全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
肌球蛋白 X干涉载体的构建与鉴定
王俊杰 1, 2 丁伟1 于龙1 朱磊 1
( 1曲靖师范学院生物资源与环境科学学院,曲靖 655011; 2东北师范大学细胞与遗传研究所,长春 130024)
摘 要: 肌球蛋白 X( M yos in X, M yo X )是近年来发现的在细胞运动中发挥重要功能的非传统型肌球蛋白,但其发挥功
能的分子机制目前尚不明确, RNA干扰技术是目前研究基因功能常用的方法。构建针对鼠的 M yo X基因 mRNA的 shRNA真
核表达载体, 并转染 NLT细胞, 观察其对 M yo X表达的抑制效应。结果显示, shRNA-2能够有效地降低 M yo X的蛋白表达水
平, 而 shRNA-1则不能。进一步分析显示, 转染 shRNA-2的 NLT细胞丝状伪足的形成受到抑制, 表明 shRNA-2是能够抑制
M yo X表达的干涉载体,此干涉载体的构建为进一步研究 M yo X的新功能,揭示其作用的分子机制奠定基础。
关键词: 肌球蛋白 X RNA干涉 丝状伪足 shRNA 表达水平
Construction and Identification ofM yosin X Interference Vector
W ang Junjie
1, 2 DingW e i1 Yu Long1 Zhu L ei1
(
1
College of B iology and Enviromental Sciences, Q ujingN ormal University, Qujing 655011;
2
Institute of Cy tology and Genetics,
N or theastN ormal University, Changchun 130024)
Abstrac:t M yosin X is an unconventiona lmyo sin w hich have a ro le in the ce llu larm otility, but the assoc iated m o lecularm echa-
n ism is not we ll known. RNA i ( RNA in terference) is a powe rfu l too l presently known in the study of gene function. In th is study, a re-
comb inant vec to r ca rry the shRNA ofM yo X w as construc ted and transferred toNLT ce lls. The expression ofM yoX w as suppressed by
shRNA-2 but shRNA-1 d id not have obv ious e ffect on the expression leve .l Immuno fluo rescence assay show ed that the filopod ial form a-
tion w as suppressed in NLT ce lls transfected w ith shRNA-2. The re fo re, vecto r shRNA-2 is e ffic ient in the inte rferingM yo X express ion
wh ich would be useful in the study ofM yo X.
Key words: M yosin X RNA inte rference F ilopod ia shRNA Expression leve l
收稿日期: 2010-06-13
基金项目:云南省教育厅科学研究基金项目 ( 2010Y080 ) ,曲靖师范学院青年基金项目 ( 2009QN020)
作者简介:王俊杰,女,博士,讲师,研究方向:分子遗传学; E-m ai:l jun jw angcn@ yahoo. com. cn
肌球蛋白 (M yo X)是一类近些年来发现的普遍
存在于哺乳动物中的非传统型肌球蛋白, 这种蛋白
分布在动物各种组织当中且表达量较低。经过近十
年的研究,人们逐渐发现, M yo X作为一种细胞骨架
蛋白在多种细胞运动中发挥着重要作用, 如丝状伪
足形成、丝足内运输、细胞吞噬、有丝分裂以及细胞
迁移和轴突导向等。
