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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
缘管浒苔 Rubisco酶大亚基基因编码序列
rbcL克隆及分析
尹顺吉　应成琦　汤文仲　张婷　何建华　何培民
(上海海洋大学水产与生命学院　农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室 ,上海 201306)
　　摘 　要 : 　主要对缘管浒苔光合作用第一关键酶 Rubisco大亚基基因 ( rbcL )进行了克隆分离。首先通过 PCR特异性扩
增叶绿体基因编码的缘管浒苔大亚基编码序列 rbcL部分基因序列 (1 035 bp)。依据基因步移原理 ,首次克隆得到缘管浒苔
rbcL 5′上游非翻译区序列 (224 bp)。据推测 , rbcL 5′上游非翻译区序列存在类似原核生物的启动子元件 - 10区 ( TAAAAT)
和 - 35区 ( TTGAAA)。此外 ,依据 3′2RACE ( cDNA末端快速扩增技术 )原理 ,克隆得到缘管浒苔 rbcL 3′末端 cDNA序列
(579 bp)。
关键词 : 　rbcL基因 　缘管浒苔 　基因步移 　启动子
Clon ing and Sequenc ing Analysis of the rbcL Gene
from U lva linza
Yin Shunji　Ying Chengqi　Tang Wenzhong　Zhang Ting　He J ianhua　He Peim in
( Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources & Aquacultural Ecology, Certificated by M inistry of Agriculture,
Aquaculture and L ife College, Shanghai Ocean University, Shanghai　201306)
　　Abs trac t: 　 In this paper, the sequence of Rubisco, the first key enzyme of photosynthesis in U lva linza, was cloned1Firstly, the se2
quence of the chromosomally encoded Rubisco large subunit gene ( rbcL ) of U lva linza was cloned (1 035 bp) 1According to gene walking
method, U lva linza rbcL 5′2untranslated region was cloned for the first time (224 bp) 1The sequence was p redicted to have 10 box( TAT2
TAA) and ∃ 35 box ( TTGAAA ) sim ilar to p rokaryotic p romoter motif1 In addition, 3′2end of rbcL cDNA ( 579 bp ) was cloned by 3′2
RACE ( rap id amp lification of cDNA ends) 1
Key wo rds: 　rbcL gene　U lva linza　Gene walking　Promoter
收稿日期 : 2009205220
基金项目 :国家自然科学基金 (30371101) ,教育部博士点基金 ,上海市教委优势 (重点 )学科资助项目 ( S30701)
作者简介 :尹顺吉 (19812) ,女 ,山东人 ,硕士 ,研究方向 :海洋生物学 ; E2mail: cecai@ shou. edu. cn
