全 文 ：生物杖术通银
技 术 与 方 法 习爪口r召曰阴W 笼刀 G Y B U L L E 21 V 2 X刃 年 增 刊
SSR 分子标记在荔枝上的研究进展
欧良喜 向旭 狄凤香 白丽军2 陈洁珍 孙清明
( 广东省农业科学院果树研究所 ,广州 51 仪抖o ; 四川农业大学园艺学院 ,雅安 625014 )
摘 要: ssR 作为第二代基于 PC R 的一种新型 D N A 分子遗传标记, 数黄丰富 多态性高 重复性好 分布于整个基因
组 特异位.点扩增 发生频率高 共显性遗传等 ,在果树育种中具有极大的应用价值和开发潜力本丈主要简述了s R 标记的原
理和特.饭,并从分子指纹图讲构建 种质资源的遗传多样性分析 核心种质的发极 品种鉴定 分子标记辅助育种 遗传图语构
建与基因定位等多方面介绍了近年来 s R 技术在荔枝上的应用现状及前景
关扭词: s R 分子标记 荔枝
A d V a n CeS o f s恤由es on S S R M s rk erS in L itCh i
O u Lian 加 Xi an g X u D i Feng口劝g B 眨Lijun , C hen Jiezh en Sun Q ing旧ing
( 加谊映 of 几侧跳 e R e,e, h, C.口娜拓叮 A e诚 衅 of A乎ic政 心 决讼nc es, C 如叫, ho 510640,.ZColle 梦 of H o雌比以公以sc 比nc e ,
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月洲tra Ct : SSR (s如P e sequ ence re Peat ), as : new tyP e ofD N A mo leeular mar kers , th e seeond 罗ne二 on bas ed on pC R , 15 m ueh
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翻 p随cati on , 址沙 oecurnng fre quen即, eo一doman t 坛由eritan ee, an d e石sting ext ens ively in w hole 罗nom e. T hi , PaPer oudi ned i
Prin ciPles an d eha o cteristies,an d Introduced its aP Pli caOOn in D N A fillge印rintin g , 罗netie di veni ty an al vsis, key 罗m lplas m discove砰,
van ety ide n 的 的 o n , ~ ker 之钻lsted sel cti on , ge ne d e m aP eons tru etin g an d 罗n e locaon g , ete in 肋 it bre edi ng in re eenr ye扔 in L iteh i.
K e y wo rd s : s sR M o lecul ar mar kers L itc hi
SSR 为简单序列重复(Sim ple se 四 enee R e粥at),
又称微卫星体(Mi crD sat el lit e) ,是指由 1一5 个核昔酸
组成的短序列(又称核心序列或主题序列)首尾相连
重复多次构成的一段 D N Al l], 它们普遍存在和随机
分布于大多数真核生物的基因组中 ,重复数具有高
频率的变异 ,这种专化位点的多态性可以十分容易
地通过设计特异引物进行 PC R 扩增检测lz] 对 s R
的研究始于动物基因组 ,H am ad a 等13 最早发现了由
二核昔酸 CA /GT 重复多次构成的一段 D N A Ta uts
等l 的研究证明了 sS R 在真核生物中存在的普遍
性与广泛性 W ebe r等 l5] 对基因数据库中的人类
SSR 进行了系统研究 , 发现在 8 个位点中有 7 个存
在着 CA 重复数量的变异 微卫星位点的重复单位
拷贝数,可能由于有丝分裂过程中同源微卫星间的
不等交换或复制过程中 D N A 滑动而高度可变 ,因
而显示出丰富的多态性 在重复序列的两端 ,往往
是相对保守的限制性内切酶位点 所以,通过特异
性引物进行 PC R 扩增反应 琼脂糖凝胶电泳(或聚
丙烯酞胺凝胶电泳)和放射 自显影(或银染),就可以
检测到在简单重复序列重复单位数不同的 D N A 区
域的多态性l6]
荔枝( tcb f cb in en si 肠nn.)为无患子科(物p角-
da cea e) 荔枝属(石tch o植物 ,因其果实色 香 味皆美
而驰名中外 ,有 果王 的美誉 , 是我国一种重要经
济果树 , 原产地在中国, 其他国家的荔枝基本上从
我国引进 , 正因为中国是荔枝的发源地 , 所以种质
资源非常丰富lv 在培育荔枝新品种的过程中,至今
最常用的是实生选种和芽变选种l8] 由于尚未对荔
收稿 日期:ZIX旧一03 一20
基金项 目:广东省科学院科技支排项 目(07 一支撑一20 )和国家荔枝现代产业技术体系经费资助(2(X 为)
作者简介 :欧良喜 (l 964 一) ,男 ,研究院,研究方向:果树遗传育种
通讯作者 :向旭 , E一m 1浦朋乎u@ vip .163 .com
位物杖术通橄刀勿翻动彻城盯 2砚X 旧年 增 刊
枝开展大规模基因组测序 ,对现有荔枝种质的遗传
背景也不清楚 ,想从更深层次上发掘和利用那些珍
贵的功能基因宝藏,就必须找到一个强有力的进行
荔枝种质分析的工具lv.
