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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
平榛 AGAMOUS基因的克隆与生物信息学分析
陈新 王贵禧 梁丽松 马庆华
(中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091)
摘 要: 以野生平榛(Corylus heterophylla Fischer)为试材，采用 RT-PCR 方法从花芽中获得了一个平榛 AGAMOUS 基
因 cDNA，命名为 ChAG，GenBank登录号为 JN828811。序列分析结果表明，ChAG 基因编码一个长度为 726 bp，编码 241 个
氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示，该基因属于 MADS 家族 AG 亚家族。序列比对和系统进化分析表明，ChAG
基因与欧榛的亲缘关系最近，相似性达 99%。采用生物信息学手段对 ChAG基因的保守结构域、疏水性和二级结构等进行
分析。
关键词: 平榛 基因克隆 生物信息学
Cloning and Bioinformatic Analysis of AGAMOUS Gene in
Hazelnut(Corylus heterophylla Fischer)
Chen Xin Wang Guixi Liang Lisong Ma Qinghua
(Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation，State Forestry Administration，Research Institute of Forestry，CAF，Beijing 100091)
Abstract: a full-length cDNA sequence of AGAMOUS gene was obtained from floral buds of Corylus heterophylla Fischer using
RT-PCR，named as ChAG gene (GenBank accession No． JN828811)． Sequence analysis indicated that ChAG genecontains an open-
ing reading frame (ORF)of 726 bp encoding a 241 predicted amino acids，belongs to AG subfamily of MADS family． Sequence align-
ment and phylogenetic analysis revealed that ChAG gene shared more than 99% homology with Corylus avellana． Conserved functional
domain，hydrophobicity /hydrophilicity，secondary structure，and homology tree of ChAG protein were analyzed by using bioinformatics
methods
Key words: Hazelnut Gene cloning Bioinformatics
收稿日期:2011-04-05
基金项目:国家“十一五”科技支撑计划(2006BAD01A1701) ，国家林业局“948”项目(2008204208)
作者简介:陈新，男，博士，研究方向:果树分子生物学;E-mail:sdaucx@ 163． com
通讯作者:王贵禧，男，研究员，博士生导师，研究方向:果品生物学;E-mail:wanggx0114@ 126． com
AGAMOUS(AG)基因首先从拟南芥中被分离
出来，属于花器官发育模型 C 类基因，控制雄蕊和
心皮的发育［1］。目前为止，研究人员已从欧榛
(Corylus avellana)、桦 木 (Betula pendula)、桃
(Prunus persica)、葡萄(Vitis vinifera)、柑橘(Citrus
unshiu)和领春木(Euptelea pleiosperma)等多种植物
中分离克隆了 AG同源基因全长 cDNA［2 － 7］。
平榛归于桦木科榛属植物，具有重要的经济
价值和营养价值，平榛的花为雌雄同株异花，即
单性花，先花后叶，雄花为柔荑花序，但近代学者
大多认为榛属植物是桦木与桤木之间的过渡类
群，可单独列为榛科，与桦木科、壳斗科共同组成
壳斗目;与花发育相关的 MADS-box 基因亚家族
通常被用于系统发育研究［8］。本研究挑选平榛
AG 基因来研究，对于人们理解榛属植物的进化，
揭示榛属植物的起源以及分化的分子机制具有
重要作用。
1 材料与方法
1. 1 材料
中冬时期平榛花芽于 2009 年 12 月 29 日河
北木兰围场国有林场用于构建平榛花芽转录组
文库。
RNA提取所用药品均购自北京拜尔迪生物公
司，M-MLV 反转录酶购自 Promega 公司，Taq DNA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
聚合酶、DNA 凝胶回收试剂盒、T4 DNA 连接酶、大
肠杆菌 TOP10 感受态细胞、质粒 DNA 提取试剂盒
和 DNaseⅠ酶等购自天根生化科技有限公司。克隆
载体 pMD19-T Vector购自 TaKaRa公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 RNA的提取与 cDNA 第一链的合成 采
用改良的 CTAB 法［9］提取平榛花芽总 RNA。DEPC
水溶解 RNA，用分光光度计测定 OD260和 OD280数
值，根据 OD260 /OD280值判断 RNA 的质量，用琼脂
糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性。cDNA 反转录按
照 Promega的 M-MLV Reverse Transcriptase 说明书
进行。
1. 2. 2 基因的获得 本试验室前期采用 Solexa