通讯作者 :何培民 , E2mail: pmhe@ shou1edu1cn　　在缘管浒苔中 , Rubisco大亚基由叶绿体基因rbcL编码 ,小亚基由核基因 rbcS编码。迄今为止 ,已经从光合细菌、藻类、苔藓、蕨类、裸子植物及被子植物的某些现存种和化石标本中等多种不同材料中测定了 rbcL 基因的全序列 ,构成了这一基因核苷酸序列数据库。这不仅促进了有关 rbcL基因的结构与功能表达与调控方面的深入研究 ,而且也为从分子水平上揭示植物之间的亲缘关系和研究进化的本质提供了有用的材料 [ 1～3 ]。在绿藻中 ,已得到 Pseudendoclonium akinetum , Scenedesm us obliquus, O ltm annsiellopsis virid is, Ch lam ydom onas reinha rd tii,N ephroselm is olivacea和 Chlorella vu lga ris的叶绿体基因全序列 , 而且在 Chlorella pyrenoidosa, D unaliellatertiolecta和 Tetraselm is suecica中也得到了编码 rbcL基因的全长序列。但目前对于绿藻 rbcL 基因的启动子元件分析还较少。利用 rbcL基因的核苷酸序列数据 ,在分子水平上进行植物系统学问题研究 , 具有多方面优越性 [ 2～4 ]。本研究首先通过 PCR特异性扩增缘管浒苔 rbcL部分基因序列。依据基因步移原理 ,根据已
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2009年第 10期 尹顺吉等 :缘管浒苔 Rubisco酶大亚基基因编码序列 rbcL克隆及分析
知 rbcL基因序列在其 5′附近设计 2个反向引物 ,首
次克隆得到缘管浒苔 rbcL 5′上游非翻译区序列 ,
并分析可能存在的启动子调控元件。此外 ,利用
cDNA末端快速扩增技术 ,克隆 3′末端 cDNA序列。
这些都为了进一步深入研究藻类 rbcL 基因奠定了
基础 ,也初步尝试从基因角度上分析浒苔快速生长
所具有的分子生物学基础。
1　材料与方法
111　藻类培养
藻类缘管浒苔 (U lva linza )采自江苏如东吕泗
海区 ,培养方法参考文献 [ 5 ]。挑选新鲜、生长旺盛
的藻体 ,用无菌海水和灭菌毛笔刷拭藻体以去除杂
质和杂藻 ,单株分离培养藻体。藻体于加入 VES培
养液的三角瓶中 , 16℃充气培养。保持其生长条件于
光周期 12L∶12D,光强 40μmol/m·s,每隔 4～6 d更
换新鲜培养基。
112　缘管浒苔 DNA的提取
取新鲜藻体 ,用液氮充分研磨成粉状。分装于
115 m l 管中 , 加入 015 m l 裂解液 ( 10 mM Tris
pH810; 015% SDS; 100μg蛋白酶 K) ,剧烈摇动 ,
55℃温育过夜。每管中加入 8215μl 5 M NaCl和
8215 μl CTAB / NaCl ( 10% /017 M ) , 56℃加 热
15 m in。加 1倍体积 25∶24∶1苯酚 /氯仿 /异戊醇抽
提 2次 ,取上清 ,加入 1倍体积的氯仿抽提 1次 ,取
上清。加入预冷的异丙醇沉淀 DNA,用 75%乙醇洗
沉淀并干燥 ,溶于 50μl无菌水中。
113　缘管浒苔 RNA的提取
缘管浒苔总 RNA的提取采用 Trizol RNA提取
试剂盒 ,提取方法按照其说明书进行。收集一定量
新鲜旺盛生长的藻体 ,用液氮快速充分研磨成粉状
后迅速提取缘管浒苔总 RNA。得到的总 RNA溶于
经 DEPC处理的水中 ,放入 - 70℃冰箱保存 [ 9 ]。
114　缘管浒苔 rbcL部分基因的克隆
以缘管浒苔基因组 DNA为模版 , PCR克隆缘管
浒苔 rbcL部分基因 ,引物由上海生工生物工程技术
服务有限公司合成。酶及配套 PCR试剂购自天为
时代有限公司。
正向引物 : P1: 5′2GCTGCATTCCGTTTGACTCCT2
CAACCAGG23′
反向引物 : P2: 5′2GTGAATACCACCTGAAGCTA2
CAGG23′
反应体系 : 50μl,包括 Taq ( 5 U /μl) 015μl, 10
×buffer 5μl, dNTP M ixture (各 215 mM ) 4μl,基因
组 DNA 1μg, P1 (20μM ) 1μl, P1 ( 20μM ) 1μl,补
灭菌蒸馏水至 50μl。PCR条件 : 94℃预变性 3 m in,
94℃30 s, 57℃ 115 m in, 72℃1 m in,共进行 30个循
环 , 72℃充分延伸 5 m in。
115　rbcL 5′端上游序列基因克隆
采用限制性内切酶 X ba I、H ind III、EcoR I、Pst I
4种内切酶分别对缘管浒苔基因组 DNA酶切。根
据基因步移 ( gene walking)技术原理 ,使用 TaKaRa
