全 文 ：2016 年第 38 卷第 2 期 中国麻业科学 PLANT FIBEＲ SCIENCES IN CHINA
文章编号:1671 － 3532(2016)02 － 0062 － 07
剑麻斑马纹病菌多聚半乳糖醛酸酶 Szpg6 ～ Szpg10
基因的分子检测及其序列分析
吴伟怀1，贺春萍1，郑金龙1，习金根1，郑肖兰1，梁艳琼1，刘巧莲2，李锐1，易克贤1*
(1. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 /海南省热带农业
有害生物检测监控重点实验室，海口 571101;
2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101)
摘 要:斑马纹病是剑麻生产上最严重、毁灭性病害之一。本研究基于寄生疫霉菌多聚半乳
糖醛酸酶 pppg6 ～ pppg10 等 5 个基因 cDNA序列设计了各基因编码区的特异引物。利用 5 对引物
分别对不同来源的剑麻斑马纹病菌 DNA进行了分子检测。检测结果表明，在被检测的剑麻斑马纹
病菌菌株中均存在与寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶 pppg6 ～ pppg10 对应的基因 Szpg6 ～ Szpg10。
基因序列比对分析表明，来自斑马纹病菌的 Szpg6、Szpg8 基因与对应 pppg6、pppg8 基因之间序列高
度一致。比较而言，来自斑马纹病菌的 Szpg7、Szpg9 以及 Szpg10 基因与对应同源基因之间分别存
在 3、6 及 4 个核苷酸序列差异，进而导致 3、5 及 3 个推定氨基酸的变异。由此推测，来自斑马纹病
菌的 Szpg7、Szpg9 及 Szpg10 基因可能与对应基因在功能上存在着一定的差异。本研究为进一步研
究剑麻斑马纹病菌多聚半乳糖醛酸酶在致病过程中的作用奠定了基础。
关键词:剑麻斑马纹病菌;多聚半乳糖醛酸酶;分子检测
中图分类号:S563. 8 文献标识码:A
收稿日期:2015 － 12 － 10
基金项目:海南省自然科学基金项目(314105) ;现代农业产业技术体系(CAＲS － 19) ;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项
(NO. 2014hzs1J012) ;中国热带农业科学院环植所自主选题项目(2013hzsJY04)
作者简介:吴伟怀(1977 －) ，男，博士，副研究员，研究方向:植物病理。E － mail:weihuaiwu2002@ 163. com。
* 通讯作者:易克贤(1964 －) ，男，博士，研究员，研究方向:分子抗性育种。E － mail:yikexian@ 126. com。
Molecular Detection and Sequence Analysis of
Polygalacturonase Szpg6 to Szpg10 Gene
of Zebra Disease of Sisal
WU Weihuai1，HE Chunping1，ZHENG Jinlong1，XI Jingen1，ZHENG Xiaolan1，
LIANG Yanqiong1，LIU Qiaolian2，LI Ｒui1，YI Kexian1*
(1. Environment and Plant Protection Institute，CATAS /Hainan Key Laboratory for Detection and
Control of Tropical Agricultural Pests，Haikou 571101，China;
2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou 571101，China)
Abstract:Sisal zebra disease caused by Phytophora nicotianae var. parasitica is a kind of main dis-
eases which can cause serious damage to the sisal. In the present study，five specific primer pairs were
designed in coding region based on the reference sequence of pppg6 to pppg10 gene from Phytophora par-
asitic. Five specific primer pairs were used for the molecular detection and gene cloning from sisal zebra
pathgoen DNA. The results showed that Szpg6 (sisal zebra polygalacturonase 6)to Szpg10 genes were
26
conserved in all the tested sisal zebra isolates. Sequence alignment with the reference sequences of pppg6
to pppg10 gene from Phytophora parasitic revealed that 1，3，1，6 and 4 SNPs were identified in the Sz-
pg6 to Szpg10 genes coding regions，respectively. There，five and three of these mutations were nonsyn-
onymous in Szpg7，Szpg9 and Szpg10，and the rest were synonymous. Thus we speculated that there were
some differences in function when Szpg7，Szpg9 and Szpg10 genes were compared to pppg7，pppg9 and
pppg10. The results have laid a solid foundation for the further study of the role of sisal zebra germs po-
lygalaturonase in the pathogenic process.
