全 文 ：第 14卷
9 1 8
第 4期
年 1 2月
植 物 病 理 学 报
AT C I A P J YT O P AT 于 0 1工, O G不C A STN IC A
V o !
.
14 5
D e e
。
应用间接酶联免疫吸附技术对芜
蔷花叶病毒血清学关系的研究 ’
李 彦 勇
( 安徽农学院
( 2 9 5 3年1 2月 〕2日收稿 )
提 要
本试验收集了来自不 同国家和地 区的 10 个芜 昔 花 叶 病 毒 株 系 或分离物
( T
u M V )
。 应用直接 E L I S A 和 间接 E L I S A 对其客株系间血清学关系进 行 了
比较试验 。 直接E L I S A 双杭体夹心法专化性较强 。 由病毒抗血 清所 制 备的结
合体只与同宗抗原起反应 , 不与T u M V其它株系异宗 抗原起反应 。 应用病毒抗
血清所制备的 F ( a b ` ) : 包被处理的间接 E L I S A 技术 , 鉴定病毒不 同株系血清
学亲缘关系时 , 只 要用 1 个病毒株系杭血清即可对不 同株系进行鉴定 。 由 6 个
T
u M V 株系分别制备的抗血清对 0] 个毒株进行鉴定表明 , 各株 系 均 能交互反
应 , 说明株系间具有共同的杭原性 , 仅 O M 株系与其它株系较少一致性 , 表明
血 清学关系较疏远 。 因此认为 , 间接 E L巧八适用于广泛 的 病 毒诊断及株系鉴
定之用 . 比直接 E L I S A优越。
芜著花叶病毒 ( T u r n i P m o s a i e v i r u s简称 T u M V ) 广泛分布于世界各地 , 常对十
字花科作物造成严重危害。 据国内外文献报 道 , T u M V株系较多〔 1 ~ 8 〕 。而这些株系的
划分 , 多是依据经典的生物学鉴定方法而确定的 。 由于鉴定标准不统一 , 对有关株系的
记载意见 , 很不一致 。 尤其对于 T o M V 各株系间血清学关系较少进行研究 。 近年来随着
血清学技术的发展 , 利用酶联免疫吸附技术 , 对植物病毒种类和株系鉴定陆续的报道了
一些成功事例〔 1 3一 ` 4 、 15 一 2“ 〕。 本试验收集了来 自不 同国家和地区的 10 个 T u M V 毒株或分
离物应用间接酶联免疫吸附技术进行了鉴定 。 力图进一步探讨 T u M V 各株系之间血清学
的关系 。
材 料 和 方 法
一 、 毒株来源
供试验用的 T u M V 株系 , 除安徽 1 号和 2 号 ( 简称 C A I和 C A : ) 系从合肥油菜上分
离的 2 毒株外〔 ” 〕 , 其余 8 个毒株或分离物均由西德联邦生物研究院植物病毒研究所 J .
. 该项研究工作是 作者在 西德 联邦生物研究院植物病毒研究所完成的 。 H . L .鲍尔教授给予大力支持和 帮助 ;
J
。
H
.菲 腾博 士提供 部分芜普花叶病毒毒株 , 并在工作上给予部分协助 , H . L . 魏德满博士 提供 PV Y毒株及执
血清 , D 。 E . 列兹满博士代拍摄 电镜照片 , 谨此一并致谢 。
DOI : 10. 13926 /j . cnki . apps . 1984. 04. 007
杭 物 病 理 学 报 14卷
|
甲 |”刊 J川 |刊 J
H
· 菲腾博士所提供 , 其代号如下 : 甘蓝黑环病毒 ( C a b b a g e B l a Ck R i n g s p 。 t V i r u s
简称C a B R V ) , 英国株系 ( E : i g l a n d I s o l a t e , T E ) , 意大 利株系 ( I t a l i e I s o l a t e ,
T l )
, 沙列布分离物 ( O r e h i s m i l i t e r i s I s o l a t c , O M ) , 西德毒株 5 号和 8 号 ( T D 。 ,
T D
:
) 系从萝 卜上分离的两毒株及台湾毒株 4 号和 5 号 ( C T 4 , C T 。 ) 。 马铃薯 Y病毒
( P o t a t o V i r u s Y简称 P V Y ) 作为比较毒株。
为保持试验的一致性 , 所有毒株均分别接种在鉴别 寄 主 昆诺 阿黎 ( Chen o P o id “ 。
q u i n o 。 ) 上 , 经 3 次单斑分离纯化后 , 再扩大繁殖接种在N `e o t`a o a e l e v e l a o d“ ( 简称 N .
