全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 2期·研究报告·
收稿日期：2008-07-10
基金项目：国家 863 计划项目 （2006AA10Z323，2007AA09Z406），上海市科委 “登山行动计划 ”项目 （06dz12015），上海市教委重点项目
（07ZZ135），上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金（科 07-13），上海市重点学科建设项目（Y1101）
作者简介：蔡春尔（1980-），男，硕士，助教，研究方向：海洋生物技术；E-mail：cecai@shou.edu.cn
通讯作者：何培民，男，教授，E-mail：pmhe@shou.edu.cn
藻胆蛋白 （phycobiliprotein）为藻类吸收 、传递
光能的天线色素 ，存在于蓝细菌（原核蓝绿藻），藻
红植物（真核红藻），隐滴虫（双鞭毛单细胞真核藻）
和蓝色小体（内共生类质体细胞器）中 [1]。 包括藻红
蛋白 （phycoerythrin，PE）、藻蓝蛋白 （phycocyanin，
PC）、别藻蓝蛋白（allo- phycocyanin，APC）和藻红蓝
蛋白 （phycoerythrocyanin，PEC）（Bryant et al. 1979）。
藻胆蛋白可作为新型的荧光标记探针， 在抗肿瘤，
抗病毒，抗动脉硬化，抗紫外线，以及食品、饮料添
加剂，纺织品、洗涤剂染色剂，植物生长调节剂等多
方面的用途，甚至在光学信息存储与处理 ，快速光
电探测、人工神经网络等方面也具有潜在的应用前
景，但是高纯度的藻胆蛋白价格相当昂贵 [2]。
紫菜属于红藻门（Rhodophyta）、原红藻纲（Prot-
oflorideophyceae）、红毛菜科 （Bangiaceae）、紫菜属
（Porphyra），是我国最主要的栽培藻类之一，含有丰
富的藻胆蛋白 [3]。
藻胆蛋白的制备方法依不同植物来源而各有
差异，通用的步骤包含蛋白释放、粗提和纯化。纯化
主要通过色谱柱 ，因其成本高 ，流程周期长 ，产量
条斑紫菜藻胆蛋白提纯方法优化探索
蔡春尔 周铭 李春霞 柳俊秀 汪卿 何培民
（上海海洋大学水产与生命学院海洋生物系，上海 200090）
摘 要： 采用溶胀法与组织捣碎法相结合的紫菜叶状体细胞破碎方法，研究了不同物液比、缓冲液浸泡时间和硫
酸氨盐析次数对藻胆蛋白纯度和产率的影响，对比了各种羟基磷灰石的层析效果，并对所得藻红蛋白和藻蓝蛋白做了吸
收光谱、荧光发射光谱和SDS-PAGE鉴定。结果表明，在物液比为1∶5，浸泡时间为36h时，紫菜综合破碎效果最佳；经
过4次硫酸氨盐析后，藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度最高，分别达到1.71和0.98，采用Siegelman的方法制备的羟基磷灰石
一次层析所得藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度最高，分别达到4.73和4.42，产率分别为0.144％和0.042％，且光谱和电泳鉴定
结果均达到商品化要求。
关键词： 条斑紫菜 藻红蛋白 藻蓝蛋白 硫酸氨盐析 羟基磷灰石
Optimization of Method for Phycobiliprotein Extraction and
Purification from Porphyra yezoensis
Cai Chuner Zhou Min Li Chunxia Liu Junxiu Wang Qing He Peimin
（Department of Marine Biology，College of Fisheries and Life，Shanghai Ocean University，Shanghai 200090）
Abstract： The crude extract of phycobiliproteins was prepared from thallus ofPorphyra yezoensis with
combination of dissolving-bulg ng and tissue-homo enator methods. Effects of solvent volume，treating time，ammonium
sulphate precipitation time，and hydroxylapatite（HA）chromatography on purity and yield of phycobiliprotein were studied.
The results showed that the optimum conditions for purification，including the ratio of thallus to buffer（1：5），treatment
with dissolving-bulging，precipitation with ammonium sulphate for four times，all of which increased the purity of
phycoerythrin and phycocyanin up to 1.71 and 0.98，respectively. Due to HAP chromatography according to Siegelman，
the phycoerythrin and phycocyanin purity increased to 4.73 and 4.42，with the yield of 0.144% and 0.042%.
Key words： Porphyra yezoensis Phycoerythrin Phycocyanin Ammonium sulphate precipitation Hydroxylapatite
2009年第 2期
低，是高纯度藻胆蛋白制备的瓶颈，目前国内报道
的最新方法是牛建峰等 [4]采用的膨化柱法。
