全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(1)：107一 儿2 2008年 1月
辣椒 CaNPR1一RNAi表达载体的
构建及其对辣椒的转化
罗 欢1，2，段承杰 一，陈保善1一，唐纪良1 ，冯家勋1，2
(1．广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，南宁 530005；2．广西大学 生命科学与技术学院，南宁 530005)
摘 要：从辣椒中克隆到一个与拟南芥系统获得抗性正调节基因NPR1同源的CaNPR1基因的全长 cDNA。
辣椒 CaNPR1基因与拟南芥 NPR1基因在 mRNA水平上同源性为 62．9 ，两者的编码产物一致性为
49．7 ，相似性为65．7 。为鉴定该基因的功能，构建了一个以CaNPR1基因为靶基因的RNA干涉辣椒表
达载体pCaNPR1一RNAi，并用根癌农杆菌介导法转化辣椒桂研五号，共获得了6株卡那霉素抗性再生苗，经
Southern杂交证实 ，这些再生苗均为转基因植株，为进一步鉴定该基因的功能奠定了基础。
关键词：CaNPR1基因；克隆；RNA干涉；辣椒遗传转化
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2008)01—0107—06
Construction of pepper NPR1·_RNAi expression
vector and its transformation to pepper
LUO HuanI，一，DUAN Cheng-JieI，2，CHEN Bao—Shan1，2
TANG Ji—LiangI ，FENG Jia_Nun1，2
(1．Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and Utilization，Guangxi University，Nanning
530005，China；2．College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China)
Abstract．Ful—length cDNA of CaNPR1，a homologous gene of the positive regulatory gene NPR1 in systemic ac—
quired resistance of Arabidopsis thaliana，was cloned from pepper(Capsicum annuuTn)．CaNPR1 and NPR1 share
62．9 homology at mRNA level and their encoded products have 49．7 identity and 65．7 similarity．In order to
identify the function of CaNPR1 in SAR of pepper，an expression vector pCaNPR1一RNAi for silencing& NPR1 in
pepper was constructed．Pepper cultivar Guiyan5 was transformed with pCaNPR1一RNAi by Agrobacterium tumefa—
ciens—mediated transformation．Six kanamycin-resistant transgenic seedlings were obtained．Southern analysis con-
firmed that all the six seedlings carried the introduced transgene．
Key words：CaNPR1 gene；cloning；RNA interference；pepper transformation
辣椒(Capsicum annuum)，又名番椒、秦椒、青
椒、海椒等，为茄科辣椒属作物，在我国各地广为栽
培。但是辣椒青枯病、疫病、病毒病等病害常年发
生，严重时造成 5O 以上的辣椒死亡甚至绝收(葛
红莲等，2004；张淑莲等，2003)。由于新品种选育历
程较长和常规育种方法的局限性，使辣椒增产及品
质改良存在着一定的困难。近几年来，基因工程迅
速发展，使人们能将有益外源基因导人辣椒基因组
中进行辣椒品质改 良(李颖等，2005；毕玉平等，
l999)，为培育抗病害的辣椒品种提供了新的手段。