1 SSR 标记的基本原理和特点
1.1 SSR 的基本原理
SSR 标记分析的基本原理是 :SSR 两端的序列
一般是相对保守的单拷贝序列 ,据此序列可以设计
一对特异引物进行 SSR一PC R , 以扩增串联重复序
列 ,再通过电泳检测扩增片段的多态性即为 SSR 标
记 根据串联重复数的不同进行相应的遗传分析 ,
揭示微卫星 D N A 的长度多态性 12 多态性的出现
是由于微卫星的寡核昔酸的重复次数在同一物种
的不同基因型中差异很大以及由于重复序列 D NA
在复制时的滑动或染色单体的不等互换造成的 因
此 ,微卫星可作为 DN A 分子标记19一川
1.2 SSR 的特点
sS R 具有以下特点 :(l )一般检测的是一个单一
的等位基因位点 ;(2) 呈共显性遗传 ,符合孟德尔遗
传规律 ;(3 ) 直接以 D N A 形式表现 , 受局限性小 ;
(4 )数盆丰富 ,覆盖整个墓因组 ,分布均匀 ;(5) sS R
标记位点专化性 ;(6 ) 易于利用 PC R 技术分析 ,对
D N A 数量及纯度要求不高,实验重复性好 ,结果可
靠 ;表现中性 ,不影响目标性状的表达 ,与不良性状
无必然连锁 ;(6) 多数徽卫星无功能作用 ,在品种间
具广泛的位点变异 ,多态性好 ;(7) 微卫星两侧具保
守序列 ,在同种而不同遗传型间多相同12 一14
SSR 和 R FLP 相比 , 它可以检测 R FLP 标记一
般不能检测的基因组串联重复序列 ,而且多态性更
高 ,操作简单 ,速度快 s R 和 RA PD 相比 ,具有很
好的稳定性和重复性 ,便于不同实验室间试验结果
的交流和比较 ,所以 SSR 兼具 RFLP 和 RA PD 的优
点 ,克服了它们的不足 同时 SSR 简便快速的分析
技术 ,能够在短时间内对大量样品进行分析 ,具有
更强的实用性和更大的应用前景 ,成为目前分子标
记技术的热点l2]
2 在落枝遗传多样性研究上的应用
遗传多样性主要是指种内不同居群之间或同
一居群不同个体之间的遗传变异的总和 进行遗传
多样性的研究 , 首先应选择合适的遗传标记(Ge -
ne tie m ark ers )l 5] s R 标记以其丰富的多态性被广
泛地用于果树品种的遗传多样性分析 刘勇116等对
抽类资源及其近缘种的 SSR 遗传多样性研究表明,
抽类品种及其近缘种具有较丰富的遗传多样性,平
均每个位点的等位基因和遗传多态信息量明显高
于橄榄 7],与樱桃 8] 苹果tlg] 等果树相当 而在荔枝
上 ,李明芳侧利用 SA M 法实验性的首次成功地开发
了 22 对 SSR 荔枝引物 ,用其对 37 个荔枝栽培品种
和 2 个龙眼品种进行了遗传多样性分析 ,获得了遗
传相似矩阵 ,其范围在 O一l之间 ,平均为 0. 567 姚
庆荣l2] 利用李明芳开发的 22 对荔枝引物对海南部
分野生 半野生和栽培荔枝品种共 6 份进行了遗
传多样性分析 ,检测到了 52 个等位基因位点 ,平均
每个位点的等位基因数为 2.36 ,每个群体平均基因
杂合度在 0.2960 一0.37 4 之间 , Sh an no n 遗传多样性
平均指数(I)介于 0. 41 70 ~0.5 6 之间 王家保圈等
认为野生荔枝由于外来物种人侵少 , 无人为选择 ,
因此有丰富的遗传多样性 ,半野生荔枝和栽培品种
亦降低 37 个采自霸王岭的野生单株聚为明显的 5
