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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 5期
果胶酶 pelB基因片段克隆及序列分析
张菊 薛永常
(大连工业大学生物工程学院,大连 116034 )


摘
要:
根据 GenBank上登录的果胶酶基因保守序列设计引物, 从本实验室已筛选的一株具有降解果胶质功能的枯草
芽孢杆菌 S-1中克隆到了 pe lB基因片段, pe lB与 pMD20-T载体连接后转化到大肠杆菌 JM 109中,测序并构建进化树分析。结
果表明, 其序列与来源于 Bacillus sp. 果胶裂解酶 pe-l 15和 pe lA的同源性分别为 40
98%和 39
20% ; 与 Bacillus pum ilus的 pelB
一致性为 40
32%。推断此 pe lB为类似果胶酶基因片段。
关键词:
果胶酶
克隆
枯草芽孢杆菌
Cloning and Sequence Analysis of pelB Gene Fragment from Pectate Lyase
Zhang Ju XueYongchang
(School of BiologicalEngineering, D alian P oly technic University, Dalian 116034)


Abstrac:t
A pa ir o f pr im ers w as des igned according to the conservativ e sequence o f the reported pectinase gene in GenBank. The
fragm en t of pelB gene, amp lified from B acillus subtilis S-1 wh ich has the ability to deg rade pectin, w as c loned into pMD20-T vector and
then transfo rmed into the competentE. co li JM 109 ce lls. The sequence of pe lB genew as analyzed byN J phy logenetic tree. Results ind-i
ca ted that pe lB genew as sim ilar to pec tate lyase. And pe lB gene showed sequence sim ilar ityw ith pectate lyase o fB acillus sp. ( 40
98%
sequence iden tity w ith pe-l 15 and 39
20% sequence identity w ith pe lA ) , and 40
32% sequence identity w ith pe lB ofBacillus pum i-
lu s.
Key words:
Pectinase C lone Bacillus sub tilis
收稿日期: 2010-11-14
作者简介:张菊,女,硕士研究生,研究方向:基因工程; Em ai:l zhang jucc603@ 126. com
通讯作者:薛永常,男,博士,教授,研究方向:分子生物学; E-m ai:l xueych@ 126. com
果胶酶是可作用于果胶质的一类由许多单酶组
成的复合酶的总称 [ 1 ]。在工业领域, 果胶酶被广泛
应用于纺织业 [ 2]、咖啡与茶发酵 [ 3 ]、污水处理 [ 4]、造
纸 [ 5]等。目前国内外研究的果胶酶产生细菌主要
有:欧文氏菌属 (E rw inia ) [ 6] , 假单胞菌属 ( P seudo-
monas)
[ 7]
, 芽孢杆菌属 ( Bacillus ) [ 8, 9 ] , 梭状芽孢杆
菌属 (C lostridium ) [ 10 ]等。本研究从自然界筛选出一
株果胶酶产生菌的基因组 DNA中克隆果胶酶基因
片段, 并对其测序及构建进化树分析,为进一步研究
该果胶酶蛋白结构奠定基础。
1
材料与方法
1
1 材料
1
1
1
菌株、质粒和酶 枯草芽孢杆菌 S-1(Bacil-
lus subtilis S-1 )由本实验室筛选获得。E scherichia
coli JM 109由本实验室保存; pMD20-T Vector、Taq
DNA polymerase、Xba
、E coR
, 购自宝生物工程
(大连 )有限公司。
1
1
2 主要试剂盒
细菌基因组 DNA提取试剂
盒 (溶液型 )购自北京百泰克生物技术有限公司; 质
粒提取试剂盒和琼脂糖回收试剂盒购自天根生化科
技 (北京 )有限公司。
1
1
3
主要培养基
种子培养基: 牛肉膏 3 g /L,蛋
白胨 10 g /L, N aC l 5 g /L, pH7
0, 121
灭菌 20m in;
LB培养基: 蛋白胨 10 g /L, 酵母提取物 5 g /L, NaC l
10 g /L, pH 7
0, 121
灭菌 20m in。
1
2 方法
1
2
1
产果胶酶菌株的培养
无菌条件下接种 B.