本试验拟从提高条斑紫菜藻胆蛋白粗提效果，
减轻对后期纯化压力的角度，来探讨规模化制备高
纯度藻胆蛋白的途径。
1 材料和方法
1.1 材料
条斑紫菜 （Porphyra yezoensis） 叶状体于 2007
年 3 月采自江苏省吕泗紫菜栽培海区。藻体用清洁
海水洗净，10℃下阴干后，密封置于-20℃冰箱保存
备用。
1.2 药品和试剂
Sephadex G-25，GE 公司生产；羟基磷灰石，国药
集团生产；其他试剂为分析纯。
1.3 仪器
高速冷冻离心机（Supra 22k，Hanil Science），蛋
白质层析仪 （DuoFlow，Biologic）， 紫外分光光度计
（Ultrospec2000，Pharmacia Biotech），电泳仪（EPS601，
Amersham Biosciences）， 荧光分光光度计 （F-4500，
Hitachi）。
1.4 方法
1.4.1 不同物液比粗提 称取 4 份冻干紫菜，剪碎，
分别加 50 mmol/l 磷酸钠缓冲液（pH6.8，含 1 mmol/
lEDTA）至物液比 （g/ml）为 1 ∶40，1 ∶20，1 ∶10，1 ∶5，静
置过夜，捣碎，4℃下 10 000 r/min 离心 15 min，测上
清吸光值（图 1）。 每一物液比设 3 个平行样。
1.4.2 不同浸泡时间粗提 制备物液比 1 ∶5 紫菜
浸泡液若干份 ，每隔 24 h 捣碎 1 份 ，离心 20 min，
测上清吸光值。 每一时间段设 3 个平行样。
1.4.3 硫酸铵盐析粗提条斑紫菜藻胆蛋白 制备
物液比 1∶5，浸泡 36h 的紫菜捣碎离心液 3 份。 第 1
份加硫酸铵至 20%饱和度，调 pH 至 6.8（下同），静
置 8 h，离心 20 min，将上清续加至 50%终饱和度，
8 h 后离心，沉淀用适量磷酸钠缓冲液溶解。将两次
盐析得到的粗提液忽略自身所带盐分，再加硫酸铵
至 10%饱和度，8 h 后离心， 将上清续加至 40%终
饱和度，8 h 后离心， 沉淀用适量磷酸钠缓冲液溶
解。第 2 份省略 20%盐析，第 3 份省略 20%，10%盐
析，其余操作同第 1 份溶液。每一步骤测定吸光值。
1.4.4 羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HAP）填料层析
条斑紫菜藻胆蛋白 HAP 制备方法 1 参照 Siegel-
man 等 [7]，所得沉淀记为 I。 HAP 制备方法 2 参照
Niu 等 [4]，所产生沉淀记为Ⅱ。 在方法 2 中，边搅拌
边以 5 ml/min 的速度同时滴加 0.55 L 2 mol/L
KH2PO4 和 0.5 L 2 mol/L CaCl2 溶液，所产生沉淀记
为Ⅲ，上清用 2 mol/L KOH 调 pH 至大于 9，所产生
沉淀记为Ⅳ。 国药集团 HAP（已反复使用和再生 3
次）作为对比。 5 种填料均洗涤平衡至使用。将 4 次
盐析后的溶液①（图 1）在 4℃下 15 000 r/min 离心
35 min，上清超滤，脱盐。 取 5 种沉淀分别与等体积
脱盐液混合，灌柱，用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集
洗脱峰，测吸光值。
1.4.5 藻胆蛋白性质测定 层析所得高纯度藻红
蛋白和藻蓝蛋白扫描吸收光谱和荧光发射光谱，做
SDS-PAGE 时，分离胶浓度为 14％，浓缩胶 5％。
1.4.6 蛋白纯度与含量计算方法 藻胆蛋白吸收
光谱纯度计算参考 Siegelman 等 [7]的方法，藻胆蛋白
含量计算参考高洪峰等 [8]的方法，总蛋白含量计算
参考 Schleif 等 [9]的方法。
2 结果
2.1 浸泡物液比对藻胆蛋白提纯的影响
图 2 为不同浸泡物液比对藻红蛋白和藻蓝蛋
白粗提的纯度和产率的影响。可以看出两种蛋白的
图 1 藻胆蛋白初提步骤优化研究示意图
蔡春尔等：条斑紫菜藻胆蛋白提纯方法优化探索 99
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
变化趋势一致，纯度曲线变化平缓，在物液比为 1∶5
时分别为最高，分别达到 0.454（PE）和 0.251（PC），而
2者的产率在 1∶40时明显高于其他物液比的结果，物
液比为 1∶5时分别高出 22.0%（PE）和 16.5％（PC）。
2.2 浸泡时间对藻胆蛋白提纯的影响
图 3 为不同浸泡时间对藻红蛋白和藻蓝蛋白
粗提的纯度和产率的影响。 可以看出，两种蛋白的
变化趋势一致，纯度在 36 h 和 60 h 基本相同，产率
为后者比前者降低 4.0％（PE）和 2.3％（PC）。
2.3 硫酸铵盐析次数对条斑紫菜藻胆蛋白粗提
影响
从图 4 可以看出，20％的盐析对藻红蛋白的纯
度没有显著的提升，但溶液①中藻红蛋白的最终纯
度显著高于溶液②，溶液②高于只经过 2 次盐析的
溶液③，藻蓝蛋白的纯度变化趋势与藻红相近（图
5）。 从藻胆蛋白占总蛋白含量 （表 1） 也可看出，
40％盐析后的溶液①中藻红和藻蓝含量比溶液②
分别高出 19.7％和 19.1％， 均为原先破碎液的 2.5
倍。而其产率分别是溶液②的 92.1％（PE）和 91.5％
（PC），是溶液③的 84.4％（PE）和 88.3％（PC）（图 6，
图 7）。
2.4 不同羟基磷灰石填料对条斑紫菜藻胆蛋白
的层析效果
从表 2 看出，沉淀Ⅰ填料层析效果最好 ，能分
离出纯度在 4.5 左右的藻红蛋白和藻蓝蛋白，沉淀
Ⅱ和Ⅲ 两种填料基本没有分离效果。 沉淀Ⅳ填料
能使两种蛋白纯度达到及超过 3.2， 国药集团的羟
基磷灰石一次层析能分离到 3.2 纯度的藻红蛋白。
物液比 （g/ml）
图 2 物液比对藻胆蛋白初提的影响
图 3 浸泡时间对藻胆蛋白初提的影响
图 4 硫酸铵盐析次数对藻红蛋白（PE）粗提纯度的影响
图 5 硫酸铵盐析次数对藻蓝蛋白（PC）粗提纯度的影响
表 1 硫酸铵盐析过程中藻胆蛋白占总蛋白含量
图 6 硫酸铵盐析次数对藻红蛋白（PE）粗提产率的影响
浸泡时间 （h）
12 36 60





