全 文 ：Hz , H25′) , 6140 ( 1 H , d , J = 210 Hz , H26 ) , 6120
(1 H ,d ,J = 210 Hz , H28) ,5138 (1 H ,d , J = 715 Hz ,
H21″) ; 13 C2NMR (75 M Hz ,DMSO2d6 )δ: 17716 ( C2
4) ,16412 (C27) ,16113 (C25) ,15613 (C22) ,15613 (C2
9) ,14815 ( C24′) , 14419 ( C23′) , 13315 ( C23) ,12211
(C26′) , 12112 ( C21′) , 11610 ( C25′) , 11513 ( C22′) ,
10410 (C210) ,10118 (C21″) ,9817 ( C26) ,9316 (C28) ,
7519 (C25″) ,7313 ( C23″) ,7113 ( C22″) , 6810 ( C24″) ,
6012 (C26″) 。以上数据与相关文献报道[ 9 ] 一致 ,从
而确定该化合物为槲皮素232O2β2D2吡喃半乳糖苷。
参考文献 :
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紫杉醇完全抗原的合成鉴定及免疫原性分析
马丽玲1 ,晁 　志2 3 ,田中 　宏幸3
(11 广州医学院护理学院 ,广东 广州 　510450 ; 21 南方医科大学中医药学院 ,广东 广州 　510515 ;
31 九州大学大学院药学研究院 ,日本 福冈 　81228582)
摘 　要 :目的 　制备红豆杉属植物中抗癌成分紫杉醇 (paclitaxel , TAX)的人工抗原及抗血清 ,为获取分泌抗紫杉醇
抗体的单克隆细胞系及分离单链抗体基因、进而以之提高植物中紫杉醇的量 ,及建立快速检测 TAX 的酶联免疫吸
附测定 ( EL ISA ()法提供技术基础。方法 　将 72木糖基紫杉醇 (72xylotaxol ,72xyl2TAX)经 NaIO4 氧化打开糖环 ,与
载体蛋白牛血清白蛋白 (BSA)反应偶联 ,制得半抗原2载体蛋白复合物后 ,用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定
其中结合的半抗原数目 ;以此抗原免疫BALB/ c 小鼠 ,制备抗血清 ,并通过 EL ISA 法检测其抗体效价和特异性。结
果 　合成的人工抗原 TAX2BSA 中 TAX 与 BSA 的结合比约为 4～5 ∶1 ;免疫小鼠到特异针对 TAX 的抗血清 ,
TAX抗体的效价为 1 ∶3 200。结论 　成功地合成了 TAX的人工抗原 ,且该抗原有较好的免疫原性。
关键词 :紫杉醇 ;半抗原2载体蛋白复合物 ;免疫原性 ;基质辅助激光解吸飞行时间质谱
中图分类号 :R28411 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821045204
　　紫杉醇 (paclitaxel , Taxol ○R ,以下简称 TA X) 是
一种结构复杂的二萜生物碱 ,1971 年从短叶红豆杉
T ax us brevi f ol i a Nutt1 的树皮中提取而得[1 ] ,可
以通过独特的微管聚合促进作用而抑制癌细胞的生
长[2 ] ,相继被证明对卵巢癌、子宫癌、乳腺癌等 10 余
种癌症具有很好的疗效 ,1992 年经美国 FDA 批准
上市 ,是目前治疗乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌的
临床一线用药 ,需要量逐年递增[3 ,4 ] 。
紫杉醇主要来源于红豆杉属植物 ,但其量甚微 ,
即使是含量最高的树皮部位 ,亦仅为 0101 %左右。
据计算 ,处理一个卵巢癌患者需要 6 棵树龄 60～
100 年的红豆杉 ,每年 200 kg 紫杉醇的消耗量意味
着要砍伐红豆杉 100 万株。而红豆杉属植物资源稀
少 ,生长缓慢 ,自然更新困难 ,单纯依靠自然资源必
然造成物种的濒危甚至灭绝。因而 ,紫杉醇的生产
远不能满足临床需求 ,售价高居不下[5 ] 。如何解决
日益尖锐的紫杉醇来源问题 ,自其上市之日起 ,即成
为世界范围内药学、植物学等领域研究者面临的重
大课题。研究发现 ,往植物中转入针对其生物活性
成分的单链抗体 ( scFv) 基因 ,可以诱导其产生更多
的该成分。据此 ,笔者提出了向红豆杉植物细胞中
转入抗紫杉醇单链抗体基因 ,提高红豆杉植物中紫
