全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-09-25
作者简介:姜焱(1972-),女,高级兽医师,博士,主要从事动物及动物产品的检验检疫
单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)技术是 20世纪 70年代生物医学领域的重要成果之一。McAb
具有成分均一、特异性强、生物活性高、可大量、快速、连续、无限生产等优点,可作为国际标准试剂用于疾
病的诊断和治疗。同时,McAb也是免疫学基础研究,提纯抗原和制造生物制剂的重要来源。现在养马爱好
者越来越多,建立和筛选针对马的重要疾病的抗 IgM单克隆抗体和抗 IgG单克隆抗体对马感染的一些疾
病的检测和监测具有重要的意义。
西尼罗热(WestNileFever)是由西尼罗热病毒引起的虫媒传染病,是一种事关安全、卫生、健康、环保
的人和动物共患的传染病。其中鸟类是常见宿主;其他偶见宿主有鸡、马、狗、猫、松鼠、蝙蝠、人。此病一旦
传入,会对我国人民生命安全、家畜家禽和野生哺乳动物及野生鸟类健康安全构成很大的威胁,影响生态
环境,人类对西尼罗病毒普遍易感,但至今尚无人用的有效疫苗。美国目前预防和控制西尼罗病毒的主要
措施是疫情监测和防蚊灭蚊。疫情监测包括采集标本进行血清学和病毒分子生物学诊断,分离西尼罗病
马IgM、IgG单克隆抗体的研制与鉴定
姜焱 陈国强 王凯民 唐泰山 张常印
(江苏出入境检验检疫局,南京 210001)
摘 要: 以马IgM、IgG作为免疫抗原,以此免疫 BALB/c小鼠,并取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,通过酶
联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选,结果获得了4株分泌抗马 IgM和2株分泌抗 IgG的单克隆抗体的杂交瘤细胞,特异
性试验证明,4株IgM单抗有很好的特异性,仅与马的IgM特异反应,而不与 IgG反应;这4株单抗分别命名为IgM4H、
IgM6B、IgM8A和IgM12F。经鉴定,IgM4H、IgM6B、IgM12F株为IgG1亚类,IgM8A株为IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染
色体数目为99条。杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA都具有较高的效价,该杂交瘤细胞连续培养20代
后仍能稳定分泌抗体。2株IgG的单克隆抗体有很好的特异性,只与IgG反应,而不与IgM发生交叉反应。
关键词: 马IgM IgG ELISA 单克隆抗体 杂交瘤细胞株
IdentificationandPreparationofMonoclonalAntibodiesAgainst
EquineIgGIgM
JiangYan ChenGuoqiang WangKaimin TangTaishan ZhangChangyin
(JiangsuEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Nanjing210001)
Abstract: BALB/cmicewasimmunizedwithequineIgM,IgG,thenthespleencelsofthehyperimmunizedmice
andSP2/0celswasfused.Theresultsobtained4strainsanti-IgM and2strainsanti-IgGhybridomacelswerescreened
byenzyme-linkedimmunosorbentasay(ELISA).Thespecifictestprovedthat4strainsmonoclonalantibodyofIgM had
goodspecificity,andonlyspecificresponsetoequineIgM,butwithoutIgGresponse;Thisfourmonoclonalantibodywas
namedIgM4H,IgM6B,IgM8AandIgM12F,respectively.Afteridentification,IgM4H,IgM6B,IgM12Fstrainweresubclasof
IgG1,IgM8AstrainwassubclasofIgG2a,theaveragenumberofchromosomesofhybridomacelwere99.Theculture
supernatantofHybridomacelandtheMcAbofmouseasciteshadahightiter,thehybridomacelswereculturedfor20
generations,theystilkeptproducinghightiterofmonoclonalantibodies.2strainsmonoclonalantibodiesofIgGhadgood
specificity,andonlyresponsetoIgG,andnotcros-reactwithIgM.