C ) 烟上 , 待显症后 , 采收供病毒提纯用 。 P V Y在三生烟上扩大繁殖备用 。 试验用甘蓝
黑环病毒 ( C a B R V ) 作为已知的代表株 , 并与其它毒株或分离物进行比较。
二 、 提纯方法
T u M V提纯方法较多〔 “ 、 7 · 10 、 1 ,〕 , 由于这类病毒在提纯过 程中易发生集聚现象 ,
因此获毒率不高 。 为避免此缺点的发生 , 本试验在综合前人研究的基础上 , 在提纯方法
上做了一些改进 , 其步骤如下 。
病叶加 2 倍体积的 o . SM磷酸钾 ( pH 7 . 5 , 内含 o . o Z M N a : 5 0 3 , 0 . 0 ; M D I E e A 及
o
.
0 5M E D T A ) 缓冲液 , 捣碎 , 再加入 同体积的 1 , 1 , 2一三氟 三 氯 甲 烷 ( F r e o n ) 匀
浆 , 置 C h r i s t Z e t a 2 0离心机 s , 0 0 0转 /分离心 2 0分钟 , 取上清液 , 再经 S p u t n ik离心机
27
,
0 0转 /分离心 3 小时 , 取沉淀悬浮于 0 . 05 M柠檬酸钠缓冲 液 ( p H 7 . 5 , 下同 ) 内 ,
再按每毫升悬液加入 0 . 3 5 克氯化艳 , 置 B e e k m a n m o d e l L S . s o离心机 , 1 0℃ 3 5 , 0 0 0
转 /分 ( 一「同 ) 离心 1 8小时 , 形成明显的病毒沉淀带 , 经 2 次氯化艳密度梯级 离心 , 得
纯化的病毒制剂 , 病毒获毒率 15 ~ 20 毫克 /公升鲜重病叶。
三 、 电镜观察
将提纯的病毒适当稀释后 , 滴一滴铺有F or m v ar 薄膜的铜网上 , 5 分 钟 后加蒸馏
水冲洗 , 再加 2 %醋酸铀 5 ~ 7 滴负染 , 吸干置电镜下观察 。
四 、 抗血清的制备
将提纯的病毒制剂 , 每次各取 5 ~ 8 毫克 , 加 F r e u n d全辅剂 , 乳化 , 作肌肉注射 ,
共注射 3 次后 , 抽血 , 用玻片凝聚法测血清效价为 1 : 2 56 ~ 1 0 24 。
五 、 病毒抗血清球蛋白gI G的提纯
每毫升抗血清加 10 毫升蒸馏水稀释 , 再加 10 毫升 饱 和硫酸按 〔` 7 、 19 、 20 〕搅拌 30 ~ 60
分钟 , 静置 l 小时后 , 经 8 , 0 0转 /分离心 10 分钟 , 取沉淀悬浮于 o . SM P B S缓 冲液透析 ,
换水 3 次 , 然后将含有抗休球蛋白 I g G 的悬液经 D E A E纤维素层析柱进一步提纯 , 分管
收集纯化的 I g G悬液 , 用 C A R L , Z e i s s紫外光分光光度计置 E Z。。 波长测得结果 , O D =
1
.
6 4即每毫升约含 1 . 17 毫克 I g G , 装管置冰箱保存 。
六 、 碱性磷酸醉标记病毒抗休球蛋白 l g G的制备
按 M · F : lC ar k等记述的方法 〔.l2 ’ 8〕取 1 7 · 5微升碱性磷酸酶 ( 10 毫克 /毫升 ) 溶于
0
.
25 毫升 Ig G 的悬液中 , 再加入 2 . 6 75 微升 25 %戊二 醛溶液 , 充分混合 , 置室温下 4 小
时 , 用 P B S缓冲液透析 3 次以除尽残余戊二醛 , 酶标液加 1 %牛血清白蛋白于 4 ℃冷贮
备用 。
七、 间接醉标抗体的制备和洲定方法
4期 李彦勇 :应用间接酶联免疫吸 附技术对芜著花叶病毒血清学关系的研究 2幻
1
.