subtilis S-1于液体种子培养基中 37
、150 r /m in下
培养过夜,放于 4
冰箱备用。
1
2
2 目的基因片段的克隆
根据 GenBank数据
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 5期
库中已登陆的果胶酶基因序列, 设计特异性引物
P1: 5
-GGGTCTTATCGGCTTGT-3
; P2: 5
-ATGTGCT-
GTCGCTGGTC-3
。
以 B. sub tilis S-1基因组 DNA为模板,利用由日
本 TaKaRa公司生产的梯度 PCR扩增仪将退火温度
设定为 40- 60
, 进行退火温度初步优化, 然后再
结合优化其它参数, 最终确定 PCR扩增反应体系:
10
Taq reaction buffer 2
L, dNTP ( 2
5 mmol /L )、
P1( 10
mo l/L )和 P2( 10
mo l/L )三者各 0
5
L,
DNA模板 ( 20- 40 ng /
L) 1
L, Taq DNA聚合酶
( 2
5U /
L ) 0
1
L, 补充 ddH2 O至总体积为 20

L。反应程序: 95
预变性 3 m in,扩增反应 30个循
环 ( 95
变性 30 s, 48
退火 45 s, 72
延伸 80 s),
72
延伸 10m in, 4
保存。以 1
0%琼脂糖凝胶电
泳检测扩增产物, 用琼脂糖回收试剂盒回收目的
片段。
将回收的 PCR产物连接到 pMD20-T 载体上,
构建的 pMD20-T-pelB质粒导入大肠杆菌 JM 109感
受态细胞,挑取阳性克隆进行菌落 PCR鉴定, 然后
提取质粒进行 E coR
和 Xba
双酶切检测,并保
存阳性克隆子,送宝生物工程 (大连 )有限公司测序
后用 C lustalX2
0和 MEGA 4
1构建进化树分析。
其中基因组 DNA提取、DNA片段回收、连接
转化、质粒 DNA提取是参照各自试剂盒说明书操
作; JM 109感受态细胞制备是参考
分子克隆实验
指南
(第 3版 )的 CaC l2法严格在无菌操作条件下
制备。
2 结果与分析
2
1
产果胶酶菌株基因组 DNA提取
提取的枯草芽孢杆菌 S-1基因组 DNA经 0
8%
琼脂糖凝胶电泳检测后, 得到一条大于 15 kb清晰
单一的条带 (图 1), 基本无降解,可用于后续试验。
2
2
目的基因片段的扩增与克隆
以上述基因组 DNA为模板,由引物 P1、P2利用
梯度 PCR扩增仪在 G radient Sett ing中设定最低退
火温度为 40
和最高退火温度为 60
后, PCR仪会
自动生成 12个退火温度, 分别为 40、41、42、44、
46
4、48
8、51
2、53
6、56、58、59和 60
。经 PCR
后前 11个退火温度结果经 1
0%琼脂糖凝胶电泳
检测 (图 2), 大多数均在 1 030 bp处有较亮的条带,
与预期目的片段大小相一致。但大部分都含有杂
带, 由结果 (图 2)可看出, 4, 5, 6泳道目的片段的亮
度比较稳定, 因此, 下一步试验选择退火温度在 44
- 49
范围,结合 PCR其它条件进行具体优化。最
终 PCR扩增产物在 1
0%琼脂糖凝胶电泳后呈现单
一清晰条带, 大小约为 1 030 bp的片段 (图 3),可用
于后续连接转化试验。
M. DL15000M arker; 1.枯草芽孢杆菌 S-1基因组 DNA
图 1 枯草芽孢杆菌 S-1的基因组 DNA琼脂糖凝胶电泳结果
M. DL2000M ark er; 1- 11. PCR退火温度依次为 40、41、
42、44、46
4、48
8、51
2、53
6、56、58和 59

图 2
PCR退火温度优化的电泳图谱
M. DL2000M arker; 1.枯草芽孢杆菌 S-1扩增片段
图 3 枯草芽孢杆菌 S-1DNA扩增片段电泳图谱
210
2011年第 5期 张菊等:果胶酶 pelB基因片段克隆及序列分析
2
3
阳性重组子筛选及鉴定
