全 文 ：生物技术通报
· 研究报告 · 丑了口百付 口乙 年增干
杜鹃红 山茶花粉萌发力及贮藏耐性的研究
李天菲 林田 徐碧玉 刘灶长 罗利军
上海市农业生物基因中心 , 上海
摘 要 以 一 年生嫁接的杜鹃红山茶 花粉为实验材料 , 研究了不 同培养基 、不 同培养温
度对其萌发的影响 , 同时探讨了不同贮藏条件和贮藏时间下花粉生活 力的差异 。 结果表明 杜鹃红 山茶花粉在不
同培养时间下其萌发率呈抛物线型 , 花粉在 巧 蔗糖 硼酸的培养基上萌发率最高 , ℃ 的培养温度比
℃ 、 ℃更适合杜鹃红山茶花粉萌发。 一 ℃ 冷冻保存和液氮保存都是适合杜鹃红 山茶花粉长期保存的方式。
关键词 杜鹃红山茶 花粉 萌发力 贮藏耐性
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℃ ℃ ℃
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at 4℃ .
K ey w o rd s : C am ellia az alea P ollen Ge rm in at ing ab ility Stora ge tolera nee
杜鹃红山茶 (Ca me li a ~ lea ) , 又名张氏红山
茶 , 为山茶科山茶属常绿灌木至小乔木 , 高可达 3
米 。 花艳红色 , 单生或聚生于枝顶 , 花瓣 5 一 9 枚 , 倒
卵形至倒心状披针形 , 先端略凹 , 基部离生 。 叶狭长
倒卵形至倒披针形 , 先端圆形 , 基本楔形 , 叶缘光滑 ,
叶片两面无毛 , 中脉两面凸起 。 嫩枝无毛 , 略显红
色 , 老枝光滑 , 黄褐色〔’一’] 。 该品种 目前仅在广东省
阳春市河尾山林场有少量分布 , 属于珍稀濒危物种 ,
是我国山茶属植物中继金花茶后又一个国家一级保
护植物 。
杜鹃红山茶一年四季皆可开花 , 花艳丽密集 , 叶
光亮碧绿 , 树冠紧凑 , 树形优美 。 其盛花期在 5 月至
10 月 , 是培育四季开花茶花品种的优良亲本 , 目前
已受到越来越多茶花爱好者和茶花育种家的关注 。
山茶属植物一般 ro 月至翌年4 月开花 , 与杜鹃
红山茶杂交存在一个花期不遇的问题 。 而且植物花
粉的寿命通常很短 , 大多数山茶花粉在自然条件下 ,
两周后生活力即丧失 50 % 以上 , 给杂交授粉工作带
来极大的不便 。 目前 , 花粉的保存最常用的是低温
( 一 2 0 ℃ )保存法 , 近年来发展很快的液氮超低温保
存也是长期而可靠的保存花粉种质资源 的方法 。
1 9 2 2 年 K now lton 最早报道了经 一 1 8 0 ℃贮存的金鱼
草花粉尚有活力 。 我国上世纪 80 年代中期开始植
物种质资源超低温保存研究 。 到 目前为止 , 利用液
氮超低温保存花粉 , 已经在作物 (黑麦 、玉米 ) 、蔬菜
(番茄 、西甜瓜) 、果树(桃 、梨 、杏 、柑桔 ) 、 花卉苗木
基金项 目:上海市科技兴农重点攻关项 目(沪农科攻字(20 5) 第 1一1 石 号 )
作者简介:李天菲 , 女 , 硕士 , 主要从事种质资源的收集保存与创新 , Te l : ( 0 21 ) 5 2 2 3 05 26 ; E 一m al : l tf@ s agc . 。rg
. c n
生物杖术通报 Bto te ch n口勿舒 2008 年增刊
(石蒜 、杜鹃树 、落叶松) 、药材(人参 、魔芋)及茶树
等植物上取得了一定的进展阵 ’〕。
确定如何长期有效的保存杜鹃红山茶花粉的方
法 , 以及了解杜鹃红山茶花粉生活力的状况 , 能够更
好的指导杂交育种工作 , 解决因花期不遇 、异地授粉
而带来的授粉困难 。 旨在通过对杜鹃红山茶花粉生
活力及贮藏耐性的研究 , 为杜鹃红山茶的杂交育种 ,
提供一定科学依据和技术指导 。
1 材料与方法
1.1 植物材料
供试材料为 2 一 3 年的杜鹃红山茶嫁接苗 , 平均
株高 56 一 6 0c m , 冠幅 30c m 左右 , 嫁接砧木是红山茶
品种 ‘红露珍 ’ 。 供试植株皆为盆栽 , 生长良好 , 种
植于上海市农业科学院白鹤基地塑料大棚内。
采集开花前 1 一 Z d 或刚开花的花朵 , 带回实验
室后剪取花药 , 收集于垫有硫酸纸的培养皿内 , 室内
阴干 1 一 Z d 。 待花粉自然散出 , 收集花粉 , 装于 Inil
冻存管中 , 于干燥器内密封保存 。
1
.
