全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
两株高丁醇耐受细菌的分离鉴定及其
丁醇耐受特性的研究
左文朴 1 裴建新 1 庞浩 1 黄日波 1, 2
(1广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心 ,南宁 530003;
2广西大学微生物及植物遗传工程教育部重点实验室 ,南宁 530005)
　　摘 　要 : 　高浓度丁醇耐受菌株是丁醇异源重组生产的关键因素。本研究对不同环境中耐受丁醇的微生物进行筛选 ,从
自然环境中分离得到两株能够耐受高浓度丁醇的菌株 ,分别命名为 btpz2421和 btpz2623,它们耐受丁醇的浓度达到了 25 g/L。
通过分子标记物 16S rDNA的鉴定以及分子系统进化树的分析 , btpz2421被鉴定为 Lactobacillus m ucosae, btpz2623被鉴定为 Pedi2
ococcus pen tosaceus。同时 ,对它们的生理特性进行研究 ,结果显示 btpz2421和 btpz2623的最适生长温度分别为 45℃和 42℃,最
适生长 pH分别为 610和 615。
关键词 : 　丁醇耐受 分离 鉴定 16S rDNA
Isolation and Identif ication of Two High Butanol Tolerant Stra ins
Zuo W enpu1 Pei J ianxin1 Pang Hao1 Huang R ibo1, 2
(1 N ational Engineering Research Center for N on2food B iorefinery, Guangxi Academ y of Science, N anning 530003;
2 Key Laboratory of M icrobial and P lant Genetic Engineering of M inistry of
Education, Guangxi University, N anning 530005)
　　Abs trac t: 　Strains which can grow in high concentration of butanol is key factor for butanol p roduction. W e screened environemnt
for butanol tolerant m icroorganism s. Two butanol tolerant strains, which was named btpz2421 and btpz2623 respectively, were isolated.
They can grow in a concentration of butanol up to 25 g/L. The 16S rDNA sequences analysis of these two strains and the phylogenetic
tree analysis revealed that btpz2421 and btpz2623 was Lactobacillus m ucosae and Pediococcus pen tosaceus, respectively. The op timal grown
temperature for these two strains is 45℃ and 42℃ individually, and the op timal pH is 610 and 6151
Key wo rds: 　Butanol tolerance Isolation Identification 16S rDNA
收稿日期 : 2009209207
基金项目 :国家科技支撑 (2007BAD75B05) ,广西科学院基本科研业务费资助项目 ( 09YJ17SW05) ,微生物及植物遗传工程教育部重点实验室
开放课题基金 (J0804)
作者简介 :左文朴 (19832) ,男 ,硕士 ,研究方向 :发酵工程 ; E2mail: wenpuz@163. com
通讯作者 :黄日波 ,教授 ,博士生导师 ; E2mail: p riboh@gxu. edu. cn丁醇所具有的高能量、低亲水性、高辛烷值以及不易挥发等特点决定了丁醇将成为一种比乙醇更具优势的液体燃料 [ 1 ] 。随着石油资源的日益枯竭以及价格的居高不下 ,使得用生物法生产丁醇又重新回到人们的视野当中 [ 2 ] 。然而 ,传统的丙酮丁醇梭菌 ABE发酵法生产丁醇存在得率较低的缺点 ,这在分批发酵过程中表现尤为突出。同时 ,由于丁醇在发酵液中的浓度较低 ,导致后续分离步骤的能耗较高 ,并且产生大量的废水 ,环保压力 大。这些因素在很大程度上制约了丁醇发酵工业的发展。报道显示 ,在 ABE发酵中由于梭菌 ( C lostrid i2um )对丁醇较为敏感 ,导致其产丁醇或者耐受丁醇的浓度均无法超过 20 g/L [ 3～5 ]。换句话说 , 20 g/L的丁醇产量是目前 ABE法发酵生产丁醇的极限。国际上有相当多的研究机构及学者们采用各种方法 ,如选育突变菌株或者连续富集以提高梭菌耐受丁醇的能力 ,在这些研究中 ,梭菌对丁醇的耐受度由
