 因此，AMP 人工免疫原的合成可采用
3 种方法，一是戊二醛法 （GA），用同型双功能交联
剂 GA 将载体蛋白氨基与 AMP 氨基进行偶联 ；二
是物理缩合法 ， 在巴比妥缓冲液中载体蛋白与
AMP 缩合而成；三是 EDC 法，用异型双功能交联剂
EDC 将载体蛋白氨基与 AMP 羧基进行偶联。 通过
对比试验，EDC 法以单酰胺键（-CONH-）为间隔臂，
有 2 个碳原子位，长度适宜，免疫效果更好。
3.2 AMP 人工抗原的鉴定方法
鉴定小分子人工抗原常用的方法有 UV、IR、SDS-
PAGE、核磁共振碳谱 （C13-NMR）、标记抗原示踪法
等。 IR 和 C13-NMR 可准确测定待测物的化学结构，
但试验者必须具备一定水平的图谱分析知识和操
作经验，且费用较高；标记抗原示踪法需要对半抗
原进行标记， 并需要测定结合半抗原的放射强度，
试验烦琐费时。因此，UV 和 SDS-PAGE 是目前鉴定
人工抗原较为适用的方法。
3.3 AMP pAb 的特性
抗体的特性主要体现于抗原抗体反应的结合
容量、亲和性和选择性 3 个方面，结合容量大小以
效价来表示 ，在试验中采用间接 ELISA 测定 ，以 2
号兔效价最高，达到 1∶6.4×105；亲和性通常以亲和
常数（Ka）表示，但由于 pAb 的亲和性不均一，难以
测得准确的 Ka 值， 在试验中以敏感性衡量其亲和
性，试验结果表明，2 号兔产生的 pAb 亲和性最好，
IC50 为 23.7 ng/ml； 选择性是由抗体的特异性所决
定的，试验采用琼脂双扩散试验和交叉反应试验鉴
定其特异性 ，2 号兔产生的 pAb 具有较好的特异
性。
参考文献
1 Zebrowska Loupina I，Szymczyk G，Wrobel A. Pol Merkur Lekarski，
2000，9（51）：623~626.
2 Luo W，Ang CY，Thompson HC，et al. J Chromatogr B Biomed Sci
Appl，1997，694（2）：401~407.
3 Ghidini S，Zanardi E，Varisco G，et al. Food Addit Contam，2003，
20（6）：528~534.
4 张可煜，王大菊，袁宗辉，等.中国兽医学报，2004，24（5）：470~
472.
5 刘成梅，黄丽，罗舜菁，等.食品科学，2007，28（9）：384~387.
6 陆彦，王金洛，徐福洲，等.动物医学进展，2005，26（2）：67~70.
7 Cliquet P，Cox E，Van Dorpe C，et al. J Agric Food Chem，2001，49
（7）：3349~3355.
8 汪家政，范明，蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社，2002，
42~47.
9 杨利国，胡少昶，魏平华，等，酶免疫测定技术[M].南京：南京
大学出版社，1998，252~258.
10 Kamps HC，Carlin RJ，Sheffield C，et al. Journal Immunological
Methods，1993，（164）：245~253.
11 Tijssen P，Practice and Theory of Enzyme Immunoassay[M].
Amsterdam：Elsevier，1985，173~210.
12 王自良，王建华，杨艳艳，等 .中国兽医杂志，2006，42（4）：
62~64.
13 Nagakura N，Souma S，Shimizu T，et al. J Antimicrob Chemother，
1991，28（3）：357~68.
图 5 琼脂双扩散试验

 IC ng/ml CR%
 23.7 100
 31.0 76.4
 1128.6 2.1
  2.3×10
0.01
 2.3×10 0.01
 2.3×10 0.01
 2.3×10 0.01
 2.3×10 0.01
 2.3×10 0.01

表 3 AMP pAb 与 AMP 类似化合物的交叉反应
张海棠等：氨苄青霉素人工抗原的制备及抗体特性鉴定 141