20% 


50% 
 

10% 
 

40% 
 

 7.25 13.83 14.33 17.29
 - 12.07 13.63 14.44


 ! "
7.03
- 11.64 - 13.40
 5.75 10.99 11.75 14.56
 - 9.60 11.35 12.22
#

 ! "
5.82
- 9.52 - 10.78

100
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2.5 藻胆蛋白性质测定
表 2 中纯度为 4.73 的藻红蛋白和纯度为 4.42
的藻蓝蛋白吸收光谱如图 8、图 9，可以看到，藻红
蛋白在 498 nm 和 565 nm 各有一个吸收峰，最大吸
收峰为 565 nm，在 540 nm 有一个吸收肩，而藻蓝蛋
白的吸收峰位于 615 nm，无吸收肩。 图 11、图 12 是
该两种藻胆蛋白的荧光发射光谱，可以看出 ，藻红
蛋白荧光发射峰在 575~580 nm 之间， 藻蓝蛋白荧
光发射峰在 642 nm 左右。
3 讨论
虽然在物液比 1∶40 时两种蛋白的产率显著增
高，但在实际应用时并非最佳选择。例如，以藻红蛋
白产率 0.836％ （图 2） 计算 ，500 g 紫菜可释放得
4.18 g 藻红蛋白 ， 若以 1 ∶5 物液比的藻红产率
（0.685％）获得同样量蛋白需紫菜 610 g。 粗提后期
需要消耗硫酸氨，610 g 紫菜按 1∶5 需缓冲液 3.05 L，
图 7 硫酸铵盐析次数对藻蓝蛋白（PC）粗提产率的影响