2 方法
1.2 .1 花粉萌发率的测定 采用体外悬滴培养
法 。 使用单凹玻片 , 在 25 ℃培养箱中保湿发芽。 以
花粉管长度超过花粉粒直径 2 倍的花粉计为萌发花
粉粒 。 设 3 个重复 , 每个重复随机观察 3个视野 , 每
个视野花粉数量不少于 10 粒 , 计算每个视野内萌
发的花粉粒占总花粉粒数的百分比 , 最后以所有观
察值的平均值为该花粉的萌发率 。
1
.
2
.
2 花粉萌发最适时间的确定 以常用的花粉
发芽培养基 10 % 蔗糖 + 0.01 % 硼酸作为萌发培养
基 , 在25℃培养箱中发芽 , 培养 lh 、 Z h 、 4 h 、 6 h 、 s h 、
24 h
,分别观察统计花粉萌发率 , 确定统计花粉萌发
率的最适培养时间 。
1
.
2
.
3 花粉萌发最适培养基的确定 配制 5 种花
粉萌发培养基 :10 % 蔗糖 、 10 % 蔗糖 + 0.0 1% 硼酸 、
ro % 蔗糖 + 0.02 % 硼酸 、 巧% 蔗糖 + 0 .01 % 硼 酸 、
巧% 蔗糖 + 0.02 % 硼酸 。 以去离子水为对照 。 将杜
鹃红山茶花粉分别在以上培养基上培养 , 培养温度
为25 ℃ , 培养时间为最适时间 , 观察统计花粉萌发
率 。
1
.
2
.
4 不同温度条件对花粉萌发率的影响 在
20℃ 、 25 ℃ 和 30℃培养条件下 , 对杜鹃红山茶花粉
进行培养 , 培养时间为花粉萌发最适时间 , 培养基为
花粉萌发最适培养基 。 观察统计花粉萌发率 , 比较
不同温度条件下花粉萌发率的差异 。
1
.
2
.
5 不同贮藏条件及不同贮藏时间下花粉萌发
力的测定 采用以下四种方法密封保存杜鹃红山茶
花粉:¹ 常温保存到逗片℃冰箱保存;» 一 20 ℃冰箱保
存;¼ 液氮保存。 从花粉贮藏起开始 , 每隔一定时间
定期检测花粉萌发率。 取少量的花粉播种到最适培
养基上 , 在 25 ℃培养箱中经最适时间培养后 , 镜检 ,
统计花粉的萌发率。
1
.
2
.