F(a b l) :断片的制备 :将每毫升含 1一 5毫克 IgG溶解于 o .0 7M醋酸钠缓冲液
( pH 4
.
0
, 内含 o . o 5M N a C I ) 内 , 加胃酶 ( S i g l n a l : 1 0 , 0 0 0 ) 消解 ( 胃酶溶 解于燕
馏水中 ) , 按 45 微克 /毫克坛G置 37 ℃孵育过夜 , 用 P B S缓冲液 (P H 7 . 4 , o . 02 M磷酸缓冲液 ,
内含 0 . 15 N a C I ) 透析 3 次 , 以除掉低分子量的酶解产物 。
2
. 酶标结合体 : A 蛋白 ( F or t e in A ) 同时与辣根过氧化酶 ( H R F ) 和牛血清白
蛋白 ( B S A ) 相联结〔 1 7 、 18 〕 , 以形成酶标结合体 ( 其比例 : 0 . 5毫克 了、蛋 白 , 1 毫克 B S A ,
o
。
75 毫克 H R P ) , 置 4 ℃冷贮备用 。
3
. 直接和 间接酶联兔疫吸附浏定方法 : 直接酶联免疫吸附测定 , 系用双抗体夹心
法 。 间接酶联免疫吸附测定 , 按下述步骤进行 。
( 1 )聚苯乙烯测定板 (规格 : D y n a t e e h M i e r o t i t e r , 9 6孔 ) 用 F ( a b ’ ) 2 包 被 〔 F
( ab
`
)
: 悬浮于 p H g . 6碳酸钠缓冲液内〕 , 包被 浓 度 为 1 : 5 0 0。倍 , 30 ℃保温 3 一 4小
时。
( 2 )将 F B S稀释待测抗原标样 ( 每升 P B S内含 0 . 5毫升 T w e o n 20 ) , 加在 F ( a b ` ) :
包被的测定孔内 , 于 4 ℃过夜。 ` 「
( 3 )加专化性的病毒抗血清 Ig G或抗血清与被诱捕的抗原起 反应 , 置 30 ℃反应 3 小
时。
( 4 )加辣根过氧化酶标记的 A 蛋白结合体 , 于30 ℃反应 3 小时 。
( 5 )加底物 , 〔p H S . 8 , I M醋酸钠溶液 2 毫升 , 3 , 3 ` , 5 , 5` 一四甲墓联苯胺 ( T M B )
0
.
2毫升 , 蒸馏水 20 毫升 , H : O : 0 . 02 毫升〕置室温内 , 放置 20 一 30 分钟后 , 再于 娜一测
定板的孔穴内加入 50 微升 3 M硫酸 , 以终止反应 。 用 自动酶标测定仪 ( M R 5 80 , M i o r o
E L I S A A u t o R e a d e r ) 置 4 5 0毫微米进行扫描测定 。
试 验 结 果
一 、 提纯病毒的鉴定
1
. 紫外吸收光谱 : 用上述方法提纯的病毒制剂 , 经自动分光光度计扫描 , 呈现典
型的病毒核蛋白吸收曲线 ( 见图 1 ) 。 其最高吸收波长 2 61 毫微米 , 最低吸收波长为 2 46
毫微米 , A 2 6 1 / 2 4 6为 1 . 1 6 ; 2 8 0 / 2 6 0为 1 . 2 6 , 其比值与以往文献报道相近〔 7 〕 。
2
. 病毒拉体 电镜观察 : 提纯的病毒制剂 , 适当稀释后 , 用 2 %磷钨酸负染 , 在电
镜下可观察到大量 的呈弯曲的线状病毒粒体 ( 见图 2 ) , 各株系病毒粒体形态相似 , 长
6 8 0~ 7 6 0毫微米 , 直径 1 2 . 5~ 1 5毫微米 。
二 、 血清学鉴定