植物系统获 得抗性 (systemic acquired resist—
ance，SAR)是植物受物理、化学或生物因子作用后，
收稿 日期：2006—06—30 修回日期 ：2007-01—24
基金项目：广西创新能力建设项目(0322027—2)；教育部高等学校骨干教师资助计划(E2000]65)[Supported by Innovation Capacity Development pro—
gram of Guang)d(o322O27—2)Foundation for Distinguished Teachers in High Schools of State Education Ministry(J2000]65)]
作者简介：罗欢(1980一)，女，广西桂林人，硕士研究生，主要从事植物分子生物学研究。
通讯作者(Author for corfespondence，E-mail：feng@public．nn．gx．cn)
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在较长的时间内整株表现出的对较广泛的病原微生
物(病毒、细菌、真菌)的抗性(Durrant等，2004)。
拟南芥 NPR1(nonexpressor of PR genes)基 因／
NIM1(nonimmunity)基因／SAI1(salicylic acid in—
sensitivity)基因是拟南芥抗病信号传导途径中正向
调节其系统获得抗性的关键基因(Cao等，1997；Ry—
als等，1997；Shah等，1997)。至今已在多种植物如
油菜、白菜、番茄、马铃薯、玉米、小麦、烟草、水稻、苹
果和桔子中发现存在有 NPR1基因的同源序列
(Liu等，2002；Cao等，1998)。在拟南芥 (Cao等，
1998；Friedrich等，2001)、番茄(Lin等，2004)、水稻
(Chern等，2001)中过量表达 NPR1基因可显著提
高植物的抗病能力。
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是广泛
存在于真核生物中、通过正反义 RNA形成双链
RNA(dsRNA)从而特异性地抑制靶基因的转录后
表达的现象(Wang等，2005)。应用 RNAi技术能
够获得基因表达受抑制的转基因植株(Wesley等，
2001)，这将有助于我们对基因功能进行分析。本研
究从辣椒 中克隆到一个与拟南芥 NPR1同源的
CaNPR1基 因的全 长 cDNA，构建 了一个针对
CaNPR1基因的 RNA干涉辣椒表达载体，并将其
通过根癌农杆菌介导法转化辣椒桂研五号，共获得
六个独立的转基因阳性株系，从而为下一步进行
CaNPR1基因的功能鉴定提供了很好的植物材料。
1 材料与方法
1．1材料
(1)细菌菌株和质粒：本工作所用细菌菌株及质
粒见表 1。(2)细菌培养基和培养条件：大肠杆菌用
LB培养基(Sambrook等，2001)37℃培养。根癌农
杆菌用 YEB培养基(Van等，1977)28℃培养。(3)
辣椒品种：桂研五号。(4)辣椒 CaNPR1基因全长
cDNA克隆所使用的引物(表 2)，由上海鼎安生物
科技有限公司合成。(5)辣椒组织培养和遗传转化
的培养基(表 3)。
1．2方法
1．2．1 DNA操作 质粒 DNA的提取、纯化、酶切、
回收，DNA的连接，质粒的转化等均按标准程序
(Sambrook等，2001)。
1．2．2辣椒 CaNPR1基因全长 cDNA的克隆 使
用小量柱离心式植物总 RNA抽提试剂盒(上海华
舜)提取辣椒总 RNA。以辣椒总 RNA为模板，用
SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Bio—
sciences)反转录合成 3 RACE第一链 cDNA。以
AP及 PNF1为引物、辣椒 3 RACE第一链 cDNA
为模板进行第一次 PCR；以 AUAP和 PNF2为引
物、第一次 PCR产物(稀释 2O倍)作模板进行第二
次 PCR，即得到 3 RACE产物。
表 1 本研究使用的质粒和菌株
Table 1 Plasmids and bacterial strains used in this study
以辣椒总RNA为模板、RT为引物，使用 Rever—
tAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公
司)反转录合成 5 RACE第一链 cDNA。按 5，-Ful
RACE Core Set(TaKaRa)说明书程序将 5 RACE第
