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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
青霉菌聚半乳糖醛酸酶基因在毕赤酵母中的
表达及酶学性质研究
曹威1，2 张宇宏2 张伟2
(1河北农业大学食品科技学院，保定 071001;2中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)
摘 要: 筛选得到一株能分解果胶的青霉菌(Penicillium sp．) ，使用简并引物 PCR和 TAIL-PCR方法从该菌中克隆了一
个聚半乳糖醛酸酶基因 pgp1。pgp1 基因全长 1 225 bp，包含 2 个内含子，其 cDNA全长 1 104 bp，编码 367 个氨基酸和一个终
止密码子，前 18 个氨基酸为信号肽序列。将 pgp1 基因连接 pPIC9 载体，在巴斯德毕赤酵母表达系统中进行了异源表达。在 3
L发酵罐水平，培养基中聚半乳糖醛酸酶活力达到 700 U /mL。酶学性质测定表明，重组酶蛋白 PGP1 的最适 pH 为 5. 0，在
pH4. 0 － 6. 0 下处理 1 h 后，剩余酶活力超过 90%;最适温度为 38℃，以聚半乳糖醛酸为底物，PGP1 的 Km =(1. 172 ± 0. 169)
mg /mL，Vmax =(0. 061 ± 0. 002)mg /min /mL。
关键词: 聚半乳糖醛酸酶 青霉菌 毕赤酵母 异源表达
Cloning，Expression and Characterization of a Polygalacturonase from
Penicillium sp． in Pichia pastoris
Cao Wei1，2 Zhang Yuhong2 Zhang Wei2
(1College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001;
2Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081)
Abstract: Polygalacturonase as a kind of pectinase that can hydrolyze pectin，have been widely used in food，feed，textile and pa-
per industry． A Penicillium sp． FJ2，which produced polygalacturonase was selected in this research． In addition，a polygalacturonase
gene pgp1 was cloned using degenerated PCR and TAIL-PCR． Length of the polygalacturonase pgp1 gene and its cDNA are 1 225 bp
and 1 104 bp，respectively． The cDNA of pgp1 encode 367 amino acids and a termination codon，first 18-residue amino acids is signal
peptide． This gene was cloned into a expression vector pPIC9 and overexpressed in Pichia pastoris GS115 with the maximum polygalac-
turonase activity of 700 U /mL． The recombinant PGP1 exhibited activity towards polygalacturonic acid was optimally active at pH5. 0
and 38℃，and remained 90% relative activity at pH4. 0 － 6. 0. The Km and Vmax values for polygalacturonic acid were(1. 172 ± 0. 169)
mg /mL and(0. 061 ± 0. 002)mg /min /mL，respectively．
Key words: Polygalacturonase Penicillium Pichia pastoris Heterologous expression
收稿日期:2011-03-29
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费(2011-08)
作者简介:曹威，男，硕士研究生，研究方向:发酵工程;E-mail:caowei040108@ gmail． com