Keywords: EquineIgM IgG ELISA Monoclonalantibody Hybridomacelline
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
毒,监测鸟类。家畜和鸡等动物的西尼罗病毒感染情况,可以评估并预测当地西尼罗病毒流行情况。因为在
人类暴发西尼罗热之前会出现大批感染的鸟类或一些其他动物感染 WNV而死亡,所以建立检测 WNV的
方法为将来开展一些动物 WNV的监测具有重要的意义。
实验用杂交瘤技术制备了抗马 IgM/IgG单克隆抗体,这为用制备的单抗建立 ELISA方法检测马的
WNV抗体奠定了基础。应用抗马 IgM/IgG的单克隆抗体检测技术不仅能够检测出群体对疫苗的应答效果,
同时对早期感染的检测,特别是早期快速检测方法建立也有很强的针对性。
1 材料与方法
1.1 材料
马 IgM:购自美国 ROCKLAND公司、马 IgG:购自 SIGMA公司、HRP-羊抗鼠 IgG、弗氏不完全佐剂
(FICA)、弗氏完全佐剂(FCA)、HT混合盐、HAT混合盐、二甲基亚砜(DMSO)、HRP标记羊抗鼠 IgG、HRP标
记羊抗鼠 IgM (μ-chainspecific)、聚乙二醇 4000(PEG):均购自 Sigma公司。96孔细胞培养板、降植烷
(Pristance)或液体石蜡购自南京生兴有限公司;小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)由南京农业大学传染病组陈溥言
教授惠赠,由本室保存。BALB/c小鼠(10周龄,雄性):由南京大学模式动物研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 IgM、IgG单抗的制备
1.2.1.1 BALB/C小鼠的免疫 首免,50μgIgM与 100μl0.1MTris·Cl,0.5MNaCl(pH8.0)混匀,并加 150μl
弗氏完全佐剂充分乳化,腹腔注射;10d后,100μgIgM与 100μl弗氏不完全佐剂充分乳化,同途径注射;
10d后,100μgIgM,同途径注射加强免疫。IgG的免疫途径和免疫程序和 IgM的免疫途径相同。
1.2.1.2 免疫效果检测 在进行细胞融合之前,用马 IgM和 IgG作为包被抗原分别包被 PVC酶标板,对免
疫小鼠的眼部采血,通过 ELISA检测,对免疫后血样呈阳的小鼠用于细胞融合。
1.2.1.3 单抗的筛选和单克隆抗体的生产 按参考文献[7],进行单抗的融合和筛选工作。
1.2.2 McAb的某些生物学特性鉴定
1.2.2.1 McAb腹水效价测定 对所筛选的杂交瘤细胞和单抗腹水分别做 1∶200、1∶400、1∶800...1∶212×100
稀释。按前述间接 ELISA方法效价的测定以 P/N≥2.1判定为阳性。
1.2.2.2 单抗特性的鉴定 按参考文献[7],杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型等
特性的确定。
1.2.2.3 交叉反应性测定 将 McAb细胞上清按间接 ELISA筛选 McAb方法,测定其对马 IgM和 IgG的交
叉反应性,同时以 1∶100稀释的阴性鼠血清作对照。
2 结果
2.1 杂交瘤筛选
分别以马 IgM和 IgG作为包被抗原包被 ELISA板进行
杂交瘤细胞培养上清的筛选。结果表明,融合一次,共接种
480个培养孔,有 289孔生长杂交瘤细胞,融合率为 60%。
经检测,将检测为阳性的部分孔冻于液氮,部分孔进行亚克
隆和比较,筛选出 4株分泌抗马 IgMMcAb的杂交瘤细胞
株,分别命名为 IgM4H、IgM6B、IgM8A和 IgM12F。2株分泌抗马 IgGMcAb的杂交瘤细胞株,分别命名为
IgG-2A、和 IgG-8D。6株杂交瘤细胞上清的 OD值结果见表 1。
2.2 McAb的效价测定
采用间接 ELISA方法测定杂交瘤细胞上清和腹水的 ELISA的 OD值并计算其效价。结果见表 2、表 3、
表 4和表 5。
表 1 6株杂交瘤细胞上清鉴定
200
2008年第2期
(下转第213页)
2.3 单抗亚类鉴定(表 6)
2.4 ELISA检测 McAb的特异性
4株 IgMMcAb均只与马 IgM呈阳性反应,而不与马 IgG发生作用(表 7和表 8)。由此进一步表明这 4
株 McAb对抗马 IgM具有特异性,2株 IgG的单克隆抗体也不与 IgM反应。
表 2 IgM杂交瘤细胞的上清和腹水与 IgM反应的 OD值
表 3 IgM的杂交瘤细胞株的上清和腹水与 IgM反应的效价
表 4 IgG杂交瘤细胞的上清和腹水与 IgG反应的 OD值
表 5 IgG的杂交瘤细胞株的上清和腹水
与 IgG反应的效价 表 6 亚类鉴定结果
表 7 IgM杂交瘤细胞株交叉反应性测定结果 表 8 IgG杂交瘤细胞株交叉反应性测定结果
注:第一列A、B为阳性对照;第二列C、D为阴性对照
注:第一列A、B为阳性对照;第二列C、D为阴性对照