一 链 cDNA进行环化形成首尾连接物，以A1和 S1
为引物、连接产物(稀释 1O倍)为模板进行第一次
PCR，以A2和S2为引物、第一次 PCR产物(稀释 1o
倍)为模板进行第二次PCR，即得到第一次 5 RACE
产物。
将第一次 5 RACE产物测序，根据测序所得序列
设计第二次 5 RACE的引物 RT 、A1 、S1 、A2 和
S2 ，第二次 5 RACE的方法与第一次 5 RACE的完
全相同，以RT 为引物进行反转录，以A1 和S1 为引
物进行第一次 PCR，以A2 和 S2 为引物进行第二次
PCR，即得到第二次 5 RACE产物。
将经测序的3 RACE序列和两次 5 RACE序列
拼接起来得到全长 cDNA序列，根据该序列设计引物
UPNPR1和 DPNPR1，RT-PCR扩增 含 CaNP尺1基
因全长cDNA完整 ORF的DNA片段，回收该片段并
与pGEM-3zf(+)载体相连，转化大肠杆菌 DH5d感
受态细胞，筛选阳性重组子，即得到含 NP尺1基因
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1期 罗欢等：辣椒 CaNPR1一RNAi表达载体的构建及其对辣椒的转化 109
全长cDNA完整 ORF的克隆并测序证实。 。C 3O s，55。C 3O s，72。C 2 min，反应3O个循环，最后
上述PCR扩增条件均为 95℃变性 2 min后，95 72℃延伸 10 min。
表 2 辣椒 CaNPR1基因全长 cDNA克隆所使用的引物
Table 2 Primers used in full length cDNA cloning of CaNPR1
表 3 用于辣椒组织培养和遗传转化的培养基
Table 3 Media used for pepper
tissue culture and transformation
u
基
m
成分 c。mp。⋯ t
MS MS minera1，MS vitamins，30 g／I sucrose，3 g／L
phytagel，pH5．8
MS medium，2 mg／I 6-BA，0．5 mg／I IAA，100 uM
AS，2 mg／L AgNO3，3 g／L phytagel，pH5．8
M S medium ，100 uM AS，pH5．8
MS medium，2 mg／L ZT，0．5 mg／I IAA，200 mg／I
cefotaxime，50 mg／L Km，2 mg／L AgNOa，3 g／L
phytagel，pH5，8
MS medium，1 mg／I ZT，0．2 mg／L IAA，200 mg／L
cefotaxime，5O mg／I Km，2 mg／L AgNO3，2 mg／I
GA3，3 g／I phytagel，pH5．8
1／2 MS mineral，MS vitamins，30 g／L sucrose，3 g／
I phytagel，0．5 mg／I NAA，0．2mg／I IAA，100
1．2．3 RNA干涉辣椒表达载体的构建 参考 Wes—
ley等(2001)的构建策略。根据马铃薯 GA20氧化
酶基因的第一个内含子核苷酸序列设计引物 intF
(5-GACGGATCCTGTTAACCACGTGAACTAG
TGTACGGACCGTACTACTCTATTCGTT一3 )和
intR1(5 一GACGAGCTCCCGGGGGTACCCTATA
TAATTTAAGTGGAAAAAAAGGTTAAC一3 )，
以质粒 pCAMBIA13O1一int为模板进行 PCR扩增，
扩增条件为 95。C变性 2 min后，94℃ 30 S，48℃
3O S，72℃ 4O S，反应 1O个循环，再进行 94℃ 3O S，
65℃ 3O S，72℃ 40 S，反应 2O个循环，最后72℃延
伸10 min。根据辣椒 CaNPR1基因全长 cDNA序
列设计引物 PNIF1(5，_GGCGGATCCGAGCTCGC
GTATGAAGCTGCTATACCTTGAA一3 )和 PNIR1
(5 一CCGACTAGTGGTACCCGGTGAACGCTTT—
GGTCAGAA一3 )以扩 增 cDNA 的 ORF中 1248—
1651位核苷酸序列，以3 RACE扩增产物为模板进
行 PCR扩增，扩增条件为95℃变性2 min后，95℃
3O S，50℃ 3O S，72℃ 2 min，反应 3O个循环 ，最后
72℃延伸 10 min。先将 PCR扩增的内含子片段克
隆到植物表达载体 pBI121启动子下游 BamHI／
SacI位点，得到中间载体 pBI121一int，然后将用引物