Key words:zebra disease of sisal;polygalaturonase;molecular detection
由烟草疫霉(Phytophora nicotianae var. parasitica 或表示为 Phytophora parasitica var. nicoti-
anae)引起剑麻斑马纹病是剑麻生产上最严重的、毁灭性病害之一［1 － 2］。该病在我国华南各剑麻产
区均有不同程度地发生，对剑麻的生产威胁很大，严重影响剑麻高产稳产［3 － 5］。如今该病仍然是各
生产单位重点盯防的对象之一。针对此病害，国内专家学者相继开展了病原菌形态及鉴定［1 － 2，6］，
生物学特性［7 － 8］，流行因素以及防治［9 － 10］等相关研究，而关于该病原菌的多聚半乳糖醛酸酶(Po-
lygalaturonase，PG)的相关研究还鲜见报道。
植物细胞壁是寄主与病菌互作的重要场所，病菌定植于寄主植物表面后只有穿透细胞壁的屏
障并与之建立了寄生关系，才能表现出致病性，在此过程中细胞壁降解酶发挥了极其重要的作
用［11］。因此，研究植物病原菌是否能分泌对细胞壁起离析破坏作用的特异性酶，对于揭示其致病
过程将具有重要的理论和实践意义。目前，已从寄生疫霉菌中克隆了 PG基因 pppg1 ～ pppg10 共
10 个基因［12 － 13］。在前期研究发现斑马纹病菌 PG基因 Szpg1 ～ Szpg5 的编码区与寄生疫霉 PG 基
因 pppg1 ～ pppg5 对应基因序列具有高度的相似性，其氨基酸序列一致性均在 90%以上。然而 pp-
pg6 ～ pppg10 基因在剑麻斑马纹病菌中存在情况以及同源性情况如何，仍然未知。为此，本研究
拟以这些基因序列为参考序列设计特异引物，检测 PG基因在剑麻斑马纹病菌中的存在情况，并对
各基因编码区进行克隆与测序，为下一步研究剑麻斑马纹病菌 PG 在斑马纹病菌致病过程中的作
用奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
用于本实验的剑麻斑马病菌菌株共计 35 个，分别采集自广东、海南及广西剑麻种植地(表 1)。
1. 2 方法
1. 2. 1 菌丝体收集及 DNA提取
各供试菌株于已灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃ 160 rpm振荡培养 6 天后，对菌丝体
收集与真空干燥。收集的各菌丝体于液氮中充分研磨后，采用 DNA提取试剂盒(E. Z. N. A Fungal
DNA kit，Omega 公司，美国)进行 DNA提取。
1. 2. 2 总 ＲNA的提取与 cDNA的合成
按 TＲIzol Ｒ试剂盒 (Gibco － BＲL)操作方法对于马铃薯葡萄糖液体培养中培养 6 天的剑麻斑
马纹病原菌菌丝体进行总 ＲNA提取。cDNA 的反转录合成则利用反转录试剂盒 SuperscriptTM III
Ｒeverse Transcriptase进行。
1. 2. 3 引物设计与合成
利用软件 primer5. 0 以寄生疫霉 PG基因 pppg6 ～ pppg10 序列为参考，于各基因编码区起始密
码子处设计正向引物，并于终止密码子处设计反向引物。依据引物设计的一般原则，使预设引物
序列长 20 ～ 25 bp。设计好的引物序列委托英潍捷基(上海)贸易有限公司 Invitrogen 采用普通脱
盐方式进行合成。各引物序列见表 2。
36第 2 期 吴伟怀等:剑麻斑马纹病菌多聚半乳糖醛酸酶 Szpg6 ～ Szpg10 基因的分子检测及其序列分析
表 1 35 个供试剑麻斑马纹菌株
Tab. 1 35 isolates of Phytophora nicotianae from sisal
电泳号 菌株 采集地 采集时间 电泳号 菌株 采集地 采集时间
1 PP2 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013 19 PP24 广东雷州金星农场 22 /10 /2013
2 PP3 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013 20 PP29 广东雷州东方红农场 04 /08 /2006
3 PP4 广东雷州金星农场 22 /10 /2013 21 PP30 海南昌江南迪农场 19 /04 /2010
4 PP5 广东雷州金星农场 22 /10 /2013 22 PP31 广东湛江东方红农场 04 /08 /2006
