全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
DC-SIGN胞外区基因的克隆、蛋白表达及抗体制备
吕佰瑞 刘朝奇
(三峡大学分子生物学研究所,宜昌 443002)
摘 要: 旨在构建 DC-S IGN胞外区基因原核表达质粒,诱导蛋白表达并制备多克隆抗体。用 PCR的方法扩增编码 DC-
SIGN胞外区的基因序列,将其克隆到原核表达载体 pET-28a ( + )中,利用大肠杆菌表达系统表达 DC-SIGN胞外区蛋白, 用 H is
抗体做 W estern B lo tting鉴定目的蛋白的免疫原性。用纯化的 DC-SIGN胞外区蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通
过酶联免疫吸附试验 ( EL ISA )检测抗体效价, 免疫荧光法检测其特异性。结果显示, 原核表达载体 pET-28a( + )-DC-S IGN胞
外区基因成功构建, 可在大肠杆菌 BL21( DE3 )中高效表达, 获得相对分子质量约 20 kD的 DC-S IGN胞外区蛋白, 经 W estern
b lo tting鉴定为正确。纯化后的蛋白免疫大耳白兔, 制备的多克隆抗体具有较强免疫原性和特异性。本研究得到了纯化的
DC-S IGN胞外区蛋白, 并制备了具有特异性和高效价的抗体,为研究 DC-SIGN生物学功能提供试验基础。
关键词: DC-SIGN 蛋白表达 多克隆抗体 W este rn b lo tting 免疫荧光
Cloning, Expression and Antibody Preparation of
Extracellular Region of DC-SIGN
Lv Bairu i L iu Chaoqi
( Institute of M olecular and Biology, China Three GorgesUniversity, Yichang 443002)
Abstrac:t Th is study w as to construct expression p lasm id pET-28a( + ) /DC-SIGN ex tracellu la r dom ain and prepare its po ly clona l
antibody. The gene fragm ent o f extrace llular reg ion of DC-SIGN w as am plified by PCR and cloned into pET-28a ( + ) proka ryotic ex-
pressing vector. E. co li BL21( DE3) transform ed w ith pET-28a(+ )-DC-SIGN w as induced by IPTG and the expressed pro te in was de-
tected throughW este rn B lo tting. The pu rified prote in w as used to imm un ize rabb its to prepa re po ly clona l antibody. The titer and spec-i
fic ity o f rabb it ant-i se rum w ere assayed by EL ISA and imm unofluorescence assay. Resu lts showd tha tw e constructed pET-28a( + )-DC-
SIGN successfu lly. DC-SIGN prote in could be expressed in E. coli BL21( DE3) w ith high effic iency, and it was a kind o f 20 kD m o lec-
u lar w eigh t prote in. W e go t correc t respond ing antibody through imm un iz ing rabbit w ith the pur ified prote in. The po lyc lona l antibody
could comb ine purified pro te in w ith a h igh titer by EL ISA. Imm unofluorescence assay showed that the antibody could spec ifica lly b ind
to DC-SIGN expressed in eukaryotic cells. DC-S IGN extrace llular dom ain w as c loned and expressed in prokaryo tic cel.l The pur ified
prote in and its antibody cou ld prov ide the basis for study ing b io log ical functions of DC-SIGN.