类 , 表明野生荔枝群体内存在或正在发生着明显的
遗传分化12,]M .A .V iru el 和 J.I.H ormaz al刀l利用 12 对
S R 引物对 21 个荔枝品种和 4 个龙眼栽培变种进
行了遗传多样性分析 , 从 21 个荔枝栽培变种中获
得了遗传相似矩阵 ,其范围从 0.23~0.93 ,其中的 16
个栽培变种能够很清晰的进行遗传多样性分析鉴
定
荔枝存在许多天然的杂种类型 ,而新品种的选
育主要是采用实生选种 芽变选种或者采用混合花
粉杂交选育而成 ,均无法判断其亲本囚,只有了解
荔枝材料的遗传背景 ,才能有针对性地选择亲本,培
育出性状更好的荔枝新品种 从现有的文献看 ,对
荔枝种质资源的分析研究涉及面小且工作零散同,
总体进展不大; 尽管同工酶也是一种遗传标记 ,在
多种同工酶上也开展过类似的研究和探索 , 但与
SSR 的多重优势相比 ,应不具有进一步研究利用的
价值 比如 ,在 PE R 同工酶方面 ,刘红兵等侧对广
西 24 个荔枝品种的进行了分析 , 根据酶谱的差异
将供实品种分为 2 组 2 型 1 种 苏伟强, 黄海滨
等 网 测定了广西苍悟县 5 个迟熟荔枝品种的PE R
工酶 , 根据酶谱相似系数推断 , 沙头迟荔 与 禾
2 (兀目年 增 刊 欧良喜等 :SSR 分子标记在荔枝上的研究进展
荔 (即淮枝)的亲缘关系最近 ,与 下番枝 关系最
远 此后 ,刘成明困 苏伟强 川 彭宏祥侧 庞瑞媛国
等相继用同样的方法做了一些有关荔枝亲缘关系
品种鉴定 相关性状的遗传等方面的工作
3 在荔枝遗传图谱的构建上的应用
分子标记是构建遗传图谱的基石 ,寻求足够多
的多态分子标记就成为育种与分子生物技术的关
键结合点 ,其最终 目标是将所有基因座位定位到特
定染色体的特定区域 ,且最好是在染色体步查距离
内13 1高密度的遗传连锁图谱不仅可应用于育种过
程中的早期预选 缩短育种年限 ,还可应用于目标
性状的基因定位和定点克隆 近 10 年来,多种分子
标 记 如 : RA PD R FLP A FLP ISSR SSR SC A R
CAPs 和 E ST 等均已广泛应用于果树遗传连锁图谱
的构建, RA PD 是其中应用最早的; 由 RA PD 经克
隆测序开发为特异性更 强的共显性 的 SCA R 和
CA Ps 分子标记 , 则开始应用于高分辨率遗传连锁
图谱的构建国 与 SCA R 和 C AP , 标记相比 ,SSR 标
记则更显其在基因组结构上的普遍性与广泛性及
其随进化而来的种质特异性与丰富的多态性特征
长期以来 ,生物遗传图谱的构建几乎都是根据
其外部形态 生理生化指标等构建的 ,到目前为止 ,
只有少数几个物种建立了分子遗传图谱 ,并且大部
分的遗传图谱分辨率较低 ,图距大 ,饱和度低 , 因此
其应用范围有很大的局限性 近年来 ,随着分子标
记的发展 ,分子标记技术越来越多的应用到分子遗
传图谱的构建 , 再结合同功酶标记和一些形态标
记 ,构建遗传图谱的生物种类越来越多 ,图谱上标
记的密度也将越来越高 SSR 标记对于构建高密度
的遗传图谱非常有用 ,像 D ietri chl,,]在 19 6 年就构
建了一张含有 7 377 个遗传标记的小鼠连锁图 ,而
微卫星标记就有 6550 个 ;Di b 等l34] 在同一年也构建
了含有 5 264 个微卫星标记的人类连锁图; 在植物