LA PCR in vitro Cloning Kit,根据已知缘管浒苔 rbcL
部分基因序列在其 5′端附近设计 2个反向引物。
R bcLR1: 5′2AACCATCAGTCCATACAGTTG23′
R bcLR2: 5′2CAGTCCATACAGTTGTCCAAG23′
选取 X ba I酶切基因组 DNA 所得体系 ,克隆
rbcL 5′端上游序列 , PCR产物经 TA克隆并测序。
116　rbcL 3′端下游序列 cDNA克隆
根据 3′2RACE原理 ,以缘管浒苔 RNA为模板 ,
使用 TaKaRa 3′2Full RACE Core Set,根据已知序列
在 rbcL 3′端设计 2个正向引物 ,克隆 rbcL 3′端 cDNA
末端片段 ,产物经 TA克隆并测序。
R bcL F1: 5′2GCTCATTTCTGTCGTGCTAGTG23′
RbcL F2: 5′2TGTCGTGCTAGTGGATTATTATTAC23′
2　结果与分析
211　缘管浒苔 rbcL部分基因的克隆与分析
以缘管浒苔基因组 DNA为模板 , PCR特异性扩
增 rbcL部分基因 ,得到的 PCR产物见图 1。经测序
分析 ,缘管浒苔 rbcL部分基因的克隆得到基因片段
大小为 1 035 bp,测序结果如图 2。
图 1　PCR扩增 rbcL 部分基因片段
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1 GCTGCATTCC　GTTTGACTCC　TCAACCAGGA　GTACCGGCAG　AAGAAGCAGG　TGCAGCTGTT
61 GCTGCTGAAT CATCAACAGG TACTTGGACA ACTGTATGGA CTGATGGTTT AACATCTTTA
121 GATCGTTATA AAGGTCGTTG TTACGACATT GAACCATTAG GAGAAGACGA CCAATATATT
181 GCTTATATTG CTTATCCTTT AGACTTATTT GAAGAAGGAT CAGTTACAAA CTTATTTACT
241 TCAATTGTAG GTAACGTTTT TGGTTTTAAA GCTTTACGTG CTTTACGTTT AGAAGATTTA
301 CGTATTCCAC CAGCTTATGT TAAAACATTC CAAGGTCCAC CGCATGGTAT TCAGGTTGAA
361 CGTGATAAAT TAAACAAATA TGGTCGTGGT TTATTAGGTT GTACGATTAA ACCAAAATTA
421 GGTCTTTCAG CTAAAAACTA TGGACGTGCT GTTTATGAAT GTTTACGAGG TGGTCTTGAT
481 TTTACAAAAG ACGATGAAAA CGTAAACTCA CAACCTTTCA TGCGTTGGCG TGACCGTTTC
541 TTATTTACTG CTGAAGCAAT TTACAAATCT CAATCTGAAA CTGGTGAGGT TAAAGGACAT
601 TACTTAAATG CAACTGCGGG TACATGTGAA GAAATGATGG AACGTGGTCA ATTTGCTAAA
661 GATTTAGGTG TTCCAATTAT TATGCATGAC TACATTACTG GTGGTTTTAC AGCTAACACT
721 TCATTAGCTC ATTTCTGTCG TGCTAGTGGA TTATTATTAC ATATTCACCG TGCTATGCAC
781 GCTGTTATTG ACCGTCAACG TAATCACGGT ATTCACTTCC GAGTATTAGC GAAAATTTTA
841 CGTATGTCAG GTGGTGATCA CTTACACTCA GGAACAGTAG TAGGTAAATT AGAAGGTGAA
901 CGTGAAATTA CTTTAGGTTT CGTTGACTTA ATGCGTGATG ATTACATTGA AAAAGATCGT
961 AGTCGTGGTA TTTACTTTAC ACAAGATTGG GTTAGTTTAC CAGGTACAAT GCCTGTAGCT
1021 TCAGGTGGTA TTCAC
图 2　缘管浒苔 rbcL 部分基因测序结果
212　rbcL 5′端上游序列基因克隆序列分析
采用限制性内切酶 X ba I、H ind III、EcoR I、Pst I
