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剑麻斑马纹病菌5个多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆与序列分析



全 文 :植物细胞壁是寄主与病原菌互作的重要场所,
病原菌定殖于寄主表面后只有穿透细胞壁的屏障并
与之建立了寄生关系, 才能表现出致病性, 在此过
程中细胞壁降解酶发挥了极其重要的作用 [1]。 而由
植物病原菌分泌的细胞壁降解酶主要包括多聚半乳
糖醛酸酶(Polygalaturonase, PG)、 果胶裂解酶、 果
热带作物学报 2015, 36(12): 2204-2209
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2015-05-17 修回日期 2015-07-06
基金项目 海南省自然科学基金项目(No. 314105); 国家麻类产业技术体系建设专项资金(No. CARS-19); 中国热带农业科学院环植所自主选
题项目(No. 2013hzsJY04); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(No. 2014hzs1J012)。
作者简介 吴伟怀(1977年—), 男, 博士, 副研究员; 研究方向: 植物病理; *通讯作者(Corresponding author): 贺春萍(HE Chunping), E-mail:
hechunppp@163.com; 易克贤(YI Kexian), E-mail: yikexian@126.com。
剑麻斑马纹病菌 5个多聚半乳糖醛酸酶
基因的克隆与序列分析
吴伟怀 1, 梁艳琼 1, 郑金龙 1, 习金根 1, 郑肖兰 1, 李 锐 1,
刘巧莲 2, 张驰成 3, 贺春萍 1*, 易克贤 1*
1
中 国 热 带 农 业 科 学 院 环 境 与 植 物 保 护 研 究 所
农业部热带农林有害生物入侵检测与控制重点开放实验室
海 南 省 热 带 农 业 有 害 生 物 检 测 监 控 重 点 实 验 室
海南海口 571101
2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南海口 571101
3 海南大学环境与植物保护学院, 海南海口 570228
摘 要 以寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶 pppg1~pppg5 等 5 个基因 cDNA 序列为参考, 设计基因编码区特异性
引物。 利用 5 对引物分别对剑麻斑马纹病菌进行分子检测以及基因同源克隆。 通过此方法首次从剑麻斑马纹病
菌中获得了 5 个多聚半乳糖醛酸酶基因, 并分别命名为 Szpg1~Szpg5。 检测结果表明, Szpg1~Szpg5 基因普遍存
在于被检测剑麻斑马纹病菌中。 序列分析结果表明, Szpg1~Szpg5 基因与 pppg1~pppg5 对应基因之间存在核苷酸
序列差异, 由此导致个别氨基酸的差异, 甚至提前终止。 由此推测, Szpg1~Szpg5 基因与 pppg1~pppg5 在功能上
可能存在着一定的差异。
关键词 剑麻斑马纹病; 多聚半乳糖醛酸酶; 基因克隆
中图分类号 S432.4; Q78 文献标识码 A
Cloning and Sequence Analysis of Five Polygalacturonase
Genes of Phytophora nicotianae in Sisal
WU Weihuai1, LIANG Yanqiong1, ZHENG Jinlong1, XI Jingen1, ZHENG Xiaolan1,
LI Rui1, LIU Qiaolian2, ZHANG Chicheng3, HE Chunping1*, YI Kexian1*
1 Environment and Plant Protection Institute, CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control
of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests / Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical
Agricultural Pests, Haikou, Hainan 571101, China
2 Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology, CATAS, Haikou, Hainan 571101, China
3 College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou, Hainan, 570228, China
Abstract Sisal zebra disease caused by Phytophora nicotianae var. parasitica is a kind of main diseases which
cause serious damage to the sisal. In this study, five specific primer pairs were designed in coding region based
on the reference sequence of pppg1 to pppg5 gene from Phytophora parasitica. Five specific primer pairs were
used for the molecular detection and gene cloning from sisal zebra pathgoen DNA. This is the first time from sisal
zebra isolating five polygalacturonase genes through this method, and respectively designated as Szpg1 to Szpg5.
The detecting results showed that Szpg1 to Szpg5 genes were widely distributed in the sisal zebra isolates.
Sequence analysis results showed that there were sequence differences between Szpg1 to Szpg5 and pppg1 to
pppg5, respectively, leading to some amino acid differences, and even early termination. Thus it is speculated that
Szpg1 to Szpg5 genes may exist a certain differences in function. This research would lay a solid foundation for
the further study of sisal zebra germs polygalaturonase role in the pathogenic process.