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最初的 5 g/L提高到了 15 g/L。但是这些梭菌的突
变菌株对丁醇耐受度的提高是有限的 ,而且这些菌
株的突变并未获得产丁醇能力的提高 [ 3 ] ,因为梭菌
从产酸过程到产溶剂过程的过渡中 ,许多复合因子
对该细胞代谢过程进行着复杂的调节和控制 ,因而
不管是通过菌株突变还是通过代谢工程改造的途径
获得发酵高产的梭菌菌株都是非常困难的 [ 6～8 ]。解
决这一问题的可行策略是在能够耐受高浓度丁醇的
宿主菌中建立一整套产丁醇的途径。
目前 ,利用大肠杆菌作为宿主菌 ,构建一套全新
的代谢途径进行丁醇生产的研究已经获得成
功 [ 9, 10 ]。但是由于大肠杆菌本身对丁醇的耐受性并
不高 ,并不适合用于工业大规模生产丁醇。因而 ,寻
找一个能够耐受高浓度丁醇的微生物作为丁醇重组
生产的宿主是非常重要的。从自然界环境中分离筛
选获得 2株能够耐受 25 g/L丁醇的菌株并对它们
做了初步研究 ,为下一步对该菌株的代谢工程改造
生产丁醇奠定了基础。
1 材料与方法
111 材料
11111 样品采集 从牛的粪便、污水、污水池的污
泥以及堆肥中采集固体或者液体样本。
11112 培养基 　普通培养基 ( g /L ) :蛋白胨 1010,
牛肉膏 810,酵母膏 410,葡萄糖 2010,乙酸钠 510,
吐温 80 110,柠檬酸氢二铵 210,磷酸氢二钾 210,
MgSO4 ·7H2O 012,MnSO4 ·H2 O 0105, pH 612。
筛选培养基 Ⅰ:在普通培养基中添加 20 g/L的
正丁醇。
筛选培养基 Ⅱ:在普通培养基中添加 25 g/L的
正丁醇 , 20 g/L的琼脂。
筛选培养基 Ⅲ:在普通培养基中添加 25 g/L～
30 g/L的正丁醇。
112　筛选方法
11211 初筛 将采集的样品用无菌水打散后接入
盛有 30 m l筛选培养基 Ⅰ的试管中 ,于 37℃恒温培
养 48 h,筛选能够耐受 20 g /L丁醇的菌株。将能够
生长的样品管中的菌液在筛选培养基 Ⅱ上划线 ,
37℃培养 48 h,获得单菌落。
11212 复筛 将初筛获得的单菌落挑至普通培养
基中 ,生长达到 OD值约为 110后转接 1 m l至盛有
30 m l筛选培养基 Ⅲ的试管中 , 37℃培养。
113 菌株的鉴定以及进化树的构建
提取菌株的总 DNA作为 PCR反应的模板 ,利用
16S rDNA引物扩增得到 16S rDNA,测序分析后将获得
的序列在 GenBank数据库 (www. ncbi1nlm1nih1gov)中
进行比对分析鉴定菌株。
16S rDNA 引物序列 : 16 sF: 5′2AGA GTT TGA
TCA TGG CTC AG23′; 16 sR: 5′2TAC GGT TAC CTT
GTT ACG ACTT23′。
进化树利用 MEGA 411软件进行构建。方法选
择 Neighbor2Joining (邻接法 ) ,利用 Bootstrap进行分
析 , Bootstrap参数选择 1 000次重复 ,模型选择 nu2
cleotide→Maximum Composite L ikelihood。
114 菌株耐受丁醇曲线测定
为了防止丁醇挥发 ,在带橡皮胶塞的三角瓶中
进行菌株耐受丁醇培养和耐受曲线测定。在普通培
养基上添加不同浓度的丁醇 ,丁醇浓度 ( g /L )分别
为 0, 5, 10, 15, 20, 25, 28, 30,取过夜培养的菌液以
1%的接种量接至各个不同浓度丁醇的三角瓶中 ,
37℃静置培养 ,通过测定 OD600来检测菌株的生长
情况。
2 结果与分析
211 菌株的筛选
利用筛选培养基 Ⅰ从采集样品中初筛获得了
35株能在丁醇浓度为 20 g /L的培养基中生长的菌
株 ,通过复筛获得 2株能够在 25 g/L丁醇的培养基
上生长的菌株 ,分别命名为 btpz2421和 btpz2623。
212 菌株 16S rDNA鉴定及进化树分析
将 btpz2421和 btpz2623菌株的 16 s rDNA序列在
GenBank中进行同源比对分析 ,发现它们分别与
L actobacillus m ucosae和 Ped iococcus pen tosaceus具有
99%的同源性。利用它们的 16 s rDNA序列构建进
化树 ,如图 1所示。
651
2009年第 12期 左文朴等 :两株高丁醇耐受细菌的分离鉴定及其丁醇耐受特性的研究