PNIF1和 PNIR1扩增的产物反向克隆到中间载体
pBI121一int上内含子的下游 KpnI／SacI位点，再将
同样的片段正向克隆到中间载体 pBI121一int上内含
子的上游BamHI／SpeI位点。
1．2．4用于转化辣椒的根癌农杆菌菌株的构建 运
用三亲本接合法(Harding等，1987)将 RNA干涉辣
椒表达载体在质粒 pRK2073的帮助下导人根癌农
杆菌菌株 EHA1O5。
1．2．5 RNA干涉辣椒表达载体对辣椒的转化 挑
选颗粒饱满的桂研五号种子按常规表面灭菌后植于
MS培养基上，光照培养 14～18 d后剪取 Flamingo
Bil外植体(Javier等，2001)，于 GC培养基上预培
养 2 d。将经过预培养的外植体用已悬浮于 MS—AS
S S
c H c M G S F S
1
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11O 广 西 植 物 28卷
的根癌农杆菌菌液(OD。。一0．‘3～0．4)浸泡 10 min
后接回GC培养基上共培养 2～3 d，转接人 FH培
养基上进行分化筛选 2～3周。将分化出芽的外植
M 1 2 3
图 1 3 RACE and 5 RACE产物电泳分析
Fig．1 Electrophoretic analysis of the PCR products
0f 3 RACE and 5 RACE 0f CaNPR1
M：lOObpDNA分子量标准；1：3 端 PCR扩增产物 2：远
5 端 PCR扩增产物；3；近 5 端 PCR扩增产物。
M ；100bp DNA Marker；1：3 RACE product；2：Frist round 5
RACE product；3：Second round 5 RACE product．
体转入 SC培养基诱导芽的伸长及进一步的筛选，1
～ 2周后将伸长至 2～3 cm 的小芽从外植体上切
下，插入1／2 MS培养基中诱导生根，2～3周后即可
移栽至土壤中。
1．2．6 Southern杂 交 用 CTAB法 (Draper等，
1988)提取辣椒总 DNA。10 g总 DNA经 HindⅢ
完全酶切后凝胶电泳。杂交探针为 RNA干涉辣椒
表达载体上 404 bp的 BamHI／SpeI片段。杂交方
法按文献 (Sambrook等，2001)。用 Typhoon9410
(Amersham Biosciences公司)磷屏扫描仪扫描磷屏
获得杂交结果。
1．2．7 CaNPR1 GenBank索引号 DQ648785。
2 结果与讨论
2．1辣椒 CaNPR1基因全长 cDNA的克隆
3 RACE扩增出一条 677bp的特异 I9 DNA片段
(图1，1泳道)，第一次 5 RACE扩增出一条911 bp的
1) ． 。 40
c NPR1 AA (1)一MDSRTA~’_sDs艘墅王0 誊s誊垂ec工G—G一一MT 囊PE s壤蘸壹量 s KRLg嚣I己：js 弼SS
NtNPR1 A A 1
．? !翼F￡sN !sGsssIcc qGG— —EiFsPET PA缸T KR：所弛 孤F蠛SL ~NPR1 M f1)MD嘤I啦， 18$ iTmT。ss YL鼬E0vL P辩饕L L vF坫_口
(76)
0aNPR1AA )
~NPR1AA (73)
NPR1AA ∞ )
Consensus (76)
(151)
OaNPR1 AA(137)
~NPR1 AA(142)
~NPR1 AA(147)
Consensus(151)
(2261
G PR1 AA(21 21
NtNPR1 AA(21 7)
~NPR1 AA~．22)
O sen轧8(2261
(301)
CaNPR1A~(2871
~NPR1 AA 2)
~NPR1 AA(2931
Consensus@oi)
(376)
。aNPR1 A~(3621
MNP~IM 067)
~NPR1 AA(36a)
Consensus(376)
(451)
CaNPR1 AA(43
~NPR1 AA(442)
~NPR1 AA(443)
Consensus(451)
(526)
caNP刚 AAf511)
NtNPR1 AA(5~6)
AtNPR1 AA(5~8)
Consensus(526)
75
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．
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．
480