按照琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收的 PCR
产物, 与 pMD20-T载体连接, 并转化到 JM 109感受
态细胞中。通过蓝白斑筛选挑取白色菌落, 进行菌
落 PCR初步鉴定,经 1%琼脂糖凝胶电泳检测,在挑
取的 8个白色菌落中 3、5、6和 8出现特异性条带
(图 4) ,且与目的片段大小一致,初步表明 3、5、6和
8号为阳性克隆子。
M. DL2000M ark er; 1- 8.菌落 PCR扩增结果
图 4 菌落 PCR电泳图谱
将 3号阳性克隆菌 B-3培养提取质粒 (图 5中
泳道 2) , 以该质粒 DNA为模板用引物 P1、P2进行
PCR扩增,获得单一清晰的条带 (图 5中泳道 1) ,
与目的片段大小相一致; 另外将该重组质粒进行
X ba
/E coR
双酶切检测 (图 5中泳道 3 ), 能够
得到目的片段大小的片段, 证明目的片段插入到
了 pMD20-T载体中, B-3中含有重组质粒 pMD20-
T-pelB。
M. M arker
; 1. PCR扩增产物; 2.重组质粒;
3. X ba
和 E coR
双酶切产物
图 5 重组质粒酶切产物电泳图
2
4
测序及序列分析
将单菌落 B-3培养液送至宝生物工程 (大连 )
有限公司测序, 得到正向插入 pMD20-T中的 1 033
bp的 DNA片段, 其与 NCB I数据库公布芽孢杆菌属
的未知蛋白基因序列同源性达到 100%。另外, 将
pelB基因序列与从 NCBI数据库中已登录的 21个
pectate lyase基因和 5个 polyga lacturnase基因进行
进化树分析, 结果 (图 6)表明 pe lB基因与 pectate
lyase的同源性较高,可初步断定 pelB与果胶裂解酶
基因最为相近。
图 6
B-3的 pe lB基因与其他果胶酶
基因的 NJ进化树分析
3
讨论
近年来, 果胶酶基因克隆的研究越来越多, 但
由于细菌自身的特殊性, 一些研究成果表明, 来自
不同菌株中的同一种果胶酶基因一致性和同源性较
低, 如日本的 H la等 [ 10]获得的果胶裂解酶 Pe l9A基
因序列与来自 Bacillus halodurans的 Pe lX基因序列
( DDBJ登录号 BAB04213)比对的一致性为 53%; 获
得的 CM9-2基因与来自 Bacillus sp. KSM p15的 PeHl
基因 ( AB028878)和来自 E. chry santhem i pel1基因
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 5期
(AF171228)的同源性分别为 47%和 32% [ 10]。
本试验中得到的 pelB基因与 H atada等 [ 11]从
Bacillus sp.中获得的果胶裂解酶 pe-l 15 (NCB I登录
号 AB011839)的一致性为 40
98%;与 Bacillus pum i-
lus的 pelB( EU652988)的一致性为 40
32%;与 Bacil-
lus sp.中的 pelA( GU088530)一致性为 39
20%,故初
步断定本试验中从 Bacillus subtilis中克隆到的基因片
段 pelB为果胶裂解酶基因片段。
4
展望
国内外对细菌果胶酶的研究越来越多, 国外对
细菌果胶酶分子生物学方面研究较多, 而国内主要
集中在产果胶酶的菌种筛选、发酵条件优化和诱变
等研究上,相对的分子生物学方面研究较少。随着
高新科技的发展,利用基因工程进行菌种选育,不仅
能大大提高产酶量还能将多种有利的特性集中于一
株菌上,以更利于满足工业生产的需求,从而克服传
统生产工艺的复杂性与盲目性。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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