6 不同贮藏条件下花粉生活力的测定 花粉
活力的测定采用 T C 测定法 (胡适宜 , 1 9 93 ) 。 取不
同贮藏条件下的花粉置于载玻片上 , 加 1 一 2 滴 T C
溶液 , 盖上盖玻片 。 将制片放置 35 ℃ 恒温箱中 巧
m in , 然后在低倍镜下观察 。 凡是染成红色的花粉 ,
其生活力为强 , 淡红的次之 , 无色的为不具活力的花
粉或不育花粉 。 观察 2 一 3 个制片 , 每片取 3 个视
野 , 统计 ro o 粒 , 然后计算花粉的活力百分率 。 以
50 % 酒精杀死的花粉作为对照 。
6 0
一
0 0
5 0 刀0
4 0 .0 0
30 刀0
20 .0 0
10 .0 0
0 】h r 3 h r
培养时间
6hr 乏
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享‘.留-叱u[。姗txT一od
字并绷窦擂椒
图 1 不同培养时间下的花粉萌发率
2 结果与分析
2.1 花粉萌发最适时间
杜鹃红山茶的花粉萌发较快 , 在 10 % 蔗糖 + 0.
01 % 硼酸的培养基上 , 25 ℃培养 lh 以后 , 花粉萌发
率为 12 .82 % 。 随着时间的延长 , 花粉萌发率逐渐
提高 。 培养 3h 后 , 萌发率为 35 % 左右 , 花粉管长度
多在 4 一 5 倍花粉粒直径 。 6h 后发芽速率趋于平
缓 , 花粉管已伸长很长 , 大部分在 8 一 10 倍花粉粒直
径的长度 。 培养 8 小时后 , 萌发率达到最高值 50 .
32 % 。 培养 24h 后 , 萌发率呈 现轻微降低 , 为 45 .
8% 。
年增刊 李天菲等:杜鹃红山茶花粉萌发力及贮藏耐性的研究 24 1
实验表明 , 杜鹃红山茶花粉在不同培养时间下 提高 , 从36 .90 % 一 45 . 78 % 。 其中 , 添加 巧% 蔗糖
其萌发率呈抛物线趋势 。 培养 6 一 8h 以后 , 发芽率 和 0.02 % 硼酸的培养基上 , 花粉的萌发率最高 , 为
达到最大 , 并趋于稳定 。 若发芽时间过长 , 一则花粉 45 .78 % 。 通过此试验 , 确定杜鹃红山茶花粉萌发的
管伸长太长 , 相互缠绕 , 二则液体培养基容易发干 , 最适培养基为 15 % 蔗糖 + 0.02 % 硼酸 。
花粉管失水呈透明状 , 都会干扰计数 ,使得统计结果 进行 LS D 多重比较分析后可知 , 在 0.05 (结果
有误差 。 因此 ,确定观察统计花粉萌发率的最适时 没有在表 1 中标出)和 0.01 显著性水平上 , 添加硼
间为 2 一 3 h 。 酸的培养基与不加硼酸的培养基的花粉萌发率有显
2.2 花粉萌发最适培养基 著性差异 , 说明硼酸对杜鹃红山茶花粉的萌发率有
杜鹃红山茶花粉在不同配方的培养基上 , 25 土 显著影响 。 在0.01 极显著性水平上 , 添加了蔗糖和
l℃条件下 , 培养Zh 后 , 镜检观察花粉萌发率。 结果 硼酸的四种培养基上的花粉萌发率没有显著性差
如表 l。 异 。 在 0.05 显著性水平上 , 添加 巧% 蔗糖 +
在去离子水中 , 花粉的萌发率很低 , 只有 6% 。 0 . 02 % 硼酸的培养基和 10 % 蔗糖 + 0.01 % 硼酸的
在仅含 10 % 蔗糖的培养基中 , 萌发率也比较低 , 为 培养基对花粉萌发率的影响有显著差异 。
1 0
.
67 %
。 添加硼酸的四种培养基上 , 萌发率有显著
表 l 不同培养基上的花粉萌发率
花粉萌发率(% )
培养基 重复 平均花粉萌发率. (% )
1 1 1
去离子水(对照 ) 7.6 5.0 5.4 6.0 士 0 . s b
10 % 1 2
.
8 8 . 4 1 0
.
8 10
.
7 土 1
.
2 卜
1 0 % 蔗糖 + 0.0 1% 硼酸 31.1 38 .2 41.5 36.9 士3 . 1 .