4种内切酶分别对缘管浒苔基因组 DNA酶切 ,见
图 3。由图 3可见基因组 DNA被 4种酶切为弥散
状 ,酶切较彻底 ,保证了后续试验的进行。
以基因组 DNA为模板 ,由 该 1 035 bp片段向
rbcL 5′端上游基因步移 ,克隆所得上游序列基因片
段与已知 rbcL 拼接 ,得到 1 370 bp 片段 ,结果如
图 4。 11Marker; 21EcoR I酶切 ; 31H indⅢ酶切 ; 41X ba I酶切 ; 51Pst I酶切
图 3　基因组 D NA经 4种酶切图谱
1 CTAGAAGGAT　TATAAGTTTG　TTGGGAGGAC　GTATTGTGCC　AAAACGGGAT　GCAATATGCC
61 AAAATTGATA CCTAATTGCA TTAATCTAAC TAATAATAGC CAATATAAAC CCTCTATATG
121 AATAAGTAT T　TGAAA
- 35序列
TGAAG CTTACATCTG GAAAATGGCA TAT TAAAAT
- 10序列
T TAATTATATT
181 TGGGCAGATC GAATGGTCAA TTTATTAAAT TTTAATTATT AAAA ATGGCT CCACAGACTG
241 AAACAAAAGC AGGTACTGGC TTTAAAGCTG GTGTAAAAGA TTACCGTTTA ACTTATTACA
301 CGCCTGATTA TCAAGTAGAA GATACTGATA TTTTAGCAGC GTTCCGTATG ACTCCTCAAC
361 CAGGAGTACC GGCAGAAGAA GCAGGTGCAG CTGTTGCTGC TGAATCATCA ACAGGTACTT
421 GGACAACTGT ATGGACTGAT GGTTTAACAT CTTTAGATCG TTATAAAGGT CGTTGTTACG
481 ACATTGAACC ATTAGGAGAA GACGACCAAT ATATTGCTTA TATTGCTTAT CCTTTAGACT
541 TATTTGAAGA AGGATCAGTT ACAAACTTAT TTACTTCAAT TGTAGGTAAC GTTTTTGGTT
601 TTAAAGCTTT ACGTGCTTTA CGTTTAGAAG ATTTACGTAT TCCACCAGCT TATGTTAAAA
661 CATTCCAAGG TCCACCGCAT GGTATTCAGG TTGAACGTGA TAAATTAAAC AAATATGGTC
721 GTGGTTTATT AGGTTGTACG ATTAAACCAA AATTAGGTCT TTCAGCTAAA AACTATGGAC
781 GTGCTGTTTA TGAATGTTTA CGAGGTGGTC TTGATTTTAC AAAAGACGAT GAAAACGTAA
841 ACTCACAACC TTTCATGCGT TGGCGTGACC GTTTCTTATT TACTGCTGAA GCAATTTACA
901 AATCTCAATC TGAAACTGGT GAGGTTAAAG GACATTACTT AAATGCAACT GCGGGTACAT
961 GTGAAGAAAT GATGGAACGT GGTCAATTTG CTAAAGATTT AGGTGTTCCA ATTATTATGC
1021 ATGACTACAT TACTGGTGGT TTTACAGCTA ACACTTCATT AGCTCATTTC TGTCGTGCTA
1081 GTGGATTATT ATTACATATT CACCGTGCTA TGCACGCTGT TATTGACCGT CAACGTAATC
1141 ACGGTATTCA CTTCCGAGTA TTAGCGAAAA TTTTACGTAT GTCAGGTGGT GATCACTTAC
1201 ACTCAGGAAC AGTAGTAGGT AAATTAGAAG GTGAACGTGA AATTACTTTA GGTTTCGTTG
1261 ACTTAATGCG TGATGATTAC ATTGAAAAAG ATCGTAGTCG TGGTATTTAC TTTACACAAG
1321 ATTGGGTTAG TTTACCAGGT ACAATGCCTG TAGCTTCAGG TGGTATTCAC
图 4　rbcL 5′端上游片段与已知 rbcL 片段拼接后测序结果