Key words: DC-S IGN Expression pro tein Po ly clona l antibody W estern blotting Imm unofluorescence
收稿日期: 2010-07-05
作者简介:吕佰瑞,男,硕士研究生,研究方向: H IV病毒; E-m ai:l ba iru .i lv@ hotm ai.l com
通讯作者:刘朝奇,男,教授,博士,硕士生导师,研究方向: H IV病毒免疫学; E-m a i:l zq liu@ ctgu. ecu. cn
DC特异性细胞间黏附分子-3结合的非整合素
( dendr itic cell specific interce llular adhesion mo le-
cule3-grabb ing non integrin, DC-S IGN )是表达在 DC
细胞上的一种带有甘露糖结合位点的 C型凝集素
结构域的膜受体,其分子结构可分为胞浆区、跨膜区
和胞外区 3部分。DC-SIGN胞外区 ( DC-SIGN-ER )
在抗原的结合以及识别病原体并介导细胞之间的相
互接触等诸多方面有重要的作用 [ 2]。本研究通过
基因工程手段克隆 DC-S IGN胞外区基因、表达和纯
化 DC-SIGN胞外区蛋白,免疫日本大耳白兔制备多
克隆抗体, 为研究 DC-SIGN生物学功能奠定试验
基础。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
1 材料和方法
1. 1 材料
菌株 E. co li DH 5、E. coli BL21 ( DE3)、质粒
pET-28a(+ )、人肺癌细胞系 A549由本研究所保存。
限制性核酸内切酶、Taq DNA聚合酶, T4 DNA连接
酶为 Ferm entas公司产品。H is单抗、HRP标记的山
羊抗鼠 IgG、羊抗人 IgG和羊抗兔 IgG均购自北京中
杉金桥生物技术有限公司。RPM I-1640、胎牛血清、
脂质体购于 Inv itrogen, TMB、弗氏佐剂购于 S igma公
司。日本大耳白兔购自湖北省实验动物中心 (动物
合格证号: 00002964)。
1. 2 方法
1. 2. 1 pET-28a (+ )-DC-SIGN胞外区重组表达质
粒的构建与鉴定 以人 PBMC的 cDNA为模板, DC-
S IGN胞外区上游引物为 5-GGAATTCCATATGAAG-
GCTGCAGTGGGTGAG-3(下划线为 Nde酶切位点 ),下
游引物为 5-CCGAATTCCTACGCAGGAGGGGGGTTTG-
3(下划线为 E coR酶切位点 )。 PCR扩增程序:
94 变性 5m in, 94 30 s, 55 30 s, 72 30 s, 30
个循环; 72 5 m in结束扩增。用 Nd e和 E coR
分别双酶切 PCR产物 DC-SIGN胞外区和 pET-28a
(+ )原核表达载体。T4连接酶 16 过夜连接后,将
连接产物转入大肠杆菌 DH5中培养,挑取单克隆
提取质粒,酶切和测序鉴定。
1. 2. 2 DC-SIGN胞外区原核表达、蛋白纯化及鉴定
将重组质粒 pET-28a(+ )-DC-S IGN胞外区转化到
表达菌株 BL21( DE3)中, 挑取单克隆菌落培养,经
1 mmo l/L IPTG诱导表达 4 h, 离心收集菌体。将细
菌重悬于 Buffer B中 ( 8 mo l/L U rea, 0. 01mo l/L Tris-
HC ,l 0. 1mol /L N a2HPO4, pH8. 0) ,摇床放置 30m in,
1 2000 r /m in离心 20m in。将上清转到新的离心管
中,加 1%体积的 N -iNTA agarose杂交 2 h,转入玻璃
柱内, 用 pH6. 3、pH5. 9、pH4. 3的 Bu ffer B洗脱蛋
白。将得到的蛋白经梯度透析 (尿素浓度为 6、4、2、
1、0. 5mo l/L的 PBS)复性。复性的蛋白分装冻存于
- 80 。
1. 2. 3 DC-SIGN胞外区蛋白的W estern b lotting鉴
定 将纯化后的 DC-SIGN胞外区蛋白, 10% SDS-
PAGE电泳后转至 PVDF膜, 用含 5%脱脂奶粉的
TBST于 4 封闭过夜,去除封闭液, 用 TBST洗膜 3
次 ( 5 m in /次 ) , 加入 H is-Tag鼠源单克隆抗体 ( 1
3 000), 室温孵育 1 h。 TBST 洗膜 3次 ( 5 m in /
次 ) ,按 13 000加入辣根过氧化物酶 (HRP)标记的