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3 收稿日期 :2009201215　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30500652) ;教育部留学回国人员科研基金资助项目 ;广东省中医药局科研计划项目 (1060131)
作者简介 :马丽玲 ,女 ,高级讲师。3 通讯作者　晁　志　Tel : (020) 61648256 　E2mail :chaozhi1971 @yahoo1com1cn
杉醇的含量的设想[6 ] 。
欲获得单链抗体基因 ,首先要对动物进行免疫 ,
制备能够分泌针对紫杉醇的抗体的单克隆细胞系。
但 TA X 相对分子质量 ( Mr) 较小 ,为不能直接引发
免疫反应的半抗原 ,必须和大分子的载体蛋白如牛
血清白蛋白 ( bovine serum albumin ,BSA) 、钥孔戚
血蓝蛋白 ( keyhole limpet hemocyanin , KL H) 等偶
联之后构成完全人工抗原 ,才能应用于免疫操作。
本实验以 BSA 为载体合成半抗原 TA X2载体蛋白
复合物 ,经基质辅助激光解吸飞行时间质谱 ( ma2
t rix2assisted laser absorption ionization time2of2
flight mass spect romet ry , MALDI2TOF2MS) 鉴定
其中结合半抗原分子数目后免疫小鼠 ,用 EL ISA 法
分析血清中抗体的滴度和特异性 ,对其免疫原性进
行了考察。
1 　材料与方法
111 　实验材料 :72木糖基紫杉醇 (72xylotaxol ,Chro2
maDex ,Inc1 ,美国) ; TAX (质量分数为 98 % , HPLC归
一法)由上海同田生物有限公司提供。牛血清白蛋白
(BSA) 、人血清白蛋白 ( HSA) 、弗氏完全佐剂 ( FCA) 、
弗氏不完全佐剂 ( FICA)为 Sigma 公司产品 ; HRP 酶
标羊抗鼠 IgG、2 ,2′2氨基2双 (32乙基2苯并噻唑啉262磺
酸)铵盐 (AB TS) 显色剂为美国 Pierce 公司产品。甲
醇、NaIO4 、三氟乙酸 ( TFA) 、芥子酸 ( sinapinic acid) 、
乙腈均为分析纯。J MS2EL ITE 基质辅助激光解吸飞
行时间质谱仪为日本 J EOL 公司产品。6 周龄 SPF
级雌性 BALB/ c 小鼠 ,体质量 16～18 g ,由南方医科
大学动物中心提供。
112 　TA X2BSA 人工抗原的合成 :72木糖基紫杉醇
5 mg 溶于 014 mL 甲醇 , 逐滴加入 10 mg/ mL
Na IO4 溶液 014 mL ,室温避光搅拌 1 h。将上述反
应混合物 014 mL 逐滴加入含 5 mg/ mL BSA 的 50
mmol/ L 碳酸盐酸冲液 (p H 916) 014 mL 中 ,用 1
mol/ L Na2 CO3 溶液调节 p H 值至 9 左右 ,避光搅拌
8 h 后对水透析 ,冷冻干燥 ,即得复合物 TA X2BSA。
113 　MALDI2TO F2MS 测定 TAX2BSA 中半抗原
TA X 结合数目[7 ]
11311 　供试品处理 :称取 TAX2BSA 016 mg ,溶于
8 mol/ L 的尿素 30μL 中 ,再稀释成适当的浓度。
称取 BSA 1 mg 溶于 50μL 水中。
11312 　基质辅助溶液的配制 : 将体积分数为
0115 %的 TFA 35μL 加到乙腈 15μL ,再加入适量
的芥子酸使溶液达到过饱和状态 ,超声 15 min ,
1 000 r/ min 离心 3 min ,备用。
11313 　MALDI2TOF2MS 测定 :各取供试品和基质
辅助溶液 1μL ,充分混匀 ,吸取混合液 1μL 滴加在
金属点样板上 ,室温干燥 ,置 MALDI2TOF2MS 中
测定。测定时加速电压为 20 kV ,栅极电压 17 kV ,
线性模式下操作 ;飞行时间通过电脑中 500 M Hz 瞬
态数字转换器测定 ,所得数据用 GRAMS/ 386 软件
( Galactic Indust ries Corp1 ,Salem ,N H ,美国)分析。
114 　TAX2BSA 人工抗原的免疫原性鉴定
11411 　抗血清的制备 :将 TAX2BSA 溶于含 8 mol/
L 尿素的 Tris2HCl 溶液 ,质量浓度为 20 mg/ mL ,
以磷酸盐缓冲液 ( PBS) 稀释到 200 μg/ mL 。取 1
mL 上述稀释溶液 ,加入 1 mL 弗氏完全佐剂 ,制成