姜焱等:马IgM、IgG单克隆抗体的研制与鉴定 201
2008年第2期
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第201页)
3 讨论
抗体的制备是完成检测抗马 IgM的关键技术,由于 IgM主要是以多聚体形式存在于血液中,单体存在
的可能性较小量也少,因此研制针对抗疾病的 IgM的单克隆抗体难度较大,特异性不强是课题研制过程中
一大障碍,为突破这一研究屏障,对马 IgM的复合多聚体特性进行反复研究,经过多次努力和试验摸索确
定将研制出的马 IgM抗体经过多次的反复冻融并透析,以提高免疫抗原的马 IgM单克隆体抗的比例,以便
易于小鼠免疫系统对单体可溶性抗原的识别,使生产出的抗体特异性更强,反应灵敏度更高,尽可能地避
免马 IgM单克隆抗体与马 IgG反应,使反应特异性增强。
包被抗原在同一板上的不同孔之间的吸收值有可能出现较大变化,而在不同板上的吸收差异更大。可
以通过多次重复,取吸收值的均值来控制这些变化。DeborahE.Dixon-Holand(1988)等报道,平均同块板的
任两个孔的吸收值的变化是能够趋于稳定的;重复次数的增加能提高相关性,但不明显;吸收值的测定差
异与 ELISA板以及分析法的准确性和精确度有关。对于抗体的测定,由于不同生产厂家生产的板子引起的
吸收值变化的相关系数可在 5.1%~10.1%之间。
此外,人为地主观影响在实验中是存在的,特别是酶标抗体添加影响很大,由于 ELISA检测试剂盒是
采用抗体反应与酶催化反应相结合的一种技术,一分子酶能催化成千上万分子底物,因而极少量的酶对反
应结果有较大的影响。
对 IgM杂交瘤细胞株进行了大量的筛选工作,并经过多次亚克隆后获得的;而大多数阳性的 IgG的杂
交瘤细胞株目前冻于液氮,只进行了部分的阳性克隆株的筛选工作,也许目前获得的克隆株并不是最好的
杂交瘤细胞株,需要对抗马 IgG的杂交瘤细胞株进行筛选。
参考 文献
1 蔡宝祥.家畜传染病学(第 4版)[M].北京:农业出版社,2001,5.
2 陆承平主编.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社,2001,9,572.
3 李佑民主编.家畜传染病学[M].北京:蓝天出版社,1993,9:236～243.
4 殷震,刘景华主编.动物病毒学[M].北京:科学出版社,1997,7:631~664.
5【美】B.E斯特劳,【加】s.D阿莱尔,【美】w.L蒙加林,【英】D.J泰勒.猪病学[M].北京:中国农业出版社,2000,150.
6 农业部畜牧兽医局【译】.国际兽疫局编著.诊断试验和疫苗标准手册,2000,l28～l35.
7 刘秀梵.单克隆抗体在农业上的应用[M].合肥:安徽科学技术出版社,1994.
14 XieQ,AlpersDH.PhysiolGenomics,2000,3(1):1～8.
15 NarisawaS,HofmanMC,ZiomekCH,etal.Development,1992,116:159～165.
16 BalcerzakM,HamadeE,ZhangL,etal.ActaBiochimPol,2003,50(4):1019~1038.
17 MilanJL.NucleicAcidsRes,1987,15(24):10599.
18 TeraoM,StuderM,GianniM,etal.BiochemJ,1990,268:641～648.
19 WeissigH,SchildgeA,HoylaertsMF,etal.BiochemJ,1993,290:503～508.
20 SerflingE,JasinM,SchafnerW.TrendsGenet,1985,1:224～230.
21 MangelsdorfDJ,ThummelC,BeatoM,etal.Cel,1995,83:835～839.
22 ZhangJ,LazarMA.AnnuRevPhysiol,2000,62:439～466.
23 罗敏.第二军医大学学报,2001,22(11):1059～1061.
24 GiguereV.EndocrRev,1994,15:61～79.
25 BilezikianJP,RaiszLG,RodanGA.Principlesofbonebiology,2nded,SanDiego:AcademicPress,2002,1:545～571.
26 WestonAD,HofmanLM,UnderhilTM.BirthDefectsRes(PartC),2003,69:156～173.
27 OrimoH,ShimadaT.Bone,2005,36:866～876.
28 OkadaN,TakagiY,SeikaiT.CelTissueRes,2001,304:59～66.
29 BanovacK,KorenE.CalcifTissueInt,2000,67(6):460～465.
施志仪等:牙鲆碱性磷酸酶基因5调控区的克隆及其功能检测 213