Sequencing技术对中冬时期平榛花芽的转录本进
行了高通量测序，组装得到了 4 万多条 unigene，通
过分析文库筛选得到一条类似 AG 基因的序列，
unigene编号为 42282，根据 GenBank 核酸数据库
中已经登录的其他物种的 AG 基因序列的保守区
域，设计全长引物 AGP1:5-ATGGAGTTCCAGAAC-
CAATCG-3 及 AGP2:5-TTAAACTAACTGAAGT-
GCCATC-3，以花芽 cDNA第一链为模板进行基因
的扩增。扩增程序为:95℃预变性 5 min;95℃变
性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，35 个循环;
72℃延伸 7 min。
1. 2. 3 生物信息学分析 在瑞士生物信息学研究
所网站(http:/ /us． expasy． org /)上运用 Compute pI /
Mw软件对目的基因编码蛋白等电点和分子量进行
预测，利用 NCBI对编码蛋白结构域进行预测，并运
用 ProtScale 软件对其疏水性预测分析。运用 PBIL
Lyon-Gerland信息库对蛋白质序列进行二级结构预
测，通过 Swiss-Model Workspace 对其三级结构进行
预测。
2 结果
2. 1 基因的克隆
本研究采用 AGP1 和 AGP2 一对引物扩增得到
约 750 bp的条带(图 1) ，比对发现和转录组文库中
编号为 unigene 42282 的 EST序列完全一致，验证了
Solexa测序平台的可靠性。
对平榛 AG 基因的 cDNA 序列进行分析表明，
该基因包含一个 726 bp 编码 241 个氨基酸的开放
阅读框。GenBank 登录号为 JN828811，命名为
ChAG。ChAG基因编码的蛋白质具有典型的 MADS
区和 K 区，而且具有 AG 特征序列(图 2) ，属于
MADS-box家族 AG亚家族［10，11］。
M． DL2000 Marker;1． ChAG基因
图 1 ChAG基因 RT-PCR及 RACE扩增电泳图
2. 2 基因的生物信息学分析
预测 ChAG 基因编码蛋白的分子量是 28. 06
kD，理论等电点为 9. 43。二级结构预测表明，ChAG
蛋白由 117 个 α 螺旋，30 个延伸链和 95 个随意卷
曲构成，它们分别占到总蛋白的 48. 35%、12. 40%
和 39. 26%(图 3-B)。其编码蛋白的疏水性分析表
明，疏水性最大值为 2. 122，最小值为 － 3. 089，大部
分区域为亲水区(图 3-C)。
2. 3 同源性比较与系统进化分析
平榛 ChAG 氨基酸序列提交 NCBI 在线比对
(http:/ /blast． ncbi． nlm． nih． gov /Blast． cgi) ，选择与
其同源性较高的 8 个物种的氨基酸，欧榛(Corylus
avellana AAD03486. 1 )、白桦 (Betula pendula
CAB95649. 1)、梅(Prunus mume ABU41518. 1)、樱
桃(Prunus serotina ACH72974. 1)、苹果(Malus dom-
estica CAC80858. 1)、桃(Prunus persica AAU29513. 1)、
葡萄(Vitis vinifera CAN83827. 1)和玫瑰(Rosa rug-
osa BAA90745. 1)。使用 DNAMAN 软件将这些序
列进行比对发现，不同植物的氨基酸序列同源性
较高，其中平榛与同属植物欧榛的同源性最高，
达到 99%;其次与桦木科白桦较近，达到 97%
(图 4)。
在多重比对的基础上，为更好地了解 ChAG基
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2011 年第 11 期 陈新等:平榛 AGAMOUS基因的克隆与生物信息学分析
下划线部分为 MADS区;阴影部分为 K区;方框部分为 AG特征序列
图 2 ChAG基因 cDNA全长及推导的氨基酸序列
因与其他植物 AG 之间的进化关系，用上述 9 个氨
基酸序列构建系统进化树，结果(图 5)表明，ChAG
基因的进化基本符合植物学分类系统，呈现出一定
的种属特性。例如，桦木科白桦和平榛、欧榛聚为一
类，然后和鼠李科葡萄聚为一类，蔷薇科的苹果和玫
瑰聚为一类;蔷薇科梅属的桃和梅，然后再和梅属的
樱桃聚在一起。
3 讨论
AG的进化具有明显的种属特性，也比较符合
APG分类系统，结果可为阐述榛属植物特殊的花器
官结构特征及进化过程提供参考资料。
Tomohiko等［12］研究发现巨桉(Eucalyptus gran-
dis)的 EgAGL1 和 EgAGL2 基因在花芽中表达量很
高。平榛 AG 基因是筛选于平榛的花芽转录组文
库，处于中冬时期的花芽一方面涉及花的发育过程
为授粉做准备;另一方面参与抵抗严冬的低温。有
研究发现，MADS 家族基因 SOC1 除了参与调控开
花外，还发现和冷信号的识别相关［13］;下一步将通
过研究基因的表达特性和转基因技术，进一步探讨
ChAG基因的功能。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
图 3 ChAG基因生物信息学分析
图 4 ChAG与其它植物氨基酸序列的同源性比较
图 5 ChAG与其他物种氨基酸序列的系统进化树分析
4 结论
本研究从平榛花芽中成功克隆得到平榛 AG 的
同源基因 ChAG，该基因编码的蛋白质具有典型的
MADS区、I区和 K区，而且具有 AG特征序列，属于
MADS-box家族 AG 亚家族。通过生物信息学分析
表明，与其他物种的同源性也较高，AG 基因编码区
保守性较强，不同科植物间氨基酸水平上的同源较
高，说明 AG基因在榛属植物进化过程中是比较保
守的。
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2011 年第 11 期 陈新等:平榛 AGAMOUS基因的克隆与生物信息学分析
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(责任编辑 马鑫)
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