5 PP6 广东雷州金星农场 22 /10 /2013 23 PP32 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013
6 PP7 广东雷州金星农场 22 /10 /2013 24 PP34 海南省昌江南迪剑麻场 28 /08 /2009
7 PP8 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013 25 HJ － 8 广东湛江雷州火炬农场 10 /12 /2011
8 PP9 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013 26 桂南4 －1 广西博白桂南农场 04 /11 /2010
9 PP10 广东湛江徐闻五一农场 22 /10 /2013 27 CH0101 广西南宁山圩农场 20 /08 /2007
10 PP11 广东湛江徐闻五一农场 22 /10 /2013 28 CH0051 广东湛江东方红农场 05 /08 /2006
11 PP14 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013 29 CH0055 广东湛江东方红农场 05 /08 /2006
12 PP15 广东雷州金星农场 22 /10 /2013 30 CH0066 广东湛江雷州幸福农场 20 /08 /2006
13 PP16 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013 31 CH0088 广东湛江徐闻五一农场 20 /08 /2006
14 PP17 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013 32 CH0025 广东湛江东方红农场 04 /08 /2006
15 PP18 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013 33 CH0062 广东湛江雷州幸福农场 20 /08 /2006
16 PP20 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013 34 CH019 广东湛江东方红农场 04 /08 /2006
17 PP21 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013 35 CH0097 海南昌江剑麻场 30 /09 /2006
18 PP23 广东雷州东方红农场 22 /10 /2013
表 2 pppg6 ～ pppg10 基因编码区特异引物序列及相关信息
Tab. 2 Specific primer sequences based on pppg6 ～ pppg10 genes coding regions and related information
引物名称 引物序列 (5 － 3) 退火温度(℃) 预期大小(bp)
pppg6F /Ｒ
F:ATGAAGCTTCTCACCGCAG
Ｒ:TTAGCAGTTGACGCTGCTCGG
60 1092
pppg7F /Ｒ
F:ATGAAAGTCCTCGCCCTCACTATCC
Ｒ:TTAGCAGCTAATGCCACTAGGTTCA
63 1077
pppg8F /Ｒ
F:ATGAAGAACCTCTCCACCGC
Ｒ:TTAGCACTTGGCGGTGCTGG
62 1086
pppg9F /Ｒ
F:ATGAAGTTCGTCTACCCCGCC
Ｒ:TTAGCAGCCTACTCCACTCGG
60 1539
pppg10F /Ｒ
F:ATGAAGATCTTCGCACACTCTTTC
Ｒ:TTAGCACTGTACGTTGCTCGGTC
61 1176
1. 2. 4 PCＲ扩增及程序
每个 PCＲ反应体中，约含有 20 － 30 ng DNA 模板，10 μL 2 × EcoTaq PCＲ SuperMix，正反向引
物各 0. 5 μL(10. 0 μM) ，最后用 ddH2O补齐反应体系至 20 μL。通过 Mastercycler gradient Master-
cycler PCＲ扩增仪进行扩增，其程序为:94℃预变性 3 min;随后 94℃变性 30 s，60 ～ 65℃退火 30 s