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2009年第 10期 尹顺吉等 :缘管浒苔 Rubisco酶大亚基基因编码序列 rbcL克隆及分析
　　分析 ORF,推断氨基酸序列 ,并与其他藻类
Rubisco酶大亚基氨基酸序列对比 ,确定翻译起始密
码子 ATG位置 (下划线表示 )。将起始密码子 ATG
上游 5′非翻译区 (224 bp)分析其中包括可能的启动
子元件位置。在起始密码子 ATG上游 - 55 bp ～ -
95 bp 的范围内有推测的启动子序列 , - 10 区为
TAAAAT (原核生物为 TATAAT) , - 35 区为 TT2 GAAA (原核生物为 TTGACA ) ,两者都不同程度的表现出类似原核生物相应启动子元件的结构特征。- 10区和 - 35区之间相隔 28 bp。213　 rbcL 3′末端 cDNA克隆3′2RACE克隆所得 3′端 cDNA序列 ( 579 bp ) ,如图 5所示。使用 UAA作为终止密码子。
1 TGTCGTGCTA　GTGGATTATT　ATTACATATT　CACCGTGCTA　TGCACGCTGT
51 TATTGACCGT CAACGTAATC ACGGTATTCA CTTCCGAGTA TTAGCGAAAA
101 TTTTACGTAT GTCAGGTGGT GATCACTTAC ACTCAGGAAC AGTAGTAGGT
151 AAATTAGAAG GTGAACGTGA AATTACTTTA GGTTTCGTTG ACTTAATGCG
201 TGATGATTAC ATTGAAAAAG ATCGTAGTCG TGGTATTTAC TTTACACAAG
251 ATTGGGTTAG TTTACCAGGT ACAATGCCTG TAGCTTCAGG TGGTATTCAC
301 GTTTGGCATA TGCCGGCATT AGTTGAAATT TTTGGTGACG ACGCATGTTT
351 ACAATTCGGT GGTGGTACAT TAGGACACCC TTGGGGTAAT GCTCCAGGAG
401 CCGCTGCAAA CCGTGTTGCT TTAGAAGCTT GTACACAAGC TCGAAACGAG
451 GGACGTGATT TAGCATCTGA AGGTGGTGAC GTAATTCGTG CTGCTTGTAA
501 ATGGAGTCCT GAATTAGCTG CAGCTTGTGA AGTATGGAAA GAAATTAAAT
551 TTGAATTTGA TGCTATTGAT ACATTA TAA
图 5　rbcL 3′末端 cD NA序列测序结果
214　缘管浒苔 Rubisco酶大亚基氨基酸序列推断
及分析
使用 PCR技术从缘管浒苔基因组 DNA中扩增
的部分 rbcL基因 (1 035 bp )与试验室之前由 cDNA
扩增的基因片段大小、序列均相同 ,表明这部分 rbcL
基因没有内含子。
拼接 rbcL 基因片段 , rbcL 5′端上游片段以及
rbcL 3′末端 cDNA序列 ,用以推算缘管浒苔 Rubisco
酶大亚基氨基酸顺序 ,得到含有 474个氨基酸的蛋
白序列 (图 6)。
MAPQTETKAGTGFKAGVKDYRLTYYTPDYQVEDTD ILAAFRMTPQPGVPAEEAGAAVAAES
STGTW TTVW TDGLTSLDRYKGRCYD IEPLGEDDQYIAYIAYPLDLFEEGSVTNLFTSIVGNVFG
FKALRALRLEDLR IPPAYVKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRGLLGCTIKPKLGLSAKNYGRAV
YECLRGGLDFTKDDENVNSQPFMRWRDRFLFTAEA IYKSQSETGEVKGHYLNATAGTCEEM
MERGQFAKDLGVP IIMHDYITGGFTANTSLAHFCRASGLLLH IHRAMHAV IDRQRNHGIHFRV
LAKILRMSGGDHLHSGTVVGKLEGERE ITLGFVDLMRDDYIEKDRSRGIYFTQDWVSLPGTMP
VASGGIHVWHMPALVE IFGDDACLQFGGGTLGHPW GNAPGAAANRVALEACTQARNEGRDL
ASEGGDV IRAACKW SPELAAACEVW KE IKFEFDA IDTL