的遗传作图中 ,S R 标记尽管还没有 占主导地位 ,
目前大多是将其添加到以其它分子标记为主的连
锁图上13 ,但其应用潜力却无可置疑
目前 ,荔枝分子遗传图谱的构建报道更少 在
其它木本果树上 , 相对于模式植物以及大田作物 ,
该方面的研究进展也极其缓慢 ,仅有几例较成功的
研究报道 美国科学家应用 RF廿 和 s R 技术己经
成功地获得了杏高密度的遗传基因图谱(平均密度
为 1.3 标记/CM )l]艾呈祥等134]利用 10 对 SSR 引物
对 24 个甜樱桃品种进行遗传图谱分析 , 构建了他
们的分子身份证 G ia几franeesehi等利用 10 对 SSR
引物发展了已构建的苹果 R A PD 遗传图谱 , Jo beu r
等135 应用 RA PD 和 SSR 标记共同构建了扁桃的第
二代遗传图谱 由此可见,利用 SSR 分子标记在构
建木本果树遗传图谱方面也已经取得了一定的成
功
4 在荔枝品种鉴定上的应用
中国有很长的荔枝栽培历史 ,第一次有中文记
载的相关资料可以追溯到 2仪旧多年以前 , 并且有
很多的栽培变种阅 ,尽管如此 , 由于中国方言的多
样性和差别 ,在翻译成英语时出现了很多的同物异
名或同名异物的现象网 ,并且 ,关于几个栽培变种
的描述仅仅是基于果实的形态特征和品质特性!戮
但是,这种鉴定方法有很大的局限性 ,因为品种形态
特征的表达受环境因素的影响,而且也很难仅依靠
形态特征区别亲缘关系较近的物种 ,近年来有学者
建立了鉴别荔枝品种的 12 种多态酶系统 , 但是同
功酶分析的主要局限性是能够检测的位点少 ,因此 ,
亲缘关系近的品种常常具有相同的同功酶带型 ,只
有利用 DN A 分子标记才能克服这种局限性l37]
在 目前应用的分子标记中 , S R 由于其高度的
多态性和可重复性 ,被选择作为鉴定动植物基因型
的分子标记 Ho ~ 国利用 S R 分子标记揭示了
中国的 R u Sha Sin 和美国的 Sta rk Earl i O ra nge
和 Go ld ish 具有品种同源性 李明芳利用 2 对
SSR 引物对 37 个荔枝品种进行了鉴定 , 得出的结
论是 :三月红与海垦 14 号 海垦 1 号间的遗传相
似性最小;白糖婴与海垦 8 号之间的遗传相似性最
大 ,并鉴定出蛤蛛红与海垦 13 号是同一个品种固
蔡青利用筛选出来的 5 对 SSR 引物对 30 个甜樱桃
品种进行了鉴定 ,可以将全部供试甜樱桃品种区分
开14,]
近几年来 , 利用 28 对 SSR 引物对 117 个荔枝
种质进行鉴定 ,初步将供试材料分为 18 个类群 ,其
中 ,元荔 2 号 七月青 三月红 木角 桂花 2 号 赤
叶 妃子笑和水东等几个品种均单独归为一类 ;此
外 ,对几个普遍栽培的名优品种的亲缘关系进行了
位物杖术通稚 B勿姗为助城口 B u肠时加 2以拍 年 增 刊
探讨 ,妃子笑与白糖县的相似系数为 0. 71 7 ,与三月
红的相似系数为 0. 以叉),种间差别较大 ;糯米核 (白
皮小糯 ) 与怀枝的相似系数为 0.84 9 , 亲缘关系较
近 ; 桂味与米怀枝的亲缘关系较近 , 相似系数为
0. 75 2 ,与怀枝的相似系数为 0. 658 ,亲缘关系相对
较远 元荔 2 号与其它品种间的相似系数最小 ,亲
缘关系最远 ,种间差别最大 亲缘关系最近的是乌