图 1　基于 btpz2421( A)和 btpz2623( B)菌株 16S rD NA序列的进化树构建分析
213 菌株的生理特性研究
菌株 btpz2421和 btpz2623能够在严格厌氧以及
微氧的环境生长 ,在好氧条件下生长受到抑制。
它们的生长温度和生长 pH如图 2,图 3所示。由
图 2中可见 ,菌株 btpz2421的生长温度范围为 25～
50℃,最适生长温度为 45℃;菌株 btpz2623的生长
温度范围为 20～50℃,最适生长温度为 40℃。由
图 3中可见 ,菌株 btpz2421和 btpz2623的生长 pH
范围均为 310～1010,其最适生长 pH分别为 610
和 615。在最适生长温度和最适 pH 条件下 ,以
1%的接种量进行接种 ,它们的生长曲线如图 4所
示。由图中可以看出 , 12 h以后它们的生长可以
达到稳定期。
214 菌株的丁醇耐受性质研究
37℃条件下 ,菌株 btpz2421和 btpz2623的丁醇耐
受情况 ,如图 5所示。由图中可以看出 ,当丁醇浓度
为 20 g/L以下时 ,菌株能够非常良好的生长 ,当丁
醇浓度达到 25 g/L时 ,菌株的生长受到一定程度的
抑制 ,但是依然能够较好的生长 ,当丁醇浓度达到
28 g/L以上时 ,菌株的生长基本陷于停滞 ,受到明
显的抑制。这表明 ,菌株 btpz2421和 btpz2623能够耐
受丁醇的最高浓度为 25 g /L。
图 2 温度对 btpz2421( A)和 btpz2623( B)菌株生长的影响
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3 讨论
基因工程操作中常见的很多菌株都可以作为丁
醇异源重组生产的宿主 ,如大肠杆菌 ,酵母菌等。但
是 ,重组菌株能够产高浓度丁醇的基础是宿主菌具
备耐受高浓度丁醇的能力 ,因而寻找耐受高浓度丁
醇菌株是丁醇异源重组生产的关键因素之一。有研
究表明 [ 11 ] ,大肠杆菌属中的 Escherich ia coli K12最
高能够丁醇浓度为 8 g/L ,酵母菌属中的 Saccharo2
m yces cerevisiae最高能够耐受丁醇浓度为 16 g /L ,乳
酸菌属的 L actobacillus brevis最高能够耐受丁醇浓度
为 24 g /L。本研究中筛选得到的两株乳酸细菌最高
能够耐受丁醇浓度为 25 g/L ,比这些报道的菌株耐
受度都高 ,利用这两个菌株进行基因工程改造生产
丁醇具有极高的应用价值。
目前 ,构建能够代谢生产丁醇的异源重组工程
菌株的途径主要有两条 :一条途径是通过将丙酮丁
醇梭菌中的产丁醇的相关基因克隆至所选择的宿主
中 [ 12 ] ,这些基因包括 :乙酰辅酶 A 乙酰基转移酶
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2009年第 12期 左文朴等 :两株高丁醇耐受细菌的分离鉴定及其丁醇耐受特性的研究
(Acetyl2CoA acetyltransferase) , 32羟丁酰辅酶 A脱氢
酶 (32Hydrox2ybutyryl2CoA dehydrogenase) ,巴豆酸酶
(Crotonase) ,丁酰辅酶 A脱氢酶 ( butyryl2CoA dehy2
drogenase) ,丁醛脱氢酶 (Butyraldehyde dehydrogen2
ase) ,丁醇脱氢酶 (Butanol dehydro2genase)。另一条
途径 [ 10 ]是利用宿主原有的氨基酸合成途径 ,通过引
入 22酮酸脱羧酶 (22Keto2acid decarboxylase)和醇脱
氢酶 ( alcohol dehydrogenase)基因使其代谢转向丁醇
合成途径。这些代谢途径的改造在大肠杆菌中已经
成功实现。在本研究中获得的 btpz2421和 btpz2623
具有生长周期快的优点 ,它们的生长速率和大肠杆
菌相似 ,在 16h内达到生长的稳定期。但是它们的
丁醇耐受性远远高于大肠杆菌 ,因而 btpz2421和 bt2
pz2623是更适宜的丁醇重组生产菌株。
本研究从自然环境中分离得到二株能够耐受高
浓度丁醇的菌株 ,一方面为下一步对该菌株的代谢
工程改造奠定基础 ;另一方面 ,为研究丁醇的耐受机
制提供了良好的材料。
参 考 文 献
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duction of Four Carbon A lcohols [ P ]. United States, 200801
82308, 2008.
·科学出版社新书 ·
中国瓢虫原色图鉴
任顺祥　王兴民　庞虹　彭正强　曾涛　编著
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