图 6　Rub isco酶大亚基氨基酸序列推测结果
　　据推测氨基酸序列在线预测蛋白三级结构
( http: / / sw issmodel1expasy1org / ) ,结果见图 7。
3　讨论
尽管 DNA序列分析有潜力解决所有分类等级
的系统发育问题 ,但目前的绝大多数研究还是利用
叶绿体基因组中的 rbcL ,并用于远缘属间及科级以
上分类群的研究。利用 rbcL 基因的核苷酸序列数
据 ,在分子水平上进行植物系统学问题研究 ,具有多
方面优越性 [ 6～8 ]。
1905年提出叶绿体起源于原核生物的观点。
叶绿体有原核型的核糖体和 rRNA ,因此它们具有类
似的合成蛋白质机制 ,就转录周期的控制信号 ———
启动区和终止区而言 ,叶绿体基因的结构与原核生
物的非常接近。叶绿体基因作为一类兼有原核特性
的真核基因 ,其表达调控机制无疑是复杂的。已鉴
定了许多原核生物的启动区并进行了序列分析。有
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
12个高度保守的碱基对 ,每组 6个 ,即 - 35位点前
后的 TTGACA和 - 10位点前后的 TATAAT,两组间
有 15～21 bp的间隔序列 ,间隔序列越靠近 17 bp,
该启动区就越强。 - 35区附近富含 AT序列 ,被称
为识别位点 ,该区核苷酸保守性强 ,以 TTG的保守
性最强 ,这 3个碱基出现频率分别为 82%、84%、
79%。 - 10区又称“p ribnow”盒 ,有 4个碱基是高
度保守的 ,用大写字母表示为 TA tAaT,两个小写字
母代表的碱基保守性较弱 ,出现频率为 44%和
51% ,最后一个“T”视为不变的 T。叶绿体基因启
动区 - 35区与 - 10区间隔为 11～23 bp ,与原核
的 15～21 bp间隔序列相似 ,但二者位置是有差别
的 ,前者是在距离转录起始点上游 100～300 bp
处 ,说明叶绿体系统多聚酶 2启动区相互作用机制
不同于原核系统。单子叶 (玉米、小麦 )和双子叶
(菠菜 )植物的 rbcL基因 5′端有 85%的同源性 [ 9, 10 ]。
黄瑶等 (1994)分析了葡萄 rbcL基因启动子结构 ,并
比较了几种已测知高等植物 rbcL 基因的启动子元
件 (表 1)。
图 7　缘管浒苔 Rub isco大亚基蛋白三级结构预测
表 1　不同植物 rbcL 启动区核苷酸序列同源性比较
种名 rbcL启动区核苷酸序列
E1coli 　　　　　　　　 - 35box 　　　　　　 - 10box
　　　　　　 　tgTTGACA 　　　　　atttgt TATAATg
- 40 - 30 - 20 - 10 - 1
V itis vinifera TT3 GGG TTGCGC 3 ATACATATGACAGAGTA TAAAAT AATAATGTATTTGGCGAATTAAAT
Zea m ays 2 23 2 2 2 222222 T 2 2 2TC 2 2 2C 2A 22222 2 2 2C 2 2 2 2 2TG 222G2223 GGTG2 2 2C 2222
Hordeum vulgare 2 23 2 2 2 222222 T 2 2 2CC 2 2 2C 2A 22222 2 2 2C 2 2 2 2 2TG 222G2223 GGTA 2 2 2C 2222
Triticum aestivum 2 23 2 2 2 222222 T 2 2 2TC 2 2 2C 2A 22222 2 2 2C 2 2 2 2 2TT 222G2223 GGTA 2 2 2C 2222
Cenchrus setigerus 2 23 2 2 2 222222 T 2 2 2TC 2 2 2C 2A 22222 2 2 2C 2 2 2 2 2TG 222G2223 GGTG2 2 2C 2222
P isum sativum 2 23 2 2 2 222222 C 2 2 2CA 2 2 2G 2A 22222 2 2 2G 2 2 2 2 2TG 222T2223 CCCA 2 2 2C 2222
N icotiana tabacum 2 23 2 2 2 222222 T 2 2 2TA 2 2 2G 2A 22222 2 2 2C 2 2 2 2 2TG 222T2223 GGCA 2 2 2C 2222