丝状伪足是细胞的细长突起, 中间由一束平行
排列的肌动蛋白纤维组成, 在细胞的运动过程中起
感受器的作用,能够感受细胞周围环境的变化,并与
周围环境中的分子相互作用 [ 1]。M yo X调节丝足的
产生和延伸过程 [ 2] ,其动力马达区对于丝足的形成
非常重要,尾部结构域通过与细胞基质相互作用能
够使丝足更加稳定 [ 2, 3]。
在神经系统的早期发育过程中, 神经细胞迁移
到目的地后,开始生长出轴突和树突,神经元的轴突
精确投射到靶位点,形成突触联系是建立精确的神
经回路的关键步骤。M yo X能够与神经导向因子
Netrin-1的受体 DCC和 Neogen in相互作用 [ 4] , N e-
trin-1是一类在神经轴突导向和神经细胞迁移等过
程中发挥重要作用的蛋白, M yoX通过Ne trin-1介导
的信号传导路径参与调节神经轴突的生长和导向。
另外, M yo X在神经嵴细胞的迁移过程中发挥重要
作用, M yo X的表达异常导致神经嵴细胞向咽弓的
迁移受阻,导致软骨发育不全并抑制三叉神经突起
的生长 [ 5]。M yo X在脑内存在的无头形式异构体也
2011年第 2期 王俊杰等:肌球蛋白 X干涉载体的构建与鉴定
参与调节了 GnRH神经细胞的迁移过程 [ 6]。除了
对神经细胞的迁移产生影响外, P i等 [ 7]报道, M yo X
通过调节丝足的形成从而在骨形成蛋白分子 ( bone
m orphogene tic pro teins, BM P)诱导的内皮细胞定向
迁移中发挥重要作用。
此外, M yo X还在细胞吞噬、有丝分裂、减数
分裂等过程中也发挥了作用。M yo X的尾部结构
域能够与 PI3激酶的下游分子 PIP3相互作用,
P I3激酶是肿瘤和细胞迁移过程中的一个重要信
号传导分子 [ 8, 9]。尾部还能够与整联蛋白 ( inte-
grin)相互作用, integ rin是细胞迁移过程中重要
的信号转导分子, 是胞内胞外信号传导的重要受
体 [ 10, 1 1]。众多迹象表明, M yo X是细胞运动和个
体发育过程中发挥重要作用的一个骨架蛋白, 但
其功能的进一步揭示和分子机制的阐明还需要
更加深入的研究。
RNA干扰 ( RNA interference, RNA i)是正常生
物体内抑制特定基因表达的现象, 当细胞中导入与
内源性 mRNA 编码区同源的双链 RNA ( doub le
stranded RNA, dsRNA )或短发卡 RNA ( short ha irpin
RNA, shRNA )时, 该 mRNA发生降解而导致基因不
表达或表达水平降低 [ 12]。因其具有特异性和高效
性,已经成为研究基因功能的重要工具。本研究旨
在通过分子克隆技术构建靶向 M yo X的 shRNA的
干涉载体, 抑制 M yo X基因的表达, 为进一步研究
M yo X在细胞运动中的功能以及它在信号传导中的
作用奠定基础。
1材料与方法
1. 1材料和试剂
NLT细胞系 (由美国熊文诚博士惠赠 ); 脂质体
细胞转染试剂 L ipo fectam ine 2000购于 Inv itrogen公
司; SuoerS igna lW est P ico Chem ilum inescent Substrate
( Ca.t No. 34077) 购于 PIERCE公司; 兔源 M yo X抗
体由美国佐治亚医学院熊文成老师馈赠; 鼠源肌动
蛋白抗体 ( Ca.t No. A 5441)购于 S igm a公司。
1. 2 M yo X靶向 siRNA设计与合成
针对小鼠 M yo X的 cDNA序列 ( GenBank登录
号: NM _019472) ,利用 Dharm acon公司的在线设计
软 件 siDES IGN ( http: / /wwwdharm aconcom /
DesignCenter)寻找候选 M yo X RNA i靶点序列。通
过 BLAST( http: / /www. ncb.i nlm. n ih. gov /BLAST / )
同源性比对分析其是否具有基因特异性。根据
pSUPER EGFP1载体要求设计合成 siRNA寡核苷酸
模板。寡核苷酸序列由上海生工生物科技有限公司
合成。从 10条候选序列中选取 2条进行合成。选
取序列分别为: 5-GGAAGATATTGACTGGATA-3和
5-CCAGACGAGAAGATATTTA-3。按照 RNA干涉
载体 pSUPER EGFP1的要求, 每段各设计一对各长