混悬液 ,以 015 mL ip 给予小鼠 ,免疫 BALB/ c 小
鼠 ,共 2 只。两周后进行第一次加强免疫 ,方法同
上 ,仅将弗氏完全佐剂改为弗氏不完全佐剂。以后
每隔两周进行一次加强免疫 ,但不使用佐剂 ,直接使
用 200μg/ mL TAX2BSA 的 PBS 稀释液。第 3 次
加强免疫 4 d 后眼球内眦采血 ,将所采得的血液置
于硅烷化 Eppendorf 离心管中 ,于10 000 r/ min 离
心 5 min ,分离血清 ,进行抗体效价测定和抗体特异
性检测。
11412 　抗体效价测定 :用 p H 916 碳酸盐缓冲液将
TAX2HSA (合成方法同 TA X2BSA) 配制为质量浓
度为 1μg/ mL 的溶液 ,以 100μL/ 孔包被 96 孔免疫
反应板 ,37 ℃孵育 1 h ;用含 5 %脱脂奶粉的 PBS 溶
液于 37 ℃封闭 2 h ;加入从 1 ∶100 开始顺次 2 倍稀
释的抗血清 ( PBS 稀释) 100μL/ 孔 ,37 ℃孵育 1 h ;
加入羊抗鼠酶标抗体 (1 ∶1 000稀释) 100μL/ 孔 ,37
℃孵育 1 h ,显色液用 AB TS ,100μL/ 孔 ,于 37 ℃反
应 15 min ,用酶标仪读出各孔在波长 405 nm 处的
吸光度值 ( A 405 nm ) 。阴性对照用未免疫过的小鼠血
清 ,空白对照为 PBS。每一稀释比的供试品设置 3
个平行孔。血清供试品的 A 405 nm值 ( P) 与阴性对照
的 A 405 nm值 (N)之比 ( P/ N)大于 2 即为阳性 ,反之则
为阴性 ,以 P/ N 大于 2 的血清最高稀释倍数作为抗
体的效价。
11413 　抗体特异性检测 :选取效价较高的 BALB/ c
小鼠血清进行测定。以上项测得的 A 405 nm在 110 左
右的血清稀释度作为工作浓度。用 10 %甲醇将
TAX 稀释为 100、50、25、1215、61125μg/ mL 的系
列浓度。免疫反应板经 1μg/ mL TA X2HSA 包被 ,
5 % SPBS 封闭后 ,加入不同浓度的 TA X 溶液及抗
血清各 50μL ,混匀后于 37 ℃孵育 1 h。其余步骤
同 11412。空白对照为 10 %甲醇 50μL 加 PBS 50
·6401· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
μL 。依据 A 405 nm的变化判断是否发生竞争反应。
2 　结果
211 　TA X2BSA 人工抗原的合成产率 :冻干后的
TA X2BSA 复合物质量为 218 mg ,产物和反应物的
质量比约为 62 %。这一结果与人工抗原的通常合
成产率基本类似[ 8 ] 。
212 　TAX2BSA 人工抗原的 MALDI2TOF2MS 鉴
定 :图 1 为 TA X2BSA 的质谱图 ,可见 TA X2BSA 的
相对分子质量分别为70 940。BSA 的相对分子质量
为66 430 ,因而连接上的 72木糖基紫杉醇总量为
4 500。72木糖基紫杉醇的相对分子质量是 986 ,因
而 , TAX2BSA 复合物中 ,每个载体蛋白 BSA 分子
上偶联约 4～ 5 个 72木糖基紫杉醇分子 (4 500/
986≈415) 。以此人工抗原免疫小鼠 ,成功取得了针
对 TA X 的抗血清。
图 1 　TAX2BSA的基质辅助激光解吸飞行时间质谱图
Fig11 　Mass spectra of TAX2BSA determined
by MALDI2TOF mass spectrometry
213 　抗血清的效价及特异性分析 :两份抗血清由于
小鼠的个体差异 ,效价各不相同。图 2 显示了用
EL ISA 法测定 2 号小鼠的抗体效价的结果。空白
对照的 A 405 nm值为 01108 ; P/ N > 2 (即结果为阳性)
的血清最大稀释倍率为3 200。由此可知 ,抗血清效
价为 1 ∶3 200。
血清稀释 800 倍时 ,间接 EL ISA 测得的 A 405 nm
为 01850 ,以此稀释度的血清作为竞争 EL ISA 的工
作浓度。TAX 对 TAX2HSA 与抗血清结合的竞争
结果如图 3 所示。竞争 EL ISA 结果显示 A 405 nm随
着 TA X 竞争质量浓度的增加而减少 ,说明小鼠的
抗血清具有 TAX 特异性。
由间接及竞争 EL ISA 法结果可知抗血清的抗
体水平较高 ,特异性较好 ,从而说明了本实验合成的
人工抗原 TAX2BSA 具有良好的免疫原性 ,可作为
免疫原应用于单克隆抗体制备。
3 　讨论
TA X 相对分子质量 ( Mr) 较小 ,为不能直接引