Spinacia oleracea 2 23 2 2 2 222222 C 2 2 2TA 2 2 2G 2A 22222 2 2 2C 2 2 2 2 2TG 222T2223 GGCG2 2 2C 2222
Petunia hybrida 2 23 2 2 2 222222 T 2 2 2TA 2 2 2G 2A 22222 2 2 2C 2 2 2 2 2TG 222T222TGGCA 2 2 2C 2222
M edicago sativa 2 23 2 2 2 222222 C 2 2 2CA 2 2 2G 2A 22222 2 2 2G 2 2 2 2 2TG 222T222TGCCA 2 2 2C 2222
O ryza sativa 2 2G 2 2 2 222222 T 2 2 2TC 2 2 2T 2A 22222 2 2 2C 2 2 2 2 2AG 222G222TGGTG2 2 2C 2222
“3 ”号表示缺失的核苷酸 ,“2”表示同样的核苷酸 ,方框分别表示 - 35区和 - 10区的保守序列
　　将根据基因步移得到缘管浒苔 rbcL 基因起始
密码子 ATG上游 5′非翻译区 (224 bp )分析其中包
括可能的启动子元件位置。在起始密码子 ATG上
游 - 95～ - 58 bp的范围内有推测的启动子序列 , -
10区为 TATTAA (原核生物为 TATAAT) , - 35区为
TTGAAA (原核生物为 TTGACA ) ,两者都不同程度
的表现出类似原核生物相应启动子元件的结构特
征 ,与原核生物保守区相比仅相差 1～2个核苷酸。
- 10区和 - 35区之间相隔 28 bp。
叶绿体基因在密码子的使用上不同于线粒体 ,
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2009年第 10期 尹顺吉等 :缘管浒苔 Rubisco酶大亚基基因编码序列 rbcL克隆及分析
它能使用通用密码表上所有的密码子。但是 ,对水
稻和玉米的 rpl2基因的分析发现 ,它们的起始密码
子是 ACG而不是 ATG。ACG作为起始密码子曾经
在仙台病毒中报道过 ,体外试验证明它在原核生物
中也有起始功能。据分析 ,缘管浒苔 rbcL使用起始
密码子 ATG。
至于终止密码子及其旁侧序列 ,无论原核基因
还是真核基因 ,都有 3种终止密码子 (UGA , UAA,
UAG) ,并且三者的使用频率不同 ,以真核 mRNA 为
例 ,脊椎动物及单子叶植物中 UGA 的使用频率最
高 ,其它真核生物中主要使用 UAA, UAG的使用频
率最低。而紧挨终止密码子 3′端的核苷酸以 A、G
(真核 )或 U (原核 )出现频率较高。就水稻叶绿体
基因而言 ,终止密码子以 UAA使用频率最高 , UAG
及 UGA的出现频率大约各是前者的一半 ,而紧挨终
止密码子 3′端的核苷酸以 A、U最多 (两者出现频率
近乎相等 ) ,其次为 G, C的出现频率较低。或许 ,该
位核苷酸与终止作用的调控有关。叶绿体基因在核
苷酸使用上有偏向性 ,其密码子的第 3位往往是 A
或者 T(达 69% )。另外 ,基因的间隔区 ( Spacer)中
A、T含量也比较高 ,因而造成高等植物 cp DNA的
密度略高于核 DNA。缘管浒苔 rbcL使用 UAA作为
终止密码子。
高等植物叶绿体 DNA 的内含子主要在 tRNA
基因中发现 ,很少在蛋白质结构基因中发现 ,但在绿
藻中却发现大量的蛋白质结构基因也存在有内含
子。到目前为止 ,所有已被测序的高等植物 rbcL基
因都是连续的 ,即无内含子 ,长约 114 kb。到目前为
止 ,已在十几类植物中发现 rbcL基因存在 I型和 II
型启动子 [ 3, 4, 6, 7 ]。
使用 PCR技术从缘管浒苔基因组 DNA中扩增
的部分 rbcL基因 (1 035 bp )与试验室之前由 cDNA
中扩增的基因片段大小、序列均相同 ,表明这部分
rbcL基因没有内含子。此外 ,至今在高等植物中并
未发现 rbcL 基因中有内含子存在。虽然在其他绿
藻中已发现 rbcL基因中存在内含子 ,但我们认为在
缘管浒苔 rbcL 末端附近的一小段序列存在内含子
的可能性不大。
研究得到 3段序列拼接并推测蛋白氨基酸序
列 ,所得 474个氨基酸残基组成的蛋白序列与已知
的绿藻门中莱茵衣藻和小球藻 Rubisco酶大亚基有
475个氨基酸残基有基本吻合。
参 考 文 献
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