通讯作者:张伟，女，副研究员，研究方向:微生物分子生物学;E-mail:zwcaas@ hotmail． com
果胶酶是一类分解果胶的酶的总称，是世界四
大酶制剂之一，在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物
技术和饲料等方面应用广泛。通常情况下，根据其
底物和催化方式将果胶酶分为原果胶酶(protopecti-
nase)、果胶酯酶(pectin esterase)、果胶裂解酶(pec-
tin lyase)和果胶水解酶(pectin hydrolase)［1］。按照
生产、应用的最适 pH 值环境又可以分为酸性果胶
酶和碱性果胶酶。聚半乳糖醛酸酶(endopolygalac-
turonase，PG，EC 3. 2. 1. 15)大多属于酸性果胶水解
酶类［2］，作为果胶酶家族中的主要成员，它能够以
随机方式水解果胶光滑区的 α(1→4)糖苷键［3］，迅
速降低果胶黏度，因此广泛应用在食品、饲料等行
2011 年第 11 期 曹威等:青霉菌聚半乳糖醛酸酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究
业。PG多发现于真菌和细菌中，在一些高等植物和
寄生于植物的线虫中也有发现［2］。国内对于 PG 的
研究多集中在生产菌种的筛选及菌种的物理化学诱
变方面。近年来，随着基因工程的迅猛发展，构建高
表达基因工程生产菌已成为果胶酶工业化生产的发
展趋势。目前，已有一些 PG 基因获得克隆，并在多
种表达系统中实现了表达。Gattás等［4］利用将曲霉
属菌(Aspergillus)的孢子固定于褐藻酸钙，经条件优
化最高表达酶量为 59. 5 U /mL;Jurick 等［5］利用采
摘后腐烂的安久梨(‘Anjou’)进行固态发酵法得粗
酶量为 137 U /mL;顾佳佳［6］将欧文氏菌 CXJZU-120
的发酵液产酶量提高到 158 U /mL;Suzuki等［7］利用
米曲霉(Aspergillus oryzae)表达系统在土豆渣上进行
固态发酵，产酶量可达到 173 U /g;Yang等［8］将来源
于嗜酸真菌(Bispora sp. MEY-1)的 PG 基因在巴斯
德毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行表达，摇瓶水平
酶活力可达到 50 U /mL。但是目前，制约基因工程
菌应用于生产聚半乳糖醛酸酶主要瓶颈在于其表达
水平偏低，导致生产成本高。
本研究拟克隆一个来源于青霉菌(Penicillium
sp. )的聚半乳糖醛酸酶基因 pgp1，使该基因连接
pPIC9 载体后在 P. pastoris 中获得高效分泌表达。
并进一步对纯化的 PGP1 进行了酶学性质分析，以
评估其在工业生产中应用价值。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种与质粒 Penicillium sp. FJ2 为本实验
室筛选保存;pEASY-T3 克隆载体及大肠杆菌(Esch-
erichia coli)感受态细胞 TOP10 购自北京全式金生
物技术有限公司;毕赤酵母表达载体 pPIC9 和受体
菌株 P. pastoris GS115 为 Invitrogen公司产品。
1. 1. 2 工具酶与试剂 限制性内切酶、T4 DNA 连
接酶和 Taq DNA聚合酶购自 TaKaRa 公司，FastPfu
DNA聚合酶为北京全式金生物技术有限公司产
品;RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有
限公司;凝胶分子筛 Superdex 75 10 /300 和阴离子
交换柱 Mono Q购自 GE healthcare 公司;聚半乳糖
醛酸为 Sigma公司产品;D(+)-半乳糖醛酸为 Am-
resco公司产品。其他试剂为进口或国产分析纯。
试验中引物的合成和测序工作分别由上海生工生
物工程公司和北京迈奥德恩生物科技有限公司
完成。
1. 1. 3 培养基 LB培养基(1%蛋白胨，0. 5%酵母
粉，1% NaCl，pH7. 0)用于培养大肠杆菌;PDA 培养
基(20%马铃薯汁，2%葡萄糖)用于培养 Penicillium
sp. FJ2;YPD 培养基(1%酵母膏，2%蛋白胨，1%葡
萄糖)用于培养毕赤酵母;MD 固体培养基(1. 34%
YNB，0. 000 04% Biotin，2%葡萄糖，1. 5%琼脂糖)
用于筛选重组毕赤酵母;BMGY 培养基(1%酵母提
取物，2%蛋白胨，pH6. 0，100 mmol /L 磷酸缓冲液，
1. 34% YNB，0. 000 04% Biotin，1%甘油)用于培养
毕赤酵母重组子;BMMY培养基(除以 0. 5%甲醇代
替甘油，其余成分与 BMGY 相同)用于诱导毕赤酵
母重组子产酶。
1. 2 方法
1. 2. 1 Penicillium sp. FJ2 基因组 DNA 的提取 按