Key words Sisal zebra disease; Polygalaturonase; Cloning
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.016
第 12 期 吴伟怀等: 剑麻斑马纹病菌 5个多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆与序列分析
表 1 12 个供试剑麻斑马纹菌株
Table 1 12 isolates of Phytophora nicotianae from sisal used in this study
序号 菌株 采集地 采集时间 序号 菌株 采集地 采集时间
1 ND-12 海南省昌江南迪剑麻场 2009-08-28 7 CH0101 广西南宁山圩农场 2007-08-20
2 CH0025 广东湛江东方红农场 2006-08-04 8 HJ-8 广东湛江雷州火炬农场 2011-12-10
3 CH0051 广东湛江东方红农场 2006-08-05 9 CH0062 广东湛江雷州幸福农场 2006-08-20
4 CH0055 广东湛江东方红农场 2006-08-05 10 CH019 广东湛江东方红农场 2006-08-04
5 CH0066 广东湛江雷州幸福农场 2006-08-20 11 CH0097 海南昌江剑麻场 2006-09-30
6 CH0088 广东湛江徐闻五一农场 2006-08-20 12 桂南 4-1 广西博白桂南农场 2010-11-04
胶甲基酯酶和 β-半乳糖苷酶, 其中 PG 在致病力
和细胞壁降解酶中起着最为重要的作用 [2]。 已有研
究结果表明, PG 在植物病原菌侵染寄主过程中
降解果胶, 为病原菌顺利与寄主建立寄生关系奠
定基础, 是重要的致病因子之一。 如当黄曲霉菌
(Aspergillus flavus)内源多聚半乳糖醛酸酶基因 pecA
表达时, 有利于病原菌在棉桃中的侵入与传播 [3]。
BcPG1(Botrytis cinerea polygalacturonase 1)基因突变
后能导致灰葡萄菌(Botrytis cinerea)对寄主植物的
毒性减弱[4]。 而侵染柑橘果实的链格孢菌(Alternaria
citri)的内切 PG 基因突变后在柑橘类与马铃薯组织
中产生黑腐症状的能力明显地减弱 [5]。 与之相似,
由突变而产生的内切 PG 基因活性丧失的麦角菌
(Claviceps purpurea)突变菌株几乎对黑麦不致病[6]。
由烟草疫霉(Phytophora nicotianae var. parasitica
或 Phytophora parasitica var. nicotianae)引起的剑麻
斑马纹病(Sisal zebra disease)是一种严重危害剑麻
的主要病害。 如遇高温多雨季节容易发生病害流
行, 造成植麻区麻田早期大量缺株, 严重影响剑麻
产业的发展。 该病曾于 1973年在我国暴发并流行,
成为剑麻生产影响最大的病害。 虽然该病目前得到
了有效控制, 但是在高温多雨季节仍可爆发成灾。
前期, 国内外对于剑麻斑马纹病菌的研究主要集中
在该菌的致病性分化、 生物学特性以及防治药剂
等研究方面, 而没有从 PG 这个关键的致病酶着手
的研究报道。 目前, 已从寄生疫霉菌(Phytophora
parasitica)中克隆了 pppg1~pppg10共 10个 PG基因[7-8]。
这为研究剑麻斑马纹病菌中的 PG 基因提供了方
便。 为此, 本研究以这些基因序列为参考序列设计
基因特异引物, 对剑麻斑马纹病菌中 PG 基因进行
了克隆(命名为Szpg)与测序; 为下一步研究剑麻斑
马纹病菌 PG 对剑麻致病过程中的作用奠定基础。
本研究中即报道了 Szpg1~Szpg5 等 5 个基因的克隆
与序列分析工作。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
本研究中用于分子检测的 12 个剑麻斑马纹病
菌分别收集自广东、 广西、 海南等剑麻种植区。 其
中广东菌株 8 个, 广西菌株 2 个, 海南菌株 2 个。
菌株现保存于中国热带农业科学院环境与植物保护
研究所。 其具体相关信息见表 1。
1.2 方法
1.2.1 菌丝体收集及 DNA 提取 利用马铃薯葡
萄糖液体培养基对各供试菌株进行摇菌, 28 ℃,
160 r/min 培养 6 d 后, 对菌丝体进行收集。 收集的
各菌丝体迅速于液氮中研磨, 后进行基因组 DNA
提取 。 DNA 提取采用 DNA 提取试剂盒 (E.Z.N.A