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ISSSCSSTSKGVDKPN KLPFRK
图 2 CaNPR1、NtNPR1和AtNPR1编码的氨基酸序列的比对
Fig．2 Alignments of encoded amino acid sequences of CaNPR1，NtNPR1 and AtNPR1
特异性片段(图 1，2泳道)。由于第一次 5 RACE没
得到包括 ORE的起始密码子ATG的5 端全序列，距
离ATG还差 508个核苷酸，因此我们又根据第一次
5 RACE所得序列设计引物(表 2)进行了第二次 5
如一 ∞
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1期 罗欢等：辣椒 CaNPR1一RNAi表达载体的构建及其对辣椒的转化 111
RACE，第二次 5 RACE扩增出～条 995bp的特异性
片段(图1，3泳道)。将经测序后的三段序列拼接(as—
semble)起 来，即得 到全 长 cDNA序 列 (共 219lbp，
GenBank索引号：DQ648785)。我们将该基 因命名为
CaNPR1基因。该基因与同是茄科的烟草 NPR1基
因(NtNPR1，GenBank索引号：AF480488)在 mRNA
水平上同源性为 90．4 ，编码产物具有 9O 的一致
性和93 的相似性，说明该基因在同科植物中具有
较高的保守性。与十字花科植物拟南芥 NPR1基因
(AtNPR1，GenBank索引号：NM一105102)在 mRNA
水平上同源性为 62．9 ，两 者的编码 产物具有
49．7 的一致性和65．7 的相似性(图2)。
根据所拼接序列设计引物 UPNPR1和 DPNPR1
(表 2)，RT-PCR扩增得到一条包括完整 ORF的长
1917bp的DNA片段(图 3，1泳道)。将该片段克隆
到载体 pGEM-3zf(+)上，获得含该基因全长 cDNA
完整 ORF的克隆(图3，2泳道)，测序表明该片段序
列与全长cDNA中所对应部分的序列完全一致。
图 3 含 CaNPR】完整 ORF的 cDNA克隆
Fig．3 CaNPR1 cDNA clone containing the complete ORF
M：1kb DNA分子量标准；1：RT—PCR扩增
产物；2；重组质粒 经 BarnHI十＆ RI消化 。
M ：1kb DNA M arker；1；RT—PCR amplification product；
2 1 Recombinant plasmid digested by BamHI+EcoRI．
2．2针对辣椒 CaNPR1基 因的 RNA干涉辣椒表达
载体 pCaNPR1一RNAi的构建
将马铃薯 GA20氧化酶基因的第一个内含子和
CaNPR1基因全长 cDNA的 ORF中 1248—1651位核
苷酸序列依次克隆到载体 pBI121上，获得针对辣椒
CaNPR1基因的RNA干涉辣椒表达载体 pCaNPR1一
RNAi(图4)。质粒 pCaNPR1一RNAi用 BamHI／Sad
双酶切后得到 1 045bp的外源 DNA片段(图 5，1泳
道)，用BamHI／SpeI双酶切后得到 417bp的正向插
入的 DNA片段(sense insert，图 5，2泳道)；用 KpnI／
SacI双酶切后得到 417bp的反向插入的 DNA片段
(antisense insert，图 5，3泳道)，证实构建的 RNA干
涉表达载体含有完整的反向重复序列结构。
ght
SaCI(6867)
图 4 C＆NPR1基因的 RNAi辣椒表达
载体 pCaNPR1-RNAi的结构
Fig．4 Structure of RNAi pepper expression
vector pCaNPR1一RNAi of CaNPR1
M 1 2 3
图 5 C＆NPR1基 因的 RNAi辣椒表达载体
pCaNPR1一RNAi的酶切验证
Fig．5 Restriction analysis of RNAi pepper expression
vector pCaNPR1一RNAi of CaNPR1
M；1 kb DNA分子量标准；1；pCaNPR1 RNAi经 BamHI+SacI
消化 ；2：pCaNPR1一RNAi经 BamHI+SpeI消化 ；3；pCaNPR1一
RNAi经 KpnI+SacI消化 。
M：1 kb D A Marker~1：pCaNPR1一RNAi／BamHI+SacI；2：
pCaNPR1一RNAi／BamHI+ SpeI；3 pCaNPR1一RNAi／KpnI+