照 Graham［9］所述的方法提取 Penicillium sp. FJ2 的
基因组 DNA。
1. 2. 2 聚半乳糖醛酸酶基因 pgp1 cDNA 的克隆
通过比对 GenBank 中的不同来源的聚半乳糖醛酸
酶(PG)的蛋白序列，寻找其中的氨基酸保守区，设
计 PCR 简并引物 HQ-PGF(5-GCWGGAGCGAC-
TYTRGAYYTN-3)和 HQ-PGR(5-TTRGTYCTRCT-
RACARANCGGT-3) ，简并引物 PCR 扩增出 PG 的
保守区 DNA 序列。然后以扩增得到 PG 保守区
DNA序列为基础，设计上游步移引物 SP1U(5-
CTCCGGAAGCAACATTCACGTCTC-3)、SP2U (5-
ACCCCCGTTCAGGGTTTCAGTATC-3)、SP3U (5-
CTTCGATGTTGGCTCCAGTACCTTC-3)和下游步移
引物SP1D(5-AAGGTACTGGAGCCAACATCGAAG-
3)、SP2D (5-GATGGTGATGTGGTCGAGGGTCAG-
3)、SP3D (5-GACGTGAATGTTGCTTCCGGAGAA-
3) ，使用热不对称交错 PCR(thermal asymmetric in-
terlaced PCR，TAIL-PCR)［10］扩增得到 PG 基因保守
区的侧翼序列。侧翼序列与保守区 DNA 序列拼接
得到基因的 DNA全长序列。
用天根 RNA 提取试剂盒提取青霉 FJ2 的总
RNA，取 5 μg 总 RNA 反转录获得 cDNA 第一链，
以 OligdT 和 fjb1EF (5-ATGCGCACATCCTTCGT-
TACC-3)为引物扩增基因的编码区。PCR 程序:
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1. 5 min，30
个循环;72℃ 10 min。PCR 产物连接 pEASY-T3 载
体，转化 E． coli TOP10，并进行序列测定。
通过 SignalP 3. 0(http:/ /www． cbs． dtu． dk /serv-
ices /SignalP /)预测 cDNA中编码信号肽的序列。并
将自身信号肽序列去除的 cDNA 序列命名为 pgp1。
设计引物 fjbEF(5-TCAGAATTCGCCCCAGCTGCTC-
CTGTTACTG-3，下划线为 EcoRⅠ酶切位点)和 fjbER
(5-AATAGCGGCCGCGCAAGAAGCACCGGCAGGCACG-
3，下划线为 NotⅠ酶切位点) ，以聚半乳糖醛酸酶
cDNA为模板，PCR 扩增 pgp1 序列并与 pEASY-T3
克隆载体相连，构建重组载体 pTPG，测序确认序列
正确性。
1. 2. 3 真核表达载体的构建及转化 将鉴定正确
的 pTPG重组质粒分别用 EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后回
收 pgp1 基因片段，并与经同样处理的 pPIC9 载体连
接，构建真核表达载体 pPIC9-PG。鉴定正确的重组
质粒 pPIC9-PG 经 BglⅡ酶切使质粒线性化。按照
Invitrogen公司毕赤酵母操作手册和 Yang 等［8］的方
法将线性化的 pPIC9-PG 质粒电转化至受体菌
GS115 中，涂布 MD平板，28℃温箱倒置培养至转化
子长出。
1. 2. 4 转化子的筛选及重组蛋白的表达 将酵母
转化子接种于含有 5 mL BMGY 培养基的试管中，
28℃，200 r /min 培养 48 h 后，离心去除培养基，加
入 3 mL BMMY 培养基重悬菌体，甲醇诱导培养
72 h。离心，通过测定上清液中聚半乳糖醛酸酶的
活性筛选阳性转化子。按上述方法扩大培养基用量
进行复筛。
将经摇瓶筛选获得的酶活最高的酵母转化子
PG1-8 接种到 40 mL YPD培养基中，28℃，200 r /min
培养 48 h，转接到 200 mL YPD 培养基中，28℃，
200 r /min 培养 24 h，接种于 3 L发酵罐中。发酵罐
设定 pH5. 0，温度 30℃，搅拌速率为 1 000 r /min，甲
醇诱导产酶，期间每隔 12 h取发酵样品测定菌体湿
重和聚半乳糖醛酸酶活力。
1. 2. 5 重组酶 PGP1 的纯化 发酵液在 4℃下，
10 000 r /min离心 15 min，上清液经 0. 1 μm的微滤
膜(Pall公司)去除剩余菌体后再通过 10 kD的超滤
膜(Pall公司)以除去其中的盐分和色素，超滤液经
凝胶分子筛 Superdex 75 10 /300 和阴离子交换柱
Mono Q，得到电泳纯的重组蛋白 PGP1。
1. 2. 6 聚半乳糖醛酸酶酶活力的测定 酶活测定
方法在 Lindsay［11］的基础上进行改进，利用 DNS 法
测定聚半乳糖醛酸酶的活性并以生成 D(+)半乳