Fungal DNA kit, Omega 公司, 美国)提取, 具体实
验步骤参考其说明书进行。
1.2.2 RNA 的提取及 cDNA 的合成 在马铃薯葡
萄糖液体培养基培养剑麻斑马纹病原菌菌株 6 d
后, 收集菌丝体并立即进行总 RNA 提取。 总 RNA
抽提按 TRIzol试剂盒(Gibco-BRL)操作方法进行。 利
用反转录试剂盒 SuperscriptTM III Reverse Transcriptase
(Invitrogen)进行 cDNA的反转录合成。
1.2.3 引物设计 以寄生疫霉 PG 基因 pppg1
(AY697926)、 pppg2(EU041943)、 pppg3(EU041944)、
pppg4(EU041945)、 pppg5(EU041945)为参考序列 [7-8],
利用软件 primer5.0 于各基因启始密码子位置设计
正向引物, 而于终止密码子处设计反向引物, 使扩
增产物包含完整的编码区。 用于对 gDNA 与 cDNA
的扩增与克隆。 设计引物参考下列原则: 引物一般
要求 GC 含量 40%~65%, Tm值 55~65 ℃, 引物序
列长 18~25 bp, 且无错配、 不形成二聚体和发夹
结构等。 设计好的引物委托英骏生物技术有限公司
合成。 具体引物序列见表 2。
1.2.4 PCR 扩增及反应条件 基因组 PCR 反应
体系为 20 μL, 含有 20~30 ng DNA 模板, 10 μL
2×EcoTaq PCR SuperMix, 上下游引物各 0.5 μL
(10.0 μmol/L), 最后以 ddH2O 补齐。 PCR 反应在
Mastercycler gradient Mastercycler PCR 扩增仪上进
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第 36 卷热 带 作 物 学 报
表 2 pppg1~pppg5 基因编码区特异引物序列及相关信息
Table 2 Spefic primer pair sequences, expected amplicon length and annealing temperature used in this study
引物名称 引物序列(5′-3′) 预期产物大小/bp 参考序列
pppg1F/R F: ATGAAGCTCTTCAAGTCCACTCTCR: TTAGCACTGCACGTTGCTCGG 1 227 AY697926
pppg2F/R F: ATGAAGTTTCTCTCCACCGCR: CTACACGTCGAGGCTGTTGGGTTG 1 143 EU041943
pppg3F/R F: ATGAAGTTTCTCTCCACCGCR: CTACACGCTAACGCTGTTGGGC 1 143 EU041944
pppg4F/R F: ATGAAGCTCCTGTCCGCCGTR: TTAGCAGTCAATGCTGCTGGGCT 1 089 EU041945
pppg5F/R F: ATGAAGCTCTTCACGTCAACTCTCGR: TTAACAAGTGATACCATTCGGCTG 1 083 EU041945
行, 扩增程序为: 94℃预变性 3 min; 随后 94 ℃变
性 30 s, 60 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 min, 扩增 35
个循环; 最后 72℃延伸 5 min, 20 ℃保存。 PCR 扩
增产物在 1%的琼脂糖凝胶上进行电泳, 紫外灯下
照相并保存。 cDNA PCR 扩增参照基因组体系及条
件, 扩增所使用的高保真酶购自北京全式金生物技
术有限公司。
1.2.5 克隆与序列分析 以菌株 ND-12 DNA 为
模板, 分别回收各基因的 gDNA 与 cDNA 扩增子,
各取 4 μL 与 pEASYTM Cloning Vector 连接, 转化
大肠杆菌感受态细胞, 经蓝白斑筛选后, 各选取 3
个阳性克隆送英骏生物技术有限公司测序。 获得的
序列经人工去除载体序列后 , 利用 DNAStar
software(www.DNAStar.com)进行序列拼接与相关分析。
蛋白质序列相似性分析利用 http://www.uniprot.org/
uniprot/?query 网站完成 ; 蛋白质的理论等电点
(Theoretical isoelectric points, pI)和分子量(molecular
weights, Mw)计算利用Compute pI/ Mw工具 (www.
expasy.ch/tools/pi_tool.html[9])进行。
2 结果与分析
2.1 Szpg1~Szpg5基因分子检测
利用所设计的 5个基因特异引物对, 分别以剑
麻斑马纹病菌菌株 DNA 为模板进行扩增。 结果 5
对引物分别从 12个供试菌株中均扩增出目标条带。
具体而言, 引物 pppg1F/R 从 12 个菌株中均扩增出
特异条带, 其大小位于 1~2 kb 之间(图 1-A); 引
物 pppg2F/R 和 pppg3F/R 也均从 12 个模板中扩增
出目标条带, 大小均与预期比较相似, 约为 1.1 kb
(图 1-B; Szpg2 基因分子检测图未列出); 而引物
pppg4F/R 和引物 pppg5F/R 从 12 个供试菌株中扩
增出 1 条比 1 kb 大的单一条带(图 1-D)。 由此表
明, Szpg1~Szpg5 基因在 12 个剑麻斑马纹病菌菌中
是普遍存在的。
2.2 Szpg1~Szpg5基因编码区分析
利用 5 对引物分别扩增菌株 ND-12 的 gDNA
与 cDNA。 结果表明 , 5 对引物均从 cDNA 与
gDNA 中扩增出条带, 而且来自 cDNA 的与其对应
gDNA 的扩增子大小无明显差异(图 2)。
2.3 Szpg1~Szpg5基因编码区序列分析及分子特征
对获得的各基因的 cDNA 序列与相应基因组序
列作比较。 序列分析结果表明, 通过引物 pppg1F/R
获得了 1 227 bp 的序列, 含有 348、 828 bp 等 2 个
外显子以及 1 个 51 bp 的内含子。 ORF Finder 软
件分析发现, 完整 ORF 为 1 176 bp, 命名为 Szpg1
(依次类推)。 推断基因产物由 391个氨基酸残基组
成 , 估计分子量为 4.17 ku, 等电点 (pI)为 5.57。
与寄生疫霉 PG 基因 pppg1 的序列相比, Szpg1 基
因在编码区存在 3个核苷酸差异, 其中一个为非同义
突变(图 3-A), 其氨基酸序列一致性水平为 99%。
通过引物 pppg2F/R 获得了 Szpg2基因 1 155 bp
序列, 预测为 1个连续完整的 ORF, 编码 384个氨
基酸, 估计分子量为 3.99 ku, 等电点(pI)为 9.17。
与 pppg2 的序列相比, Szpg2基因编码区存在 30多
个核苷酸差异, 最终导致 24 个氨基酸的差异, 其
氨基酸序列一致性水平为 93%(图 3-B)。
利用引物 pppg3F/R 获得了 Szpg3 1 155 bp 的
基因序列, ORF Finder 软件分析发现为 1 个连续
完整的 ORF, 编码 384 个氨基酸, 估计分子量为
3.98 ku, 等电点(pI)为 9.25。 与 pppg3 的序列相
比, Szpg3 在编码区存在 18 个核苷酸差异, 以及
12 个核苷酸插入。 最终导致 14 个氨基酸的差异
(图 3-C), 其氨基酸序列一致性水平为 96%。
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第 12 期 吴伟怀等: 剑麻斑马纹病菌 5个多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆与序列分析
通过引物 pppg4F/R获得了 1 089 bp 的 Szpg4 基
因序列, 为 1个连续完整的 ORF, 编码 362个氨基
酸 , 估计分子量为 3.73 ku, 等电点 (pI)为 6.71。
与 pppg4 的序列相比存在 5 个核苷酸差异, 其中 1
个为非同义突变(图 3-D), 其氨基酸序列一致性水
平为 99%。
通过引物 pppg5F/R获得了 Szpg5基因 1 083 bp
的序列, 与 pppg5 的序列相比, Szpg5 其核苷酸序
列存在 7 个核苷酸的差异。 值得一提的是, 在第
73 位的核苷酸的突变(C73T), 与第 74 及 75 位核
苷酸 AA, 形成了一个终止子, 导致提前终止。 由
此推测, 该基因并不具有正常功能(数据未列出)。
总之, 来自剑麻斑马纹病菌 Szpg1 至 Szpg5 基
因中, 除 Szpg1 中含有 1 个 51 bp 的内含子外, 其
余基因并无内含子。 其编码区序列与寄生疫霉 PG
基因 pppg1~pppg5 对应基因之间存在核苷酸差异,
尤其是 Szpg2 与 Szpg3 基因。 此外, Szpg5 基因由
于单核苷酸的突变从而导致提前终止。
图 1 Szpg1~Szpg5 基因在剑麻斑马纹病菌中的存在情况
Fig. 1 Distribution of the Szpg1 to Szpg5 of Phytophora nicotianae in sisal
A, Szpg1 基因分子检测 B, Szpg3 基因分子检测
2
kb
1
C, Szpg4 基因分子检测 D, Szpg5 基因分子检测
2
kb
1
A~E: 依次为 Szpg1、 Szpg2、 Szpg3、 Szpg4、 Szpg5 基因; M: DL 2 000; 泳道 1: gDNA; 泳道 2: cDNA。
图 2 Szpg1~Szpg5 基因 gDNA 与 cDNA PCR 扩增产物电泳
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis for gDNA and cDNA of Szpg1 to Szpg5 genes
A B C D E
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第 36 卷热 带 作 物 学 报
图 3 推定氨基酸序列比较
Fig. 3 Putative amino acid sequences alignment
Szpg1 基因与 pppg1 基因之间推定氨基酸差异比较
Szpg2 基因与 pppg2 基因之间推定氨基酸差异比较
Szpg3 基因与 pppg3 基因之间推定氨基酸差异比较
Szpg4 基因与 pppg4 基因之间推定氨基酸差异比较
A
B
C
D
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第 12 期
3 讨论与结论
近年来, 国际上有关卵菌 PG 基因族的研究已
有一些报道。 目前, 研究卵菌多聚半乳糖醛酸酶
基因比较多的是樟疫霉(P. cinnamomi)与致病疫霉
(P. infestans)和寄生疫霉 (P. parasitica)。 对于卵
菌的第一个内切 PG 基因 pipg1 则是从马铃薯晚疫
病菌致病疫霉分离到的, 该基因编码的内切多聚
半乳糖醛酸酶具有致病活性 [10]。 此外, 对樟疫霉
(Phytophthora cinnamomi)致病菌 PG 基因家族的
研究, 发现受试致病性菌的 PG 基因家族组成较
大, 含有 19 个 pg 基因(Pcpg1~Pcpg19), 其中除
Pcpg5、 Pcpg18、 Pcpg13 等 3 个基因外, 其余的多
个基因间具有明显的网络关系, 并且发现关键 pg
基因编码的蛋白质一级结构的主要结构基团的修饰
特性与 PG 致病活性密切相关 [11]。 而巩振辉等 [12-14]
又对其若干个 pg 基因的遗传转化进行了研究, 发
现 pg 基因均能指导合成相应的 PG 酶, 并具有不
同的活性。 并同时发现其中编码该酶的具有不同程
度糖基化的 pg 基因对该酶的致病性起着至关重要
的作用。 与之相似, 寄生疫霉内切 PG 基因事实上
是一个多基因家系, 除了 pppg1 之外 [7], 至少还包
含 pppg2~pppg10等 9个基因[8]。
尽管目前已从多种病原菌中分离到了多聚半乳
糖醛酸酶基因, 但在剑麻斑马纹病菌中分离还未见
报道。 本研究利用同源克隆法首次对剑麻斑马纹病
菌中细胞壁降解霉基因 Szpg1~Szpg5 的编码区进行
了分子检测以及克隆及序列比较分析。 通过本实验
表明它们在剑麻斑马纹病菌中普遍存在, 除 Szpg5
基因由于变异而提前终止外, 其余 Szpg1~Szpg4 基
因与寄生疫霉 pppg1~pppg4对应基因序列具有高度
的相似性, 其氨基酸序列一致性均在 90%以上。
除此之外, 基因之间也存在不少核苷酸变异, 甚至
有些是非同义突变, 究其原因可能是病原菌为适应
不同寄主、 环境而进化的结果。 事实上, 在基因与
寄主之间的共进化中, 病原菌在面对寄主强大的选
择压时, 导致了病原包括基因点突变、 基因缺失等
多种变异[15-16]。
根据已有的表达实验表明, 寄生疫霉基 pppg2
能导致本生烟明显的黄花与矮小; pppg4 基因本生
烟上产生矮化表型; 而 pppg5基因使本生烟产生银
叶以及叶肉细胞严重变形 [8]。 在氨基酸水平上, 来
自剑麻斑马纹病菌 Szpg1~Szpg4(Szpg5提前终止)与
寄生疫霉基因 pppg1~pppg4 之间在存在一些差异。
这些氨基酸的差异, 是否导致功能上的变化还有待
进一步研究。
参考文献
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责任编辑: 沈德发
吴伟怀等: 剑麻斑马纹病菌 5 个多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆与序列分析 2209- -