发免疫反应的半抗原 ,必须和大分子的载体蛋白如
BSA、KL H 等偶联之后构成完全人工抗原 ,才能应
用于免疫操作。TA X 分子结构中 ,不存在可与蛋白
载体结合的基团 ,通常必须先在合适位置联接适当
的架桥剂 ,通过架桥剂 ,才能与载体蛋白偶联。架桥
剂一般是含酸基或氨基 ,具有适当碳链长度的化合
物。文献曾报道 ,在 TAX 分子 72位连接琥珀酰基 ,
用碳化二亚胺 ( EDC)法合成了完全抗原[9 ] 。此方法
首先需合成 2′2O2叔丁基二甲氨基硅烷基紫杉醇
[2′2O2(tert2butyldimet hylsily) taxol ] ,然后将其溶
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解于 N , N2二甲氧基甲酰胺中 ,再加入琥珀酸酐及
二甲氨基吡啶反应 ,经过一系列处理、纯化等过程 ,
才能得到 72琥珀酰基紫杉醇 ,操作相当繁琐而费
时。在本实验中 ,选用了 72木糖基紫杉醇 ,这是一
种天然存在的紫杉醇衍生物 ,市场有商品供应 ,可直
接利用高碘酸氧化法 ,将其与载体蛋白联接。此方
法较前述文献方法省略了衍生物合成步骤 ,更加简
便易行 ,且具有较高的合成效率 (在每个 BSA 分子
上可成功联接约 4～5 个 72木糖基 TAX 分子) 。
制备单克隆抗体使用的实验动物可为家兔或小
鼠。日本九州大学正山和田中实验室获得了近 40
种针对生药中生理活性成分的单克隆抗体 ,建立了
酶联免疫吸附反应检测法 ,几乎全部是使用 BALB/
c 小鼠作为免疫对象[7 ,10 ] 。本实验使用两只小鼠 ,均
产生了明显的免疫反应 ;但由于动物个体差异 ,抗血
清效价也有所不同。测得效价较高的小鼠抗血清效
价为 1 ∶3 200 ,竞争 EL ISA 结果显示抗血清能够特
异性识别游离 TAX ,证明了合成的人工抗原 TA X2
BSA 有较好的免疫原性 ,可为 TAX 的单克隆抗体
的制备及后续应用提供技术基础 (抗体的交叉反应
性一般于单克隆抗体制备过程中检测) 。
本实验使用 MALDI2TO F2MS 法测定了 TA X2
BSA 中结合的半抗原 TA X 分子数目。与传统的鉴
定方法 (紫外光谱扫描法、标记抗原示踪法和凝胶电
泳等)相比 ,该技术具有高灵敏度 ,供试品用量少 ,结
果直观、准确[ 11 ] ,是比较理想的抗原复合物中半抗
原数目的测定方法。
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三种海龙中甾醇类成分的 GC2MS分析
陶 　莉1 ,王有为2 3
(11 浙江海洋学院食品与药学学院、医学院 ,浙江 舟山 　316004 ; 21 武汉大学药学院 ,湖北 武汉 　430072)
　　海龙为我国常用名贵中药材 ,其性温 ,味甘 ,归
肝肾经 ,具温肾壮阳、散结消肿之功效。用于阳痿遗
精 ,瘰疬痰核 ,跌扑损伤等症[ 1 ] 。《本草纲目拾遗》记
载 ,海龙功同海马而力倍之[2 ] 。《中国药典》历版均
收载海龙 ,并确定来源为海龙科动物刁海龙 S o2
lenognat hus hardw icki i ( Gray ) 、拟 海 龙 S y n2
gnat hoi des bi aculeat us ( Bloch ) 和尖海龙 S y n2
gnat hus acus Linnaeus 的干燥体。现代研究表明 ,
海龙含有大量甾醇类[ 3 ] 、脂肪酸[ 4 ] 、蛋白质[ 5 ] 等成
分 ,具有抗肿瘤[6 ] 、激素样[7 ]等药理作用。本实验通
过对 3 种海龙中甾醇类成分的 GC2MS 测定 ,比较
分析了 3 种海龙的甾醇类成分。
1 　仪器和材料
111 　实验材料 : 3 种海龙均购自河北安国药材市
场 ,经浙江海洋学院赵盛龙教授分别鉴定为刁海龙
S olenognat hus hardw icki i ( Gray) 、拟海龙 S y n2
gnat hoi des bi aculeat us ( Bloch ) 、尖 海 龙 S y n2
gnat hus acus Linnaeus。药材晾晒干燥后粉碎 ,过
·8401· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
3 收稿日期 :2008212202　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :浙江省卫生厅中医药青年基金项目研究计划 (2005 Y011)
作者简介 :陶　莉 (1980 —) ,女 ,湖北襄樊人 ,讲师 ,研究方向为天然药物化学。