糖醛酸的量来表示。将 800 μL 0. 2%(W/V)的聚
半乳糖醛酸在 38℃下预热，然后加入稀释的酶液
200 μL反应 20 min，加入 2 mL DNS溶液终止反应;
将反应体系放置沸水浴中 5 min 显色;冷却至室温，
加入 2 mL 水后测定 OD570的吸光值。在上述反应体
系中，每分钟分解聚半乳糖醛酸底物产生 1 μmol还
原糖定义为一个酶活单位(U)。
1. 2. 7 PGP1 酶学性质的测定 分别配制 pH3. 0 －
9. 0 的不同 pH 的缓冲液(pH3. 0 － 7. 0:0. 1 mol /L
柠檬酸 － 0. 2 mol /L 磷酸氢二钠;pH7. 0 － 9. 0:
0. 1 mol /L Tris-HCl) ，将聚半乳糖醛酸溶于不同 pH
的缓冲液中，并将 PGP1 用相应的不同 pH缓冲液稀
释，在 38℃下测定不同 pH 下 PGP1 的酶活力，绘制
最适 pH曲线;将 PGP1 置于不同 pH缓冲液中，37℃
保温 1 h后测定剩余的相对酶活力，并绘制 pH稳定
性曲线。
分别在 20、25、30、35、38、40、42、50、55、60 以及
65℃下测定 PGP1 的酶活力，绘制最适温度曲线;将
PGP1 在 39℃、40℃、41℃下保温不同时间(5、10、
15、20、30、40、50 和 60 min)测定剩余的相对酶活
力，绘制温度稳定性曲线。
在酶促反应体系中加入不同的金属离子和化学
试剂，终浓度为 1 mmol /L 或 10 mmol /L，在最适反
应条件下测定聚半乳糖醛酸酶的相对酶活力，以未
处理样品的酶活力计为 100%。
在酶反应最适条件下，以 0. 2%的聚半乳糖醛
酸为底物，依次在酶促反应的 1、3、5、7、10、15、20 及
30 min时终止反应，计算酶活力与反应时间的比值，
在一定时间内比值保持稳定，则在此时间内的酶促
反应为一级反应，此时间内即可作为测定 Km和 Vmax
的反应时间。根据测定的一级反应时间，用不同浓
度的聚半乳糖醛酸(0. 20%、0. 25%、0. 30%、0. 60%、
0. 80%和 1. 00%)为底物，在最适条件下测定酶活
性，计算相应的反应速率。利用 Michaelis-Menten为
模型计算出 Km和 Vmax。
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2011 年第 11 期 曹威等:青霉菌聚半乳糖醛酸酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究
2 结果
2. 1 聚半乳糖醛酸酶基因 pgp1 cDNA克隆
根据聚半乳糖醛酸酶(PG)氨基酸序列的保守
区，设计保守区的简并引物 HQ-PGF /R，从 Penicilli-
um sp. FJ2 基因组 DNA 中扩增获得一段长 383 bp
的聚半乳糖醛酸酶保守区片段。在此基因片段基础
上通过 TAIL-PCR，获得了青霉 FJ2 的 pgp1 基因的
DNA全长。进一步获得了该基因的 cDNA 全长序
列。序列分析表明，来源于青霉 FJ2 的 pgp1 基因全
长 1 225 bp，包含 2 段内含子(229 － 285 bp和 703 －
766 bp) ;其 cDNA全长为 1 104 bp，推导编码 367 个
氨基酸和一个终止密码子，前 18 个氨基酸为信号肽
序列。其氨基酸序列与 GenBank 中所报道的仅进
行了全基因组测序研究的指状青霉(Penicillium dig-
itatum)中的 PG基因序列的相似性为 100%。
2. 2 pgp1 基因在 P. pastoris中的分泌表达
通过酶活力测定，从 100 个转化子中挑选出 30
株有聚半乳糖醛酸酶活性的阳性酵母转化子。在摇
瓶水平，经甲醇诱导 72 h 后，PGP1 重组蛋白的酶活
力可达 70 U /mL。
选择经摇床水平两次筛选获得的酶活力最高的
1 － 8 转化子在 3 L发酵罐上进行高密度发酵。在 3
L发酵罐中，未经甲醇诱导之前，在发酵液上清中检
测不到聚半乳糖醛酸酶活力，从 SDS-PAGE 中未见
目的蛋白条带(图 1)。随着甲醇诱导时间延长，发
酵液中的 PG活性逐渐增加，诱导 84 h后，酶活力不
再增长，此时发酵液中 PG 的活性为 700 U /mL(图
2)。SDS-PAGE分析显示，发酵液中 PGP1 的蛋白在
M．蛋白分子量 Marker;1． pPIC9-PG /GS115 在基础培养
基中培养的上清液;2． pPIC9-PG /GS115 经混饲诱导后
的上清液;3 － 8． pPIC9-PG /GS115 经甲醇诱导 12、24、
48、72、84 和 96 h后的上清液
图 1 3 L发酵罐中 PGP1 经甲醇
诱导不同时间内的表达量
不断积累，且表达的 PG 蛋白分子量约为 36 kD(图
1) ，与理论分子量相符。
图 2 3 L发酵罐中 PGP1 经甲醇诱导不同时间