S“fI．
2．3 RNA干涉辣椒表达载体 pCaNPR1一RNAi对辣
椒的转化
将培养了 14～18 d的辣椒无菌小苗制备成
Flamingo—bill外植体，在 GC培养基上预培养 2 d。
将预培 养 后 的外 植 体用 已悬 浮 于 MS—AS的
EHA105／pCaNPR1一RNAi根癌农杆菌菌液(OD
一0．3～O．4)浸泡 10 min后接回 GC培养基上共培
养(图6一A)。2～3 d后转接入 FH培养基上进行分
化筛选(图6一B)，7 d后开始观察到芽分化，将分化
出芽的外植体转入 SC培养基诱导芽的伸长及进一
p
b p
5 b
4 7
O 1
1 4
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ll2 广 西 植 物 28卷
步的筛选。将伸长至 243 em的小芽从外植体上切
下，插入 1／2MS培养基中诱导生根(图 6一C)，当幼
苗长至瓶 n时开瓶炼苗 3 d后 即可移栽至十壤rf1。
内源杂交带
整个转化过程大约需 要 60 d。总共进行了四次转
化，每次 8O个 Flamingo—bil外植体，共获得抗卡那
霉素再生苗 22株 ，最终移栽成活 6株(同 6 D)
图 6 pCaNPR1一RNAi对辣椒桂研五号的转化
Fig．6 The t ransformatio~()f pepper eultivar Guiyan 5 with pCaNPR1一RNAi
图 7 To代卡那霉素抗性植株的Southern杂交分析
Fig．7 Southern analysis of TO progeny of
Km transgenic lines of pepper
WI’；野生型桂研五号 ；1-6：TO代转基 植株 R1， !，R3，R4，R5和 K6。
2．4卡那霉素抗性植株的 Southern杂交验证
为证实 6株卡那霉素抗性植株是否为转基因植
株，对它们 的 TO代植株进行 Southern杂交分析。
结果表明，所有六个株系的植株除 了出现一条与野
生型共有的 内源杂交带外还 出现 了至少一条含有
CaNPR1基因部分序列的外源杂交带(图 7)，说明
获得的六个株系均为转基因株系。其中R1、R2和
R4为双拷贝插入，R3、R5和 R6为单拷贝插入。
本研究从辣椒中克隆到一个与拟南芥 NPR1
同源的 CaNPR1基因的全长 cDNA，构建了一个针
对CaNPR1基因的RNA干涉辣椒表达载体，并将
其通过根癌农杆菌介导法转化辣椒桂研五号，共获
得六个独立的转基因阳性株系，从而为进一步鉴定
NPR1基因的功能奠定了基础。
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李锋等：巴戟天种质离体保存研究 99
还能改变培养基环境的渗透压(潘瑞炽等，1995)。
本实验中，当蔗糖浓度达到 60 g／L时，存活率开始
下降，可能是因为高浓度的蔗糖改变培养基的渗透
强度过大，致使试管苗吸水困难，对保存效果不利。
离体保存成功的试验表明，在培养基中添加适
当的生长调节剂，能延长培养物的保存时间，提高试
管苗素质和促进试管苗转接后恢复 (潘瑞炽等，
2006)。在本实验中，不添加生长调节剂，单独使用
MS、1／2MS、1／4MS时，试管苗的保存效果一般，差
别不明显。在 MS培养基上附加四种生长调节剂
时，以 PP川浓度 0．2～1．0 mg／L对促进 巴戟天试
管苗的健壮生长效果最好，保存 360 d时存活率相
对最高，转接后能较快恢复生长，可以用于保存培
养。但是，在实际保存时发现，PP 附加在 1／2Ms、
l／4Ms培养基上较附加在 MS培养基上对保存更
加有利，试管苗保存时间更长，存活率更高。可见，
生长调节剂与不同浓度的无机营养配比时，对保存
能够产生不同的效果。另外，CCC、ABA和 MH对
巴戟天试管苗生长的抑制作用明显，但植株不够健
壮，存活率下降，相对而言，低浓度较高浓度的效果
好，因此，适当调整三种调节剂浓度或改变培养基无
机盐浓度，可能会取得好的效果，有待进一步实验。
在本实验观测过程中发现，试管苗死亡的主要
因素除了调节剂浓度过高，抑制强度过大，导致顶芽
退化而死亡外，根系上形成大量的愈伤，覆盖在培养
基表面，使植株无法吸收营养，由茎段基部最先开始
(上接第 112页 Continue from page 112)
枯萎，逐渐向上，最后导致整株枯萎死亡。因此，在
巴戟天试管苗的保存过程中，调控根和愈伤的生长，
可以取得更好的效果 。
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