  PE PC PE PC
 1 mM 1.76 4.42 -
0.042
10 mM 1.77 3.52 0.101
10 mM 4.73 0.49 0.144
20 mM 3.70 0.37 0.111
 1 mM 1.70 3.59 0.265
10 mM 3.19 0.42 0.340 0.051
 1 mM 2.02 1.18 0.473 0.432
 1 mM 1.71 1.01 0.506 0.445
 10 mM 3.20 0.73 0.321

表 2 羟基磷灰石填料对条斑紫菜藻胆蛋白的层析效果
* 纯度≧3.20 的藻红或藻蓝蛋白不计算另一蛋白产率 ；
**10 mM 浓度先后洗下部分藻蓝和藻红蛋白
图 8 藻红蛋白层析液吸收光谱
图 9 藻蓝蛋白层析液吸收光谱
图 10 藻红和藻蓝蛋白层析液 SDS-PAGE
图 11 藻红蛋白荧光发射光谱
图 12 藻蓝蛋白荧光发射光谱
蔡春尔等：条斑紫菜藻胆蛋白提纯方法优化探索 101
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
经过 3 次盐析 [5]只需消耗硫酸氨约 1 kg，而 500 g
紫菜按 1∶40 需缓冲液 20 L， 经过 3 次盐析需消耗
硫酸氨约 5 kg，比前者多 4 kg，1∶5 的物液比相对于
其它在成本核算和纯度上均有一定优势。浸泡 60 h
后的紫菜所得两种蛋白与 36 h 相比纯度不变 ，产
率有下降趋势，可能是由于蛋白随时间增加有所降
解，而工艺流程的优化也需要时间尽量缩短。因此，
36 h 浸泡时间是个理想选择。粗提后期主要为了提
高目标蛋白的含量， 尽量减轻纯化过程的压力。 4
次盐析的藻胆蛋白纯度效果最为明显，且与其它 2
种盐析过程相比并不增加硫酸氨和缓冲液的消耗，
甚至达到了马海乐 [10]在用 DEAE-52 填料层析后获
得的纯度（1.74）。 而两种蛋白的产率虽然因盐析次
数的增加而比溶液②、③更低，但损失的成本不大。
因此，溶液①的盐析流程更可取。 两种藻胆蛋白的
纯度上升呈阶梯型， 而产率下降趋势并不与之对
应，这有待进一步研究。
按照 Niu 等 [4]报导方法制备层析藻胆蛋白的羟
基磷灰石时， 发现加 KOH 前生成的颗粒为白色细
纱状， 加 KOH 后其与上层溶液反应生成雪花状悬
浮物，故将这两种固体分开。 同时又按原方法做一
完整填料，即将上述两种固体的混合，层析结果显
示完整填料具一定的层析效果，而中间产物几乎没
有效果。 国药集团羟基磷灰石在反复使用和再生 3
次后仍能分离出达到一定纯度标准的藻红蛋白 [11]，
效果较好，但其价格昂贵，不适合大量使用。本试验
结果显示采用 Siegelman 方法制备的羟基磷灰石一
次层析就能获得高纯度的藻胆蛋白，藻红蛋白的产
率和纯度均已超过目前文献报导的最好效果。
盐析与疏水层析的原理相似，都是蛋白质分子
在高盐环境下构想改变，疏水基团发生非共价聚合
而与其他亲水分子分离，多次盐析效果类似于多次
疏水层析， 而超滤和脱盐去除了过大和过小的分
子，效果类似于两次凝胶过滤层析 ，高纯度藻胆蛋
白的制备只需过一次羟基磷灰石层析，也得益于上
述粗提操作。
曾繁杰 [12]曾报道条斑紫菜藻红蛋白为双峰型
（498 nm 和 565 nm）吸收光谱 ；普毓明 [13]曾报道坛
紫菜藻蓝蛋白吸收峰位于 615 nm；伍华菊等 [14]报道
条斑紫菜 R-藻红蛋白 SDS-PAGE 测定的 α，β 和 γ
亚基分子量（kD）分别为 17.0、18.0 和 31.7；张建平
等 [15]报道多管藻藻蓝蛋白 SDS-PAGE 测定的 α，β
亚基分子量（kD）分别为 18.1 和 20.5。 Grabowski [16]
的报道，R-藻红蛋白特征荧光发射峰在 576 nm，C-
藻蓝蛋白特征荧光发射峰在 630~642 nm 之间 ，本
试验结果与上述一致。
本试验所得结果优化了条斑紫菜藻胆蛋白提
取流程， 向规模化制备高纯度藻胆蛋白迈进了一
步。
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