内的酶活和菌体的累积
2. 3 重组酶蛋白 PGP1 的纯化及酶学性质测定
2. 3. 1 重组酶蛋白 PGP1 的纯化 按照 1. 2. 7 的
方法对发酵液上清中的酶蛋白进行纯化，SDS-PAGE
分析显示单一条带，图 3 箭头所示为纯化后的重组
PGP1 蛋白。
M．蛋白分子量 Marker;1． PGP1 经阴离子交换柱 Mono Q
纯化结果;2． PGP1 经琼脂糖凝胶分子筛 Superdex75 10 /
300 纯化结果
图 3 SDS-PAGE分析纯化后的 PGP1 重组蛋白
2. 3. 2 PGP1 酶学性质的测定 经纯化的 PGP1 在
38℃下测定的最适 pH 为 5. 0(图 4-A)。将酶液在
不同 pH条件下处理 1 h，测定其剩余酶活，观察到
在 pH4. 0 － 6. 0 之间保持 90%以上的酶活力，而在
pH ＜4. 0或 pH ＞ 6. 0 时酶活力迅速下降(图 4-B)。
在最适 pH5. 0 下，PGP1 在 38℃下酶活力最高(图 4-
C)。PGP1 在 38℃时保温 1 h仍可保持 90%以上的
酶活，而在 41℃时保温 30 min 便丧失了 70%的酶
活力(图 4-D)。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
A． PGP1 最适 pH曲线;B． PGP1 pH稳定性曲线;C． PGP1 最适温度曲线;D． PGP1 温度稳定性曲线
图 4 温度和 pH对 PGP1 酶活力的影响
以聚半乳糖醛酸为底物，在反应时间为 7 min 下
测定 Km和 Vmax。使用 GraphPad Prism v5. 04(Graph-
Pad Software，Inc)软件以Michaelis-Menten为模型(图
5) ，测得 PGP1 的 Km =(1. 172 ± 0. 169)mg /mL 聚半
乳糖醛酸，Vmax =(0. 061 ±0. 002)mg /min /mL。
图 5 以Michaelis-Menten为模型计算
PGP1 的 Km和 Vmax曲线
在酶促反应体系中分别加入终浓度为 1 mmol /L
和 10 mmol /L 的金属离子和相关化学试剂，研究其
对 PGP1 酶活力的影响(图 6)。PGP1 的酶活力不
受 Na +、K +和 EDTA 的影响，而 SDS 和 CTAB 会强
烈抑制酶的活力，相反 Triton 会增强酶的活力。在
含 10 mmol /L Mg2 + 的条件下会使酶活力丧失约
50%，而 10 mmol /L 的 Ca2 +、Co2 +、Mn2 +、Pb2 + 和
Zn2 +会完全抑制酶的活力。
3 讨论
果胶酶是一类有重要应用价值的复合酶系，而
多聚半乳糖醛酸酶作为其家族中的主要成员在果汁
制造、果酒酿造、罐头加工等食品工业和饲料行业均
有大量报道，显示了其诱人的应用前景。但长期以
来，国内对于果胶酶的研究绝大多数依然集中在菌
株的筛选、诱变及原始菌株发酵条件的优化上［12］。
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2011 年第 11 期 曹威等:青霉菌聚半乳糖醛酸酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究
图 6 金属离子和相关化学试剂对 PGP1 活力的影响
随着生物技术的发展，利用基因工程技术进行
工业酶制剂的研发已成为可能。本研究以开发工业
用聚半乳糖醛酸酶制剂、提高酶的性质与产量为目
标，筛选到一产聚半乳糖醛酸酶的真菌 Penicillium
sp. FJ2，并从中克隆到其编码基因 cDNA，利用基因
工程方法构建 P. pastoris 高效表达质粒 pPIC9-PG，
经过优化发酵条件，在 3 L 发酵罐中聚半乳糖醛酸
酶的表达量比原始菌株提高了 50 倍以上，且发酵上
清中的杂蛋白较少，有利于酶蛋白的后加工处理，适
于工业生产进一步放大发酵，以实现聚半乳糖醛酸
酶生产的高产、高效、低成本的目标。这一研究结果
为创制高品质、廉价的果胶酶产品提供了借鉴。同
时，该酶的酶学性质在耐酸和温度稳定性方面还有
改善的空间，因此利用分子生物学手段对酶蛋白进
行改造，提高酶的性质是下一步研究的方向。
4 结论
本研究筛选到一株产果胶酶的青霉菌，从中克
隆了多聚半乳糖醛酸酶的基因并成功实现了在毕赤
酵母中的高效分泌表达，摇床水平的表达量为
70 U /mL，而在 3 L发酵罐的表达量达到 700 U /mL，
比原始菌株的表达量提高了 50 倍以上，且发酵上清
中的杂蛋白较少，有利于酶蛋白的后加工处理。这
一研究结果为创制高品质、廉价的果胶酶产品提供
了借鉴。
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(责任编辑 李楠)
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