1 0 % 蔗糖 + 0.02 % 硼酸 4 .4 39 .0 37.5 40.3 士2 . l a
1 5 % 蔗糖 + 0.0 1% 硼酸 36.7 43.7 4 .9 4 1.8 土 2 . 6 a
1 5 % 蔗糖 + 0.02% 硼酸 40.1 49.4 47 .8 45 .8 士 2 . s a
* 平均数右肩不同小写字母意味着 尸 < 0 .01 极显著差异
2 .3 不 同温度条件下的花粉萌发率
试验表明 , 不同的温度条件 , 对杜鹃红山茶花粉
的萌发是有影响的 。 在 20 ℃ 、25 ℃ 和 30 ℃ 的培养条
件下 , 对杜鹃红山茶花粉进行发芽培养 , 培养基为
巧% 蔗糖 + 0.02 % 硼酸 , 培养时间为 3h , 结果如图
2 。
在以上 3 种温度条件下 , 花粉萌发率随着温度
的升高而增大 。 20 ℃ 时 , 萌发率为 39 .35 % , 25 ℃ 培
养时 , 萌发率提高到 48 .78 % , 当温度达到 30 ℃ , 萌
发率最大 , 为 60 .23 % 。
2
.
4 不 同贮藏条件与贮藏时间下 的花粉萌发率
杜鹃红山茶花粉在不同条件下贮藏不同时间
后 , 采用最适培养基培养2h , 观察其萌发率。
在室温密封条件下贮藏的花粉 , 萌发力下降很快 。
图 2 不同培养温度下花粉萌发率
贮藏 1d 后为 38 % , 2 个月后萌发率已下降到 1% 左
右 。 在 4℃冰箱冷藏的花粉 , 萌发率随着时间的延
长而逐渐降低 , 贮藏 2 个月后花粉萌发率从 37 .
8 % 下降到 25 .6% (图 3 ) 。 在 一 加℃ 和液氮中保
生物杖术通报 B to te chn olo gy 2008 年增刊
50刀0
4 0 一 0 0
3 ( ) 刀0
} 一今一常温(jU 卜~
4℃
一泊尸 一2 0 ℃
一. 一液氮(一 1 96 ℃)
门nU伪‘l
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享哥奖擂窦缪
l。1 1周 1月 2月 17月
保存时间
图3 不同贮藏条件及贮藏时间后的花粉萌发率
存的花粉 , 萌发率在两个月内基本上没有明显变化 ,
甚至有轻微的提高 , 但保存 17 个月后萌发率出现下
降。
2
.
5 不 同贮藏条件下 的花粉活力
在常温 (20 一 2 5 ℃ ) 、 4 ℃ 、 一 2 0 ℃ 、 液氮 ( -
19 6℃ )的贮藏条件下 , 保存 1 个月后 , 采用 竹C 染
色法检测花粉的活力 。
表 2 不同贮藏条件下的花粉可染性
贮藏条件 可染色花粉%
常温 45 .0 士 2 . 8
4 ℃ 72.69 士3 6
一 20 ℃ 94
.6 士 3 . 5
一 1 9 6 ℃ 9 1.28 士4 . 8
在不同贮藏条件下保存 1个月后 , 经 Tr C 染色
检测 , 可染成红色 (粉红色)的花粉的比例仍然很
高。 常温保存 1个月后 , 有活力的花粉占50 % , 4 ℃
冰箱冷藏的花粉活力在 72 .69 % , 而 一 20 ℃及 -
196℃保存条件下 , 有活力的花粉都在 90 % 以上 。
T
C 染色法检测的花粉活力要远高于离体萌发法检
测的花粉活力 。
3 结论与讨论
3.1 关于花粉培养的时间 , 不同植物品种的差异很
大 。 有的需培养 24 h , 有的培养半小时即可进行观
察统计 。 在本研究中 , 杜鹃红山茶花粉在培养 2 -
3h 后 , 花粉管的伸长一般在 3 一 5 倍花粉粒直径 , 此
时最便于观察统计 。 若培养时间过长 , 虽然萌发率
还会有所提高 , 但由于花粉管伸长太长 , 相互缠绕 ,
给统计带来困难 , 更易导致误差 。 而且 , 在最初这
3h 中萌发的花粉是活力最强的花粉 , 也很可能是杂
交育种实践中真正发挥作用的花粉 。 因此 , 在进行
杜鹃红山茶花粉萌发率的观察比较时 , 培养 2 一 3h
后进行镜检统计最合适 。
3
.