面和增城山枝 ,相似系数最大 ,达到 0. 96( ),种间差
别最小 布袋和玉麒麟 东莞尚书怀和蛀核荔分别
聚为一类 ,亲缘关系较近 典型的几个海南晚熟品
种海垦 2 号 海垦 4 号和海垦 9 号等与怀枝株系的
亲缘关系也较近
由此可见 , SSR 分子标记具有高度的多态性 ,
可以用来进行荔枝亲缘关系的分析与品种鉴定
5 在分子标记辅助育种上的应用
分子标记辅助育种 M As( M ark er 一 as sist ed Se le c-
tion )是分子标记的一个主要应用之一 ,当与目标基
因连锁的分子标记和 目标基因相距 SC M 之内时 ,
即可用于 M A S ,尤其是在抗病性选择 新品种的选
育和优良品种的选育上 , M AS 提供了一个准确 快
速的方法l] 分子标记辅助选择在果树育种中主要
用于杂交亲本的选配 杂种实生苗的早期选择 染
色体片段去向的追踪 基因检测 雌雄异株果树幼
苗的性别鉴定以及多种抗病性状的直接筛选闷
荔枝在我国南方农业生产中占有重要的地位 ,
也是一种很重要的经济树种 ,但是 ,长期以来新品
种选育停滞不前 ,远远不能满足生产发展的需要和
消费者的需求 ;因此 ,加快荔枝新品种和优良品种
的选育具有重要的经济惫义 荔枝的遗传背景较为
复杂 ,遗传上高度杂合 ,遗传背景还不清晰 ,再加上
童期长,树体大 ,自交不亲和,这给育种工作者带来
了很大的困难 将 Ss R 分子标记引人荔枝的育种工
作中 ,分析与目标基因相连锁的 SSR 分子标记的情
况来判断 目标墓因的情况 , 以及与目标基因相连的
其它基因的遗传背景 , 可以大大缩短育种周期 ,加
快育种工作的进程
6 问题及展望
综上所述 , SSR 分子标记以其独特的优点在荔
枝的分子学研究中有很大的应用价值和利用潜力 ,
特别是对于荔枝遗传背景和遗传多样性分析 种质
资源的保护和利用 核心种质的发掘 ,为杂交育种
父母本的选择提供指引等方面意义重大 ;以及在品
种鉴定和杂种后代预选 和分子标记辅助育种上具
有很大的利用价值 由于 S R 分子标记集中了其它
分子标记的所有优点 ,被认为是研究群体遗传变异
最好的方法刚
但是 , 目前 SSR 分子标记在荔枝上的应用研究
尚处于初级阶段 ,必须对其研究策略和技术路线有
一个整体的规划 ,加强技术协作和合作攻关 ,避免
工作上的不必要的重复 ,才能尽早将此新技术惠及
荔枝这一创新性育种难度最大的木本果树 ;由于荔
枝野生种质和实生群体较多 ,现有栽培品种经几千
年的自然进化和选择 ,遗传背景极为复杂 ,同物异
名或同名异物的现象也极其普遍 ,分析发掘和构建
核心种质就成为解决问题的突破口;另外 ,构建荔
枝的 D NA 和 cD NA 文库 , 大规模测序以获得徽卫
星两侧的引物序列 ,加快引物的开发也较为关键14 -
州此外 ,有学者考虑到物种在进化过程中有很大
的同源性 ,建议借鉴其近缘物种甚至是其它物种已
开发的 S R 引物 , 目前 ,这方面的研究已有相关的
报道 ;近年来 ,我们也探讨并证实了从桃 有萄上获
得的 S R 引物在荔枝上也有较好的通用性 ,证明这
个方法已取得了局部成功 因此 , 加快开发利用
S R 分子标记 ,是荔枝种质创新和新品种选育的必
然选择
. 考文徽
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