山羊抗鼠 IgG, 室温孵育 1 h, TBST洗膜 3次 ( 5 m in /
次 )。加 ECL显影。
1. 2. 4 DC-SIGN胞外区蛋白多克隆抗体的制备
取纯化后的 DC-S IGN胞外区蛋白 500 L (约 500
g )加等体积弗氏完全佐剂, 超声混匀制成乳化
抗原, 达到油包水的状态。在日本大耳白兔脊柱
两侧进行皮内注射。于 2周、4周后分别用等量
蛋白 (约 500 g )加等体积弗氏不完全佐剂, 超
声乳化, 于脊柱两侧皮内注射进行加强免疫。 6
周后, 从耳缘静脉取血, 用 EL ISA检测血清抗体
效价。
1. 2. 5 兔血清抗体滴度的测定 ELISA法测定多
克隆抗体效价。用包被液缓冲液 ( pH9. 6, 0. 05
mo l/L碳酸盐缓冲液 ) 1 000倍稀释纯化后的 DC-
SIGN胞外区蛋白, 以 100 L /孔包被 EL ISA板,
4 过夜, PBST洗涤后用含 1% BSA的 PBS 37
封闭 1 h, PBST洗涤 3次, 加入兔抗血清 (稀释倍
数 1100- 1312 500)作为一抗, 同时用免疫前血
清做阴性对照, 37 作用 1 h, PBST洗涤 3次, 加入
HRP标记的山羊抗兔 IgG ( 120 000) , 37 作用
30 m in, PBST洗涤 3次; 每孔各加入 TMB 100 L
显色, 避光作用 10 m in, 加 50 L终止液 ( 2 mo l/L
H 2 SO 4 )终止反应。全波长酶标仪 = 450 nm 波长
处测吸光度值。
1. 2. 6 免疫荧光法测定 DC-S IGN胞外区蛋白的
表达 人肺癌细胞系 A549用正常 RPM I-1640
(含 10%小牛血清, 1%青霉素和链霉素 )培养基
常规培养。细胞密度为 1 105 /mL 分到 24孔板
中, 每孔 1 mL 通过脂质体将 pcDNA 4-DC-SIGN
胞外区质粒转染到 A549细胞中, 37 5% CO2培
养箱培养 48 h。用冰冷的 PBS洗 3次, 每次 5 m in。
用 20 g /L甲醛固定 10m in, PBS洗 3次,每次 5m in,
滴加 250倍稀释的兔抗血清 100 L, 37 孵育 1 h,
PBS洗 3次,每次 5m in。再加 250倍稀释罗丹明标
记的山羊抗兔 IgG抗体 100 L, 37 孵育 1 h,最后
滴加 DAPI 100 L, PBS洗 3次后荧光显微镜下
照相。
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2011年第 2期 吕佰瑞等: DC-SIGN胞外区基因的克隆、蛋白表达及抗体制备
2 结果
2. 1 重组质粒的构建及鉴定
以人 PBMC cDNA为模板, 设计 DC-SIGN胞外
区的引物,通过 PCR方法获得产物, 通过琼脂糖凝
胶电泳鉴定, 得到预期约 549 bp的 DC-SIGN胞外
区片段 (图 1 ) , 测序结果与 GenBank (登录号:
AF290886)报告的基因序列完全相符, 表明获得了
正确的 DC-SIGN 胞外区基因序列。用 Nde和
E coR进行双酶切鉴定, 切出预期大小的片段 (图
2) ,说明重组 pET-28a-DC-SIGN胞外区的质粒构建
正确。
M. DNA m arker 1000 bp ladd er; 1. DC-SIGN的 PCR产物;
2. DC-S IGN胞外区的 PCR产物
图 1 DC-SIGN PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
M. DNA markers; 1, 2. pET-28a( + )-DC-S IGN胞外区的酶
切产物
图 2 质粒 pET-28a(+ )-DC-SIGN双酶切鉴定结果
2. 2 重组质粒的表达、鉴定及纯化
重组 pET-28a( + )-DC-SIGN胞外区质粒转化到
蛋白表达宿主菌 BL21( DE3)中,经 IPTG诱导表达并
通过 N -iNTA纯化树脂层析纯化蛋白,随后进行 SDS-
PAGE电泳,可见在 20 kD处出现目的蛋白条带 (图
3)。说明表达载体按照设计的方式在 BL21( DE3)中
高效表达,并且可得到高表达量的纯化蛋白。
1.未诱导的 DC-S IGN胞外区 BL21 ( DE3 )菌液; 2. 用
IPTG诱导的 DC-SIGN胞外区 BL21( DE 3)菌液; 3 - 5.用
pH 6. 3 buffer洗脱的非目的蛋白; 6. 用 pH 4. 3 E lus ion
bu ffer洗脱的目的蛋白
图 3 SD S-PAGE分析 DC-SIGN胞外区的表达