(根据所用引物的 Tm值确定退火温度) ，72℃延伸 30 s，扩增 35 个循环;最后 72℃延伸 5 min，20℃
保存。PCＲ扩增产物在 1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，凝胶成像系统照相记录。
1. 2. 5 克隆与序列分析
取各基因 PCＲ 产物 4 μL 与 pEASYTM Cloning Vector 分别连接，转化大肠杆菌感受态细胞。
用含氨苄青霉素的 X － gal / IPTG /LB 平板进行蓝白斑筛选，并随即各挑取 5 个白斑，利用通用引物
46 中国麻业科学 第 38 卷
M13F /Ｒ进行菌落 PCＲ鉴定。经蓝白斑筛选后以及分子鉴定后，各选取 3 个阳性克隆子送英潍捷
基(上海)贸易有限公司 Invitrogen 公司测序。获得的序列经人工去除载体序列后，利用 DNAStar
进行序列拼接。利用 DNAStar software (www. DNAStar. com)进行序列拼接与相关分析。蛋白质序
列相似性分析则利用 http:/ /www. uniprot. org /uniprot /?query网站完成;蛋白质的理论等电点(The-
oretical isoelectric points，pI)和分子量(molecular weights，Mw)计算利用 Compute pI / Mw 工具
(www. expasy. ch / tools /pi_tool. html［14］)进行。
2 结果与分析
2. 1 Szpg6 ～ Szpg10 基因分子检测
5 对基因特异引物，分别对 35 个剑麻斑马纹病菌供试 DNA 进行检测。检测结果表明，5 对特
异引物在 35 个供试菌株 DNA 中均扩增出单一条带。换而言之，引物 pppg6F /Ｒ、pppg7F /Ｒ、pp-
pg8F /Ｒ等从 35 个目标菌中均检测出单一条带，其大小均略大于 1 kb，与预期大小比较一致(图 1A
－ C;仅列出部分数据，下同) ;而引物 pppg9F /Ｒ则从供试的 35 个模板中检测出约 1. 5 kb的特异条
带(图 1D)。与前 4 对引物结果相似，引物 pppg10F /Ｒ也从供试的 35 个菌株 DNA中检测出与预期
大小一致的特异条带(数据未列出)。由此推测，Szpg6 ～ Szpg10 基因在剑麻斑马纹病菌菌中是普
遍存在的。
M:DNA 分子标记 DL2000;1 ～ 24:为电泳号。A，Szpg6 基因分子检测;B，Szpg7 基因分子检测;C，Szpg8 基因
分子检测;D，Szpg9 基因分子检测
图 1 Szpg6 ～ Szpg9 基因的分子检测
Fig. 1 Molecular detection of Szpg6 ～ Szpg9 genes
2. 2 Szpg6 ～ Szpg10 编码区基因结构及其序列比较分析
通过对各基因的 cDNA序列与 gDNA序列分析表明，Szpg6 基因完整 OＲF为 1092 bp，在第 266
处核苷酸处存在一个 67 bp 的内含子。推断基因产物由 363 个氨基酸残基组成，估计等电点为
5. 44，分子量 3. 75 kDa。与寄生疫霉 PG基因 pppg6 的序列相比，Szpg6 基因在编码区存在 1 个同
义核苷酸突变，其氨基酸序列一致性水平为 100%(图 2A)。
Szpg7 基因完整 OＲF为 1077 bp，推断基因产物由 358 个氨基酸残基组成，估计等电点为 4. 04，
分子量为 3. 71 kDa。与寄生疫霉 PG基因 pppg7 的序列相比，Szpg7 基因在编码区存在 3 个核苷酸
差异，且均为非同义突变，最终导致 S19P、S27P、G345D等 3 处氨基酸变化，其氨基酸序列一致性水
平为 99. 16%(图 2B)。
Szpg8 基因完整 OＲF为 1086 bp，推断基因产物由 361 个氨基酸残基组成，估计等电点为 9. 54，
分子量为 3. 74 kDa。与寄生疫霉 PG基因 pppg8 的序列相比，在 Szpg8 基因编码区存在 1 个核苷酸
差异，且为同义突变，其氨基酸序列一致性水平为 100% (数据未显示)。
Szpg9 基因完整 OＲF为 1539 bp，推断基因产物由 512 个氨基酸组成，估计等电点为 4. 00，分
子量 5. 20 kDa。与对应寄生疫霉 PG基因 pppg9 的序列相比存在 6 个核苷酸差异，其中 5 处为非同