各株系血清学亲缘关系的研究 , 用直接 E L IS A 和间接 E L IS A进行了比 较试验 , 其
结果如下 :
1
。 直接 E L I S A 浏定 : 用双抗体夹心法 〔` 2 、 1 8〕分别对 6 个 T u M V株系 进 行了 测定
( 见表 1 ) 。
试验结果表明 , 经测定的 6 个 T u M V毒株 , 每一毒株所制备的抗体球蛋白结合体只
与同宗的抗原起反应 , 一般不与异宗抗原起反应 。 少数株系 ( 如 C a B R V 和 C A ,两毒株 )
当异宗抗原浓度大时 , 有时有微弱的异宗反应 , 抗原经稀释后 , 则异宗反应消失 。 由此
…1…阅月J` r2 2 2 植 物 病 理 学 报 14 卷
表 l 直接 LEI SA 对 6 个 Tu M V 株系鉴定结果
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0 0 2
注 : ①包被 : 病毒抗血 清球蛋白稀释度 、 aC B RV 、 C T : , CA , 均为 1 : 30 0 倍
T E
、
T l 为 1 : 20 0 0倍
O M 为 1 : 2 0 0 0倍
②未经纯化的抗原稀释度: 1 : 1 0 和 1 : 10 0 0。
③碱性磷酸酶标记的病毒抗血清址G的结合体稀释 1 , 2 0 0。倍 。
④底物 : 对位磷酸硝基苯 , 浓度为 1 毫克 /毫升 , 每孔加 20 微升。
⑤置 4 0 5毫微米测定 。
说明 , 直接酶联免疫吸附法专化性较强 。
2
. 间接 E L IS A 浏定 : 用 G a B R V抗血清所制备的 F ( ab , ) : 断片进行 包 被 , 分 别
对 6 种不同株系的抗原 , 用间接 E L IS A进行测定 , 其结果如图 3 所示 。 只用一 个 病 毒
株系抗血清及其所制备的 F ( ab ` ) 2进行包被 , 即可对其它未经纯化的株 系抗原进行鉴
定 。 因此 , 它适用于病毒株系间 J` ’ 谱性的诊断鉴 定 。 V a n R e g e n m or et l等〔14 〕在应用间
接 E L IS A 鉴定 T u M V株系时指出 , 其血清型差异指数从 1 . 2~ 7 . 0范围内均 可 测 出 , 本
试验为进一步探讨 T u M V 10 个株系的血清学亲缘关系 , 共选用 6 种 T u M V株!系抗血清进
行置换 , 分别对 10 个株系抗原进行测定 , 其结果如表 2所示 。
表 Z F a( bl ) ,间接 E L 巧 、、 对 T u M V 10 个毒株血清学关 来的浏定
门司峭
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抗 原 第 二 抗 血 清 杭 原 第 二 杭 血 清
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注 : ①包被 : 用病毒杭血清所制备的 F a( b l ) : 断片稀释 i : 5 00。俄。
②第二杭 血清扰体 球蛋白 : C a B RV 、 T E 、 C T S、 C A , 和 O M均稀释 i : 5 0 0。 -
T l及 P V Y I : 25 0 0 , N . C健血清 1 : 2 0 0 0。
③病毒抗原稀释 : 1 : 5 0。 , 健株汁液稀释 1 : 50 。
④辣根过氧化酶标记 的 A蛋 白结合体 1 , 10 00 0 .