2. 3 DC-SIGN胞外区蛋白的 W estern b lott ing鉴定
结果
以制备的 DC-SIGN胞外区蛋白为抗原, H is-
Tag鼠源单克隆抗体为一抗, HRP标记的山羊抗人
IgG为二抗做W estern blotting。结果 (图 4)显示, 诱
导表达的 DC-SIGN胞外区蛋白在理论值处出现曝
光条带, 说明制备的 DC-SIGN胞外区蛋白是正
确的。
2. 4 兔血清多克隆抗体的效价检测
将纯化的 DC-SIGN胞外区蛋白加入等量的弗氏
完全佐剂免疫日本大耳白兔,后用添加弗氏不完全佐
剂的蛋白加强免疫,制备多克隆抗体。将免疫血清进
行稀释,以正常兔血清为阴性对照,用 ELISA方法进
行检测。结果 (图 5)显示,随着抗体浓度的降低, OD
值逐渐变小, 但制备的多克隆抗体效价仍高达
312 500以上 (阴性血清稀释 100倍, OD值为 0. 078)。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
M.蛋白标准品 (m arker); 1.未诱导的 DC-SIGN BL21(DE3 )
表达菌液; 2.用 IPTG诱导的 DC-S IGN BL21 (DE3)表达菌
液; 3.纯化的 DC-S IGN胞外区蛋白
图 4 W estern blotting检测 DC-SIGN胞外区蛋白
图 5 ELISA检测多抗效价检测
2. 5 抗体的特异性测定
为验证制备的 DC-SIGN胞外区抗体的特异性,
检测抗体能否与真核表达的 DC-SIGN胞外区蛋白
产生特异性反应,将构建的 pET-28a-DC-SIGN胞外
区质粒转染 A549细胞中, 以兔血清为一抗、罗丹明
标记的羊抗兔 IgG为二抗进行免疫荧光检测。同时
用 DAPI将细胞核染色。免疫荧光染色结果 (图 6)
显示, 制备的兔血清抗体能与 A549细胞中表达的
DC-S IGN胞外区蛋白特异性结合, DC-SIGN胞外区
蛋白表达部位集中在细胞浆中并呈弥散状, 在荧光
显微镜下呈荧光反应, 而以正常兔血清作为阴性对
照,不产生荧光反应, 说明本研究制备的多克隆抗体
具有较好的特异性。
抗 DC-S IGN组:加抗 DC-S IGN的兔蛋白血清; 正常兔血
清组:加正常兔血清
图 6 免疫荧光测定 DC-SIGN抗血清的
特异性结合活性 ( 200 )
3 讨论
DC-SIGN的基因位于染色体的 19p13. 3,长 1. 3
kb, 相对分子质量为 44 kD,又称 CD209,属于 C型
凝集素超家族 [ 4]。其胞外区能够识别、结合富含甘
露糖和 Lew is-X碳水化合物结构的分子, 为广谱的
病原微生物受体 [ 5]。随着对 DC-SIGN分子的研究
深入,发现 DC-SIGN在蛋白识别、信号转导、病毒感
染等诸多方面都有重要作用。艾滋病 ( Acqu ired im-
munodefic iency syndrome, A IDS)主要是由人类免疫
缺陷病毒 型 (H um an Immunode ficiency V irus, H IV-
1)引起的一种免疫缺陷性疾病 [ 3]。H IV是一种被
广泛研究的病毒,但是 H IV感染的详细机制仍然不
清楚。人们在研究 H IV时,发现DC-S IGN可与 H IV-
1的表面包膜蛋白 gp120结合, 不仅可使病毒颗粒
潜伏于 DC细胞中, 还可以协助 H IV-1通过机体防
御屏障,逃避机体免疫监视, 介导 H IV感染 DC细胞
和 CD4+ T细胞。
尽管 DC-SIGN能够结合包括 H IV在内的一些
病毒蛋白,并能够引起病毒侵染机体,但是 DC-SIGN
在其中的功能以及介导病毒的潜伏与传播的分子机
制仍不是很清楚 [ 6]。相应的抗体在认识与研究 DC-
SIGN的功能有重要意义 [ 7 ]。本研究通过基因工程
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2011年第 2期 吕佰瑞等: DC-SIGN胞外区基因的克隆、蛋白表达及抗体制备
手段克隆得到 DC-SIGN胞外区片段, 诱导原核细胞
高表达 DC-S IGN胞外区蛋白,免疫日本大耳白兔获
得高效价的抗 DC-SIGN抗体。通过 EL ISA和免疫
荧光法鉴定所制备的多克隆抗体具有良好的特异性
和高度的亲和力, 为深入研究DC-SIGN的生物学功
能提供试验基础。
参 考 文 献
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(上接第 186页 )
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