义突变，其氨基酸序列一致性水平为 99. 02%。最终导致 L246P、G367S、V406I、D454V以及 M490T
56第 2 期 吴伟怀等:剑麻斑马纹病菌多聚半乳糖醛酸酶 Szpg6 ～ Szpg10 基因的分子检测及其序列分析
等 5 处氨基酸变异(图 2C)。
Szpg10 基因完整 OＲF为 1176 bp，在第 349 bp核苷酸处存在一个 66 bp的内含子，推断基因产
物由 391 个氨基酸组成，估计分子量 4. 13 kDa，等电点为 5. 23。与 pppg10 基因的序列相比，Szpg10
基因在编码区存在 4 个核苷酸变异，其中 3 处为非同义突变，其氨基酸序列一致性水平为
99. 23%。最终导致 V129D、I174V、D345G等 3 处氨基酸变异(图 2D)。
总之，来自剑麻斑马纹病菌 Szpg6 ～ Szpg10 基因编码区序列与寄生疫霉 PG基因 pppg6 ～ pp-
pg10 对应基因之间同源性十分高，对应氨基酸序列一致性均在 99%以上。
图 2A Szpg6 基因与 pppg6 基因之间推定氨基酸序列比较
图 2B Szpg7 基因与 pppg7 基因之间推定氨基酸序列比较
图 2C Szpg9 基因与 pppg9 基因之间推定氨基酸序列比较
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图 2D Szpg10 基因与 pppg10 基因推定氨基酸序列比较
图 2 推定氨基酸序列比较
Fig. 2 Putative amino acid sequences alignment
3 讨论
近年来，已从不同植物病原菌中分离出多种 PG，并对其生化特性等进行了较为详尽地研究。
综观现有研究结果，针对 PG在致病过程中的作用主要存在如下几类观点，一是认为 PG 作为一种
致病因子，在侵染寄主过程中起着非常重要的作用［15］。然而，通过生物技术与遗传操作技术使 PG
基因突变并非总是证明 PG在真菌致病过程中的作用是必需的［16 － 17］。除此之外，也有研究结果支
持 PG除了作为细胞壁降解酶与毒性因子之外，还可以通过释放寡聚半乳糖醛酸作为一种无毒因
子，从而激发寄主的防御反应［18］。对于上述“矛盾”的结果而言，一个合理的解释即 PG 基因在真
菌中存在多基因家系，即在侵染过程中，每个基因仅执行一个有限的生物学功能［13］。事实也已证
明，目前已经鉴定的许多致病真菌的 PG 基因，其都不是单基因，而是以多基因的形式存在。最近
的研究表明，引起灰霉病的灰葡萄病菌中，至少包含 6 个编码 PG 的基因，只是在与寄主互作过程
中具有不同表达或是其生长需要不同的碳源［19 － 20］。而菌核病菌能分泌多种不同表达模式的 en-
doPG。其中在健康植株组织中 sspg1 (Sclerotinia sclerotiorum polygalacturonase 1) ，sspg2、sspg3 被上
调，sspg5 则是在最后侵渍阶段被诱导;相比之下，sspg6 与 sspg7 在整个侵染过程中稳定表达［21 － 22］。
总之，endoPG基因往往以簇形式存在，其成员也具有不同功能。
目前，研究结果表明，寄生疫霉 endoPG基因事实上为一个多基因家系，除了 pppg1 之外，至少
还包含 pppg2 ～ pppg10 等 9 个基因［12 － 13］。本研究利用同源法对剑麻斑马纹病菌中细胞壁降解霉
基因 Szpg6 ～ Szpg10 的编码区进行了分子检测以及序列比较分析。实验结果表明，细胞壁降解霉
基因 Szpg6 ～ Szpg10 在剑麻斑马纹病菌中普遍存在，其基因序列与寄生疫霉 pppg6 ～ pppg10 对应
基因序列具有高度的相似性，其氨基酸序列一致性均在 99%以上。结合先前已报道的剑麻斑马纹
Szpg1 ～ Szpg5 的结果［23］，由此可见，在剑麻斑马纹病菌中至少存在由 10 个基因组成的细胞壁降解
霉基因家系。
根据已有的表达实验表明，寄生疫霉基 pppg7 于本生烟表达 10 天后显示轻微银叶症状，而 pp-
pg10 则导致本生烟叶产生明显的黄化与矮小 ［13］。在本研究中，除 pppg6 与 pppg8 之外，在 Szpg7、
Szpg9 及 Szpg10 基因与对应基因之间均存在核苷酸差异。分别到达了 3、6 及 3 个，其中 3、5 及 3
个为非同义突变。这些推定氨基酸的变异，是否导致功能上的变化还有待进一步地实验。
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