2 不同的培养基成分对花粉萌发率的影响比较
明显 。 本研究中 , 添加硼酸对花粉萌发的有显著影
响 , 但0.01 % 与0.02 % 硼酸浓度之间的差异性并不
明显 。 观察还发现 , 较高的蔗糖浓度有利于花粉管
的伸长 。 其中 , 巧% 蔗糖 + 0 .02 % 硼 酸最适合杜鹃
红山茶花粉的萌发 。 有实验表明 , 许多植物生长调
节剂和微量元素对植物花粉的萌发有明显影响 , 如
GA 、 2 , 4 一 D , B A , N A A , I B A , C a C IZ , Z n S O 4 , V B
等[6, 8] 。 在杜鹃红山茶花粉萌发的研究中 , 这样的
影响还需进一步探索。
3
.
3 不同的培养温度对杜鹃红山茶花粉的萌发率
是有影响的。 在本研究中 , 30 ℃下花粉的萌发率最
高 。 这可能与杜鹃红山茶的生物学特性有一定关
系 , 其原生于广东温度较高的气候环境下 , 且盛花期
在 5 一 1 0 月 。
3
.
4
T
c 即 2 , 3 , 5 氯代三苯基四氮哇 , 是一种氧化
还原染料 。 花粉中呼吸酶的活跃情况能较正确地反
映其生活力的强弱 , 同时氧化还原染料能在呼吸酶
的作用下着色 , 因此可根据着色情况来判断花粉的
生活力 。
在检测花粉活力时 , 染色法最为简便快捷 ,但染
色法测定的误差相对较大 。 试验表明 , 竹C 染色法
测定的花粉活力远大于离体萌发法测定的花粉萌发
率 , 表明有活力的花粉虽然有潜在的萌发力 , 但不一
定会萌发 。 染色法较适合野外应急试验 , 不过染色
测定法的误差相对较大 。 因此 , 需要较准确的了解
花粉萌发力时 , 采用体外萌发法更为精确 。
3
.
5 为了探讨杜鹃红山茶花粉的贮藏条件和最迟
授粉时间 , 本试验研究了不同贮藏条件及贮藏时间
下 , 花粉萌发率的变化 。 结果表明 , 冰箱冷冻保存和
液氮保存是保持杜鹃红山茶花粉萌发力较好的方
法 , 试验中 , 在 一 20 ℃ 和 一 198 ℃ 条件下保存 2 个月
后花粉的萌发率几乎没有什么变化 。 常温下不适宜
长期保存杜鹃红山茶花粉 , 4 ℃冷藏下花粉的萌发力
也下降较快 。 这是因为花粉在贮藏过程中 , 仍然要
进行新陈代谢的生命活动 , 低温贮藏中可溶性糖类
年增刊 李天菲等:杜鹃红山茶花粉萌发力及贮藏耐性的研究 24 3
和有机酸类消耗较少 , 所以花粉生活力下降得较慢;
而低温干燥条件更减弱了花粉的代谢作用 , 故能保
持较长的生活力时间[” ”〕。 当然 , 花粉的含水量对
其耐贮藏能力的影响也十分大 。 这方面的试验还在
进行中 。
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2 《X〕4 , 1 6 , 58 4 一 5 9 7 .
( 上接第238 页)
和比例关系 , 构成该药材特有的色谱指纹图谱 , 可以
为药材质量的分析与控制提供可靠的依据 。
参 考 文 献
1 Minak hmetov RA , o n u e h a k
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