64个碱基的序列,由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成。序列如下:
shRNA1: 5-GATCCCCGGAAGATATTGACTGGATATTC-
AAGAGATATCCAGTCAATATCTTCCTTTTTGGAAA-3,
5-AGCTTTTCCAAAAAGGAAGATATTGACTGGATA-
TCTCTTGAATATCCAGTCAATATCTTCCGGG-3;
shRNA2: 5-GATCCCCCCAGACGAGAAGATATTTATTC-
AAGAGATAAATATCTTCTCGTCTGGTTTTTGGAAA-3,
5-AGCTTTTCCAAAAACCAGACGAGAAGATATTTA-
TCTCTTGAATAAATATCTTCTCGTCTGGGGG-3。
1. 3构建 pSuper shRNA载体
将合成的寡核苷酸用双蒸 H 2O溶解至终浓
度为 1 mm o l/L, 取寡核苷酸 1 L, 加入 48 L的
退火缓冲液 ( 100 mm o l/L醋酸钾、2 mm o l/L醋酸
镁、30 mm o l/L H EPES-KOH, pH 7. 4 )中, 95 5
m in后缓慢冷却退火至室温, 形成双链。再与经
Bgl 和 H ind 双酶切的 pSU PER-EGFP1载体
连接后转化 DH 5感受态细胞, 挑取抗卡那霉素
( 100 g /mL)的阳性克隆, 培养后少量抽提重组
质粒, 经 E coR 、H ind 双酶切鉴定, 将初步酶
切鉴定正确的质粒送到上海生工生物工程技术
服务有限公司测序。
1. 4 NLT细胞的培养和转化
用含 10%新生牛血清的 DMEM高糖培养基在
37、5% CO 2条件下培养 NLT细胞。当细胞生长
融合度达到 80%以上用脂质体进行转化。转化步
骤按照 Lipofectam ine 2000( Inv itrogen )说明书进行
操作,转染 24 h后观察转染效率。
1. 5蛋白印迹分析
将转染 24 h且转染效率较高的 NLT 细胞用
001 mm o l/L PBS冲洗 1遍,用 R IPA蛋白提取液进
行裂解。将裂解物进行离心, 13 000 r /m in, 4 离
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
心 15 m in,取上清。蛋白浓度利用考马斯亮蓝染色
进行测定, 蛋白上样量约为 100 g, 用 8% SDS-
PAGE进行分离。半干转方法将胶上的蛋白转到醋酸
纤维素膜上, 5%脱脂奶粉封闭 2 h, 加入一抗 (兔源
M yo X抗体 12 000;鼠源肌动蛋白抗体 15 000),室温
孵育 2 h或 4过夜, TBST 充分漂洗后加入辣根过
氧化物酶标记的二抗 (羊抗兔或小鼠 IgG, 15 000)
孵育 1 h,最后用 ECL ( Pierce, Rock ford, IL, U SA)法
显色。蛋白相对含量通过图像分析软件 Im age J
143u进行测定。
2结果
2. 1 M yo X shRNA干涉载体的双酶切鉴定
从载体连接产物转化平板上挑取卡那霉素抗性
克隆提取质粒, E coR I和H ind III双酶切鉴定, 用空
载体作为对照, 空载体双酶切获得片段为 227 bp,插
入 shRNA片段的载体比空载体长 64 bp,切出的片
段应为 291 bp,鉴定结果 (图 1)表明,泳道 1是插入
shRNA 1的阳性质粒,泳道 5和 6为插入 shRNA 2
的阳性质粒。泳道 2、3、4和 7是没有插入目的片段
的阴性质粒。将初步鉴定连接正确的载体分别命名
为 pSuper-shRNA 1-1, pSuper-shRNA 2-1, pSuper-
shRNA 2-2, 载体经测序得出插入序列完全正确,证
实载体构建成功。从中选取插入序列 shRNA 1的
载体 pSuper-shRNA 1-1和插入序列 shRNA 2的载体
pSuper-shRNA 2-1进行细胞转染,鉴定其干涉效率。
M. 100 bp DNA ladder; 1.插入 shRNA1的阳性质粒; 2 -
4, 7.未插入目的片段的阴性质粒; 5, 6.插入 shRNA2的
阳性质粒; 8.空载体对照
图 1 Myo X的干涉载体 pSuper shRNA构建的酶切验证图
2. 2 shRNA抑制 M yo X蛋白的表达
将重组载体 pSuper-shRNA 1-1、pSuper-shRNA
2-1和空载体 pSuper分别转染小鼠来源的 NLT细