@ 加底物 , 置 4 50 毫微米测定 , > 0 . 1为正反应 。
J 气
4期 李彦勇 : 应用间接醉联免痊吸附技术对芜替花叶病毒血清学关系的研究
豁
试验结果表明 , T u M V各株系所制备的抗血清 , 用间接 E LI S A均能交 互 反 应 , 说
明株系间具有共同的抗原性 。 根据反应强弱 , 测定值的大小 , 可 区分病毒株系间亲缘关
系的远近 。 O M株系除与 T E反应外 , 与其它株系亲缘关系很少一致性 , 表明亲 缘 关 系
疏远 。 P V Y与 T u M V各株系抗血清均无专化性反应 。
讨 论
T u M V株系鉴定问题 , 不同作者的报道不尽相同 , 因此 , 存在一定分歧。 关于探讨
植物病毒种类和株系鉴定间题 , 人们愈来愈多的把注意力集中在应用酶联免疫吸附技术
上 。 本试验应用直接酶联免疫吸附法测定结果表明 , 经酶标记的结合体对病毒株系具有
高度的选择性 ( 如表 1 所示 ) 。 各株系抗血清的 I g G , 分别用碱性磷酸酶标记制备的结
合体 , 只与同宗抗原起反应 , 一般不与异宗抗原起反应 。 直接E L IS A专化强 , 灵 敏度
高 , 一方面可用于植物病毒种类和株系鉴定 , 并把不 同株系区分开来 , 但另一方面由于
专化性很窄 , 在检测中对同一病毒不同株系常被忽略掉 . , 因此 , 在应用上也有一定的局
限性 。 为 了克服直接 E LI S A专化性窄的缺点 , 有些作者曾进行过试验 , 例如增加 处 理
时间及包被的病毒抗体球蛋白进行置换等妥均未得 到改 善 〔.15 ,` 〕。 R o c h` w等 〔` ” ”应用
此法检测大麦黄矮病时, , 针对大麦上分离的 5 个主要黄矮病毒株系 , 分别制备了抗血清
的结合体 , 供田间测定用 , 但手续较为麻烦 。
利用间接 E L sI A技术对烟草花叶病毒不同株系 ( t M V ) 和香石竹潜病毒组群 ( C -
“ r al v i r ” “ “ ” ) 内病毒等〔 ,通、 2的鉴定 , 均证明是有效的。 作者在测定 10 个 T u M V毒 株时 ,
用病毒抗血清所制备的F, ( ab , ) 2断片包被 , 以诱捕同宗和异宗抗原 , 加 诊 断抗 血 清
I g G后可与箱应的抚原起反应 , 再加辣根过氧化酶标记的 A蛋白 ( rP o et i只亡 A ) 结合体 ,
使之与诊断抗体 I g G F C部位相联结 。 根据结合反应的强弱进一步判断亲缘关系 的远近
( 见图 3 , 表 2 ) 。 鉴定时 , 只要有一个病毒株系所制备的抗血清 , 就可对其它株系进
行鉴定。 其待测抗原标样不需要纯化 , 只要有少量抗血清即可快速的鉴定出它们之间的
亲缘关系 。 此结果与其他工作者在签定别种病毒时的结论是一致的〔` “ 、 ` 7 、 ’ 。一 20 〕。 由此
表明 , 间接 E L IS A和直接 E L IS A相 比解决了专化性窄的矛盾 , 为植物病毒种类 和株系
鉴定提供了一个快速 、 可靠 、 广谱性的检测手段 , 既可作定性 , 又可作定量测定 。
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映解。
图 I T u M v 一 C A :株系紫外吸收 图谱 图
2 T u M V
一
C A I株 系 , 经 2 次氧化艳密度梯级离心提纯
( 电镜照片 : 放 大 6 8 , 0 0 0倍 )
2 2 4 植 物 病 理 学 报 1 4卷
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图 3 用 F ( a bl ) : T u M V株 系的间接 E L IS A 对 6 个 T u M V株系杭原浏定
参 考 文 献
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〔 2 2〕 C la r k , M . F , a n d A . N . A d a m s 1 9 77 , J . g e n . V i r o l . 3` , 4 75 ~ 4 5 3 .
〔 1 3 〕 R o e il o w , W . F . a u d L . E . C a r m i e h a e l 1 9 7。 : V i r o l o g y , 95 , 4 15 ~ 4 2 0 .〔 14 〕 Va n R e g e n m o t e l M . H . V . a n d J . B u r e h a r d 1 05 0 : V i r o l o g y , 1 0 6 , 3 2 7~ 3 3 4。〔2 5 〕 K o e n i g , R . z , 7 8 : J . g e n , V i r o l . 4 0 , 3 0。一 3 2 5 .
〔2 6 〕 K o e n ig , R . 1 9 5一: J . g e n , V i r o l . 5 5 , 5 5~ 6 2。
〔 17 〕 K o e n i g一 R . a n d H . L . P a u l 2 0 8 2 : J o u r an l o f V i r o l o g i e a l M e th o d s s 6 5 1 1 3~ 1 25 。
〔 1 5〕 C a s p e r 一 R . a n d 5 . M e y e r 2 0 5 2 : M a e h r i e h t e n 6 1 . D e u t . P f la n z e n s e h u t z d . , 3 3 ( 2 ) 一 49 ~ 5改。
〔 1 9〕 aB r b a r a 一 D . J . a n d M . F . C l a r k 1 0 5 2 : J . