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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
荧光蛋白报告基因在植物寄生真菌研究中的应用
高必达 钟杰 赵慧茹
(湖南农业大学植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，长沙 410128)
摘 要: 综述菌根真菌、植物内生菌和植物病原真菌等植物寄生真菌转荧光蛋白基因研究现状。介绍转化载体的构
建、转化方法及转基因的检测方法，以及转荧光蛋白基因技术在植物寄生真菌侵染过程研究中的应用，指出真菌转荧光蛋白
基因存在的问题和展望。
关键词: 真菌 荧光蛋白 转基因
Application of Fluorescence Protein Reporter Gene in
Research of Plant Parasitic Fungi
Gao Bida Zhong Jie Zhao Huiru
(Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests，Hunan Agricultural University，Changsha 410128)
Abstract: This article were reviewed progress in the transformation of plant parasitic fungi，such as mycorrhizal fungi，endophytic
fungi and plant pathogenic fungi with fluorescent protein genes，with emphasis on the construction of vectors，methods of transformation，
detection of transgenes，and the application of the fluorescent protein markers in the study of infection process of the plant pathogenic
fungi． Finally the existing problems and future interests were also discussed．
Key words: Fungus Fluorescence protein Transgenic
收稿日期:2011-04-27
基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项(200903039)
作者简介:高必达，男，博士，教授，研究方向:分子植物病理学;E-mail:bdgao@ yahoo． com． cn
1992 年，下村修首次报告从一种水母(Aequorea
victoria)中分离出一种在紫外线下会发出明亮绿光
的蛋白，将其命名为绿色荧光蛋白 GFP;1994 年，
Chalfie报告导入 GFP 基因使秀丽隐杆线虫的 6 个
单独细胞有了颜色［1］;钱永健探明了 GFP发出荧光
的机制，并拓展出可用于标记的其他颜色，他们同为
2008 年的诺贝尔化学奖获得者。
近年来真菌转荧光蛋白基因已成为一个研究热
点，从酵母菌、食用和药用担子菌、非致病植物寄生
真菌(菌根真菌和内生菌)、生防真菌到植物病原真
菌均有报道。酵母菌转荧光蛋白基因主要用于一些
基础研究，如研究生物传感器［2］，基因的表达调控
和基因功能［3，4］，蛋白质在细胞内定位、表达和互
作［5 － 7］以及染色体的遗传物质［8］。另外，在银
耳［9］、双孢蘑菇和灰盖鬼伞［11］高等担子菌的高价值
外源蛋白质生产等方面也有研究报道［9］。荧光蛋
白基因在植物寄生真菌研究上的应用报道也日渐增
多，现综述如下。
1 植物寄生真菌转荧光蛋白基因的方法
近年来植物寄生真菌转荧光蛋白基因已有 10
余篇报道(表 1) ，使用的技术包括农杆菌介导转化
法(ATMT)、原生质球转化法(ST)和电击转化法
(EP) ;使用的荧光蛋白基因有绿色荧光蛋白基因
GFP、EGFP、SGFP和红色荧光蛋白基因 DsRed;启动
子多来自真菌，如来自构巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脱
氢酶基因的启动子 gpd 和构巢曲霉色氨酸合成基因
trpC的启动子 PtrpC。载体一般以各种真菌转化载体
为骨架插入荧光蛋白表达框构建而成，如 Pct74、
PCBCT［12］、Psk1019［13］、pBHt2-GFP［14］ 和 pCAM-
BIA1304-RCKK［15］等，一些载体为不能在真菌内独
立复制的整合性载体。
关于转化子的筛选检测，第一步，根据质粒上携
2011 年第 9 期 高必达等:荧光蛋白报告基因在植物寄生真菌研究中的应用
表 1 植物寄生真菌转荧光蛋白基因的代表性例子
被转化菌
表达框
荧光蛋白基因 启动子 终止区
载体 转化方法 参考文献
Cadophora finlandia SGFP ToxA-P Nos-T PCBCT ATMT ［12］
Muscodor albus EGFP chGPD Psk1019 ATMT ［13］
Colletotrichum acutatum GFP gpdA TrpC pBHt2-GFP ATMT ［14］
White-rot fungi GFP GPD polyA pCAMBIA1304-RCKK ATMT ［15］
Arbuscular mycorrhizal
Glomus intraradices
GFP gpd pNRGFP ST ［23］
mycorrhizal fungal EGFP Pgpd trpC pGPD-EGFP ST ［25］
Fusarium oxysporum
f． sp． cubense
GFP ToxA Nos-T Pct74 ST ［30，34］
non-pathogenic
Fusarium oxysporum
DsRed PgpdA trpC pPgpd-DsRed ST ［36］
Aspergillus flavus EGFP gpdA nmt-1 gpd-EGFP ST ［37］
Sclerotinia sclerotiorum GFP PtrpC TrpC pPGT ST ［43］
Colletotrichum GFP gpd gGFP EP ［52］
注:ATMT． Agrobacterium tumefacens mediated transformation;ST． spheroplast transformation;EP． electroporation;gpd． gpd promoter fromAspergillus nidu-
lans;ToxA． ToxA promoter from Pyrenophora tritici-repentis PtrpC． PtrpC promoter Aspergillus nidulans
带的耐药性基因进行抗生素筛选;其次，用 PCR 法
验证是否有外源基因的插入。荧光蛋白基因插入的
拷贝数与转化子的稳定性和荧光强度有关，拷贝数
用 Southern杂交检测，转录用 RT-PCR 法检测，对于
转荧光标记基因的表达的检测，直接用荧光灯照射
菌落，或者挑取菌丝于载玻片，用激光共聚焦荧光扫
描显微镜观察，选择相应的激发波长，如绿色荧光蛋
白转化子选择 488 nm激发波长，515 － 530 nm 发射
波长。红色荧光蛋白转化子选择 530 － 550 nm 激发
波长，560 － 615 nm 发射波长，以观察其荧光强度。
需注意的是经过抗生素抗性筛选的转化子不一定都
表达荧光蛋白［16］。除此之外，还要根据用途选择我
们需要的转化子，如用于病原菌侵染途径研究的转
化子，并需经过生长特性，致病性测验，选择与野生
型比较无差异的转标记基因的病原菌用于后续
研究。
2 荧光蛋白基因在植物寄生真菌研究上的
应用
2． 1 在菌根真菌和内生菌研究上的应用
菌根真菌和内生真菌与宿主植物之间是一种互
利共生的关系。菌根真菌一方面从寄主植物中吸收
有机物质作为自己的营养，另一方面又从土壤中吸
收养分和水分供给植物。内生真菌其生活史的部分
阶段或者整个生活史均生活在宿主植物体内，且不
引起明显发病症状［17］。拮抗内生真菌常用于生物
防治研究。
菌根真菌和内生菌在植物上的定殖、扩散和生
存竞争能力已被看作生防作用的重要指标［18，19］，所
以常用荧光蛋白标记基因作为一种直观动态有效的
手段，来观察真菌定殖与互作机制［20］，如关于内生
真菌是怎样穿透植物的根，怎样在根部定殖，以及真
菌的营养方式包括各自的控制基因以及其表达规律
等，动态地观测真菌与寄主建立共生系统的过程，真
菌与共生寄主互作及对环境因子应答的特殊基因的
功能，以及观测菌根真菌或内生真菌与环境中其他
菌根真菌或病原菌的作用和研究等。Von der Weid