胞,转染 24 h后选取转染效率高于 80%的样品提
取蛋白进行 W estern b lo t分析。NLT细胞中表达
M yo X全长和无头形式两种异构体分子量分别为
240 kD和 165 kD。结果显示, 转染 pSuper-shRNA
1-1的细胞中与对照相比 M yo X蛋白的含量没有
减少, 而转染 pSuper-shRNA 2-1的细胞中 M yo X
的两种异构体的蛋白含量与对照相比明显降低
(图 2) ,以肌动蛋白 actin含量作为内参照。结果
表明, pSuper shRNA 1没有干涉作用而 pSuper
shRNA 2对于肌球蛋白 X的表达具有抑制作用。
通过 Im age J软件分析得出转染 pSuper-shRNA 2-1
的 NLT细胞中 M yo X蛋白总含量与对照相比减
少 51%。
图 2 Western blot免疫印迹检测干涉质粒 pSuper-shRNA
1-1和 pSuper-shRNA 2-1对于目的基因的干涉效果
23 M yo X蛋白表达水平降低抑制丝足的形成
质粒 pSuper-shRNA 2-1和对照质粒分别转染
到 NLT细胞, 免疫荧光分析显示, 转染对照质粒的
细胞中, 细胞产生丝足并且 M yo X在丝足顶端有
明显积累。转染 pSupser shRNA的 NLT细胞丝足
数目减少, 并且 M yo X在丝足上定位的现象消失
(图 3)。
3讨论
肌球蛋白 X是目前研究较少的非传统型肌球
蛋白之一,初步研究显示,它在细胞多种运动过程中
发挥着重要作用, 例如, 细胞伪足形成,胞内信号分
子运输、细胞迁移、细胞分裂等 [ 13]。但对于其具体
的作用机制了解较少。RNA干涉技术能够快速、有
效、特异性地降低目的基因的表达,目前已广泛应用
于基因功能的研究 [ 14]。
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2011年第 2期 王俊杰等:肌球蛋白 X干涉载体的构建与鉴定
将对照载体和干涉载体 pSuper shRNA2分别转入 NLT细胞,被转染细胞 24 h后表达绿色荧光蛋白,细胞免疫荧光染色观察细胞形
态,肌球蛋白 X用红色探针标记。表达对照载体的 NLT细胞,肌球蛋白 X分布在细胞质中,并且在丝足顶端聚集,箭头表示丝状
伪足;表达肌球蛋白 X siRNA干涉质粒的细胞,没有明显的丝足产生,并且观察不到肌球蛋白 X定位到丝足上的现象
图 3 分别转染对照载体和干涉载体的 NLT细胞
本试验利用真核表达载体 pSuper EGFP 1构建
M yo X的 RNA i重组体。利用设计软件选取目的基
因靶点序列克隆入质粒载体内,重组体进入细胞后,
能够在哺乳动物细胞中转录成发夹状双链 RNA分
子,识别靶基因,诱导基因沉默。研究显示, 根据某
一靶基因序列随机设计的 siRNA, 其抑制基因表达
的成功率仅约 25% ,根据软件设计的 siRNA抑制表
达的成功率也达不到 100%。因此构建载体时应选
取多条序列进行试验分析。本试验选取的是分别位
于目的基因 5端和 3端且参数较优化的两条序列
构建载体,并在蛋白水平上检测其抑制基因表达的
效果。
NLT细胞是从转基因小鼠嗅球附近的肿瘤中分
离出来的 GnRH神经元细胞的亚克隆系, 具有分泌
GnRH十肽和迁移的能力, 是研究 GnRH神经元迁
移特性和生理功能的良好模型 [ 15– 17 ]。本试验成功
构建了针对鼠 M yo X的真核表达干涉载体, 并转入
NLT细胞中。由于 NLT细胞磷酸钙转染效率不高,
因此采用脂质体转染的方式以达到较高的转染效
率。M yo X在脑中表达全长形式和无头形式两种异
构体, 两种异构体的大小分别为 240 kD和 165
kD
[ 18]。转染 24 h后,分析细胞内 M yo X的蛋白表
达水平发现, pSuper-shRNA 2-1可明显抑制 M yo X
的表达, 使目的蛋白的表达总量与对照相比减少
51% ,而 pSuper-shRNA 1-1对蛋白的表达没有抑制
作用,并且转染 pSuper-shRNA 2-1的细胞丝状伪足
的形成受到抑制。这说明试验设计合成的针对鼠的
pSuper shRNA 2表达载体能够有效抑制 M yo X基因
的表达, 从而为进一步研究 M yo X的新功能, 揭示
其分子机制奠定基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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