等［21］曾使用绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的细菌来
研究其与菌根真菌的相互作用。Mrosk等［22］以含有
红色荧光标记基因 DsRed 的载体转化菌根真菌，通
过观察转化菌株在野生型茎叶和转基因根组成的复
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合植物以及野生型植物的菌根化率，外观和发育阶
段的相同性证明两种植物与菌根真菌的互作方式相
同。Helber等［23］将红色荧光 DsRed 和绿色荧光蛋
白 GFP的基因分别以及共同与构巢曲霉转录因子
StuA核定位信号序列融合，转化到丛枝内生菌根菌
(Glomus intraradices)中，获得了分别带有 GFP 基因
和 DsRed基因以及共同带有 GFP 和 DsRed 的转化
子，发现导向核基因的两个标记基因都可以可视化。
Abello等［23］用农杆菌介导法将 GFP 基因转化进 A．
implicatum，观察了转化体在接种后的臂形草组织中
表达。Martino等［25］首次报告了似欧石南属植物菌
根真菌转荧光蛋白基因。Murata 等［26］利用农杆菌
介导法将红色荧光蛋白基因首次在 Suillus 属表达，
并阐述其在共生遗传分析中的作用。
2． 2 荧光蛋白基因在植物病原真菌研究上的应用
近年来，真菌转荧光蛋白基因已有成功的例子。
沈卫锋等［27］通过构建以绿色荧光蛋白(gfp)为报告
基因，以潮霉素(hph)为抗性筛选标记的载体 pK-
PG，成功获得了能表达绿色荧光蛋白的重组灰葡萄
孢菌。杨雷等［28］用绿色荧光蛋白基因转化了核盘
菌菌丝获得稳定遗传表达绿色荧光的转化子。张欣
等和 Visser等［29，30］用 PEG介导转化系统，将绿色荧
光蛋白基因成功地转化入香蕉枯萎病菌。Nizam
等［31］用农杆菌介导法将分别含 EGFP 和 DsRed 的
质粒转入鹰嘴豆褐斑病菌，获得了荧光蛋白基因稳
定表达的转化子。de Silva 等［32］通过 PEG-原生质
体法获得核盘菌绿色荧光蛋白转化子用于研究其再
在不同寄主上的致病性。Dombrowski 等［33］用电击
法将绿色荧光蛋白基因转入稻一柱香菌。
荧光蛋白基因已经应用于单种真菌侵染过程，
多种真菌复合侵染过程、侵染过程中相关基因的表
达、定量检测植物组织中病原物的数量和侵染过程
中寄主植物抗性反应等方面的研究。
2． 2． 1 研究单种真菌的侵染过程 传统的病原菌
侵染过程研究方法是在不同时期接种观察发病情
况，在组织不同部位分离病原物，经组织染色观
察［34］，以及从不同部位提取 DNA 进行 PCR 检测
等。这些方法也有缺点，即不能实时动态地跟踪病
原菌的侵染和定殖过程以及重复性不好，而且用于
组织分离得到的病原菌不能有效排除从其他途径侵
入的病原菌。报告基因的应用为实时动态监测病原
菌的侵入途径和过程提供了工具。早期对病原物的
检测中应用的报告基因有荧光素酶基因 lux和 β-葡
萄醛酸糖苷酶(GUS)基因 uidA，这两个基因均有不
足，如需要分别向试验材料内渗入荧光素，或者要应
用昂贵的反应底物 4-甲基伞形花酮-B-D-葡萄糖苷
酸(X-Gluc) ，更重要的是都对组织有破坏，不能延
续对病原菌后续侵染过程的跟踪。
绿色荧光蛋白基因(gfp)由于片段小，可与多种
不同蛋白质的 N 端或 C 端相融合［35］，用荧光蛋白
基因标记的病原物已用于动态监测病原菌侵染过
程［36 － 42］。将筛选出的荧光蛋白稳定表达和致病力
无变异的转化菌在植物不同生育期和不同组织接种
于寄主植物，然后在不同时间点，不同的组织部位取
样观察荧光的有无以确定该部位是否存在病原菌以
及病原菌的扩展情况，跟踪其侵染过程。
Kanniah等［43］将绿色荧光蛋白基因转化的曲霉
菌株接种于棉花棉籽，用来研究病原菌的生长、侵入
和定殖过程，观察了荧光的强度与病原菌的扩增量
以及毒素的产生情况成线性关系，不但可作为荧光
蛋白在病原菌侵染定殖研究的例子，还可以作为理
解病原菌在其他感病寄主上不同模式的侵染定殖和
毒素产生情况的方法。
Sukno 等［44］通过构建表达绿色荧光蛋白的炭
疽菌，玉米根部接种在活体内观察其根部与叶部不
同的定殖情况和侵染过程，观察到了典型的根部入
侵真菌形成的菌丝结构以及探明了该病害是否从根
部侵染以及根部侵染后可导致上部的叶部病害的用
常规方法不易准确检测的问题。
吴磊等［45］用农杆菌介导法将红色荧光蛋白基
因(DsRed)转入轮枝镰孢菌株，通过观察其在玉米
根上的侵染、定殖和扩展，为进一步探明轮枝镰孢和
玉米之间的互作关系，以及探索其他土传真菌与植
物之间的互作模式提供了参考。
Zhang 等［46］利用携带绿色荧光蛋白的赤霉病
菌接种小麦和大麦形象直观地检测到了病原菌在寄
主上由接种小穗中生长，沿着柱头、子房或内及外稃
内表面，经过靠近穗轴的致密组织，侵入邻近小穗，
感染整个麦穗，直至到达茎秆的侵染和扩展形式，以
及抗病品种上病原菌的发展，为研究病原菌致病机
43
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理提供了理论依据。
Thirugnanasambandam 等［47］首次通过农杆菌介
导原生质体转化法将荧光蛋白转入大麦柱隔孢柱叶
斑病菌，通过离体接种观察到了侵染部位，产孢的部
位和时间，为阐明该病原菌的入侵、发展和病害传播
存活方式提供了一个方便的工具。
荧光蛋白标记基因可用于与其他生物技术，如转
录组学结合研究病原菌的侵染机制。Marcel 等［48］用
带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的稻瘟病菌结合转录组
学的方法发现稻瘟病在根部的另一种不同于叶部的
活体营养寄生的侵入方式。
2． 2． 2 多种真菌的复合侵染过程 同时绿色荧光
蛋白标记基因可用于多种病原物复合侵染中与宿主
和各病原菌之间的相互作用，以及靶标病原菌与生
防微生物的相互作用［49］。Eckert［50］用红色荧光蛋
白(DsRed)和绿色荧光蛋白(GFP)的基因分别转化
同属不同种的不同的病原菌，提供了一种不同寄主
物种上复合感染的病菌之间的相互作用，以及同种
病原菌对立交配型之间的相互作用的方法。Olivain
等［51］用致病性和非致病性的转荧光蛋白基因的镰
刀菌接种番茄，观察了两种真菌在根部和土壤中对
营养的竞争关系。Bolwerk等［52］观察到假单胞细菌
与病原真菌镰刀菌互作中，观察到两者在同一位点
的竞争和直接的相互作用中可能的分子机制，如生
防菌抗真菌物质改变病原真菌菌丝形态，增加分支，
增加菌丝内液泡形成，失去生长方向性等作用于镰
刀菌。
2． 2． 3 侵染过程中相关基因的表达 绿色荧光蛋
白标记基因可用于检测病原菌致病基因上的研究，
将 GFP基因与病原菌的某些基因相融合，通过观察
GFP基因表达的前后顺序及荧光的强弱，确定病原
菌在感染植株中各基因的表达强度及各自的表达顺
序情况，从而了解各基因在病原菌致病中的作用。
也可以用带有荧光蛋白标记基因的某些基因的突变
子侵染寄主用以证明某基因在病原菌致病中的
作用。
Jansen等［39］通过用带有 gfp标记基因的野生型
镰刀菌和单端孢烯醇类毒素突变体的镰刀菌证明单
端孢烯醇类毒素不是侵染麦类作物的果皮过程中的
致病因子。
Chung等［53］将烟草蛙眼病菌(Cercospora nicoti-
anae)与抵抗自身毒素相关的两个基因 pdx1 和 crg1
分别于 gfp融合，导入相应基因突变菌株，通过观察
表型和融合蛋白的分布，用于确定两种基因所编码
蛋白质的分布。
Figueiredo等［54］用含绿色荧光蛋白基因 gfp 和
草铵膦抗性基因 bar 的二元质粒载体，转化了柑桔
黑斑病菌(Guignardia citricarpa) ，拟用以研究真菌
的毒性决定因素及其可能的控制。
2． 2． 4 定量检测植物组织中病原物的数量 在组
织型启动子控制下的荧光蛋白的病原菌内，荧光强
度与转化菌株内荧光蛋白成正比，所以可以通过检
测一定体积内荧光强度来检测病原菌的数量［55］。
2． 2． 5 侵染过程中寄主植物的抗性反应 传统的
鉴定抗病性多以寄主植物表观症状为参考，而对于
病原菌在寄主上具体的定殖方式差异的研究能对深
入了解寄主抗病机制提以及挖掘抗病基因，并在数
量抗性中作为抗性水平鉴定标准提供参考。陈孝仁
等［56］利用转绿色荧光蛋白的大豆疫霉接种大豆，系
统观察了大豆疫霉在寄主大豆叶片、下胚轴和根部
的侵染行为以及显微分析了大豆疫病在不同抗性水
平的大豆品种根部生长的差异。Fadil 等［57］通过转
绿色荧光蛋白基因的茎点霉菌接种中抗和感病的向
日葵品种，通过比较菌丝在二者上的穿透和定殖步
骤与速率，以及菌丝的形态的差异，探索了抗性品种
的抗性形成的原因。Zvirin等［58］利用转荧光蛋白的
尖孢镰刀菌和防御有关的基因的转录差异来观察抗
感品种的西瓜上的定殖差异和抗感反应。
3 真菌转荧光蛋白基因存在的问题
3． 1 转化方法问题
原生质体-PEG 转化法是一种应用很早的转化
方法，但涉及到原生质体的制备和再生，比较费时，
并且转化效率低。如用电击法和基因枪法，转化时
随机插入多重拷贝数比率较高，对于要运用同源重
组的基因敲除往往效率不高。而农杆菌介导法在目
前来说以其 T-DNA 插入特征，除了应用 T-DNA 区
域随机插入宿主染色体区域用来构建突变体库，还
可以用 T-DNA区与宿主基因同源重组用于基因敲
除以鉴定基因的功能，特别是与原生质体比较其没
有额外插入的双交换同源重组率高［59］，被广泛用来
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进行真菌转化。农杆菌转化对于不同的真菌转化效
率不同，并且对于不同的真菌其转化体系条件不同，
所以对于一种新的真菌标记基因转化要进行尝试以
确定其共培养时间、温度及其真菌与农杆菌的比率
等转化条件以及不同质粒的选择进行对比和优化。
当然农杆菌转化中也可能存在寄主特异性问题，或
者真菌转化材料的细胞壁成分和厚度也可能影响转
化。还有农杆菌本身遗传背景问题［60］，这些都是运
用农杆菌转化所要注意的问题。
3． 2 转化子稳定性
真菌转荧光蛋白，在荧光蛋白基因随机插入的
情况下，根据受体材料不同，稳定性也不一样，一般
以分生孢子等单核体为材料的转化稳定性要强于用
菌丝等多核体材料，如菌丝里容易形成异核体。特
别是如电击法、基因枪法等质粒 DNA往往是在基因
组的不同位点多拷贝插入或者是在某个位点串联插
入，还可能引起基因组 DNA 的重排，农杆菌有较高
的单拷贝插入率，即便如此，仍然有稳定性降低的可
能。Nyilasi［61］用农杆菌介导法用来转化一种接合
菌 Backusella lamprospora，转化子出现了在经历几个
培养周期之后观察到潮霉素 B 抗性逐渐减弱的现
象。转化子的稳定性还决定于目标基因是否有效地
整合到菌株染色体上。鉴于此，可以将标记基因与
目标基因融合，进行定点插入，不但转化子更加稳定
还可以将报告基因用来研究特定基因的转录活性和
细胞器的亚细胞结构定位。如 Gerami-Nejad等［5］关
于 Tub1-YFP和 Cdc3-CFP 可在白色念珠菌细胞内
共表达和共定位的研究以及 Fitzgerald 等［62］就曾将
GFP作为报告基因用来研究 RNA介导的基因沉默。
在一类真菌里的启动子不一定在另一类真菌里行使
其功能，转化子稳定性很大程度上取决于质粒的构
建，如启动子的选择。除此之外，鉴于 MAR 能使转
基因形成一个独立区域，使相邻的转录单元保持相
对的独立性的功能，可考虑将其引入表达盒两侧以
有利于转基因稳定表达，并能克服基因沉默和避免
了转基因表达的位置效应。
3． 3 其他植物等自身荧光
在研究病原菌与寄主互作中，接种病原菌的寄
主也有自发荧光现象从而产生干扰病原菌的观察。
为了解决这个问题，首先应该选用强表达的荧光标
记基因进行转化，筛选表达量强的转化子。其次，可
以尝试同时转化不同颜色即不同激发波长的荧光蛋
白进入真菌内，通过获得在不同激发光下观察到的
重叠荧光以确认和区分病原菌和寄主植物。如 Hel-
ber等［23］就有将两个标记基因同时转化丛枝菌根真
菌的报道。
4 展望
转荧光蛋白标记基因真菌在功能基因组时代的
应用广泛。在植物病理学领域集中在微生物互作的
动态过程检测的研究;在菌根真菌上研究其与寄主
定殖与互作，其在环境中扩散和生存竞争能力和观
测菌根真菌或内生真菌与环境中其他菌根真菌或病
原菌的作用等;在病原真菌上则主要应用于病原真
菌入侵途径，多种病原真菌的复合侵染，真菌侵染相
关基因的表达，植物上的病原物的检测，寄主植物的
抗性鉴定等方面的研究。
尤其是许多病害循环不清楚的病原菌，运用转
荧光蛋白标记基因的病原菌，为确定病原菌的侵染
位点和初侵染源，寄主和土壤环境中的病原菌的检
测，以及从根部侵染的病原菌未显症之前的潜伏侵
染过程和向地面部分扩展蔓延时期的观察提供了一
个有力的工具。
同一种病原菌有致病力的分化，寄主植物也有
抗性水平的不同，病原菌的寄生与病害的流行与环
境条件密切相关，运用转荧光蛋白标记基因的病原
菌用来研究病原菌在不同的气候条件下，或者在不
同抗性水平的寄主上的定殖侵染情况，有利于了解
病原菌的致病机制和流行特征。为对其进行防控提
供参考依据。将来荧光蛋白标记基因的应用在病原
菌的病害循环、入侵机理和抗病机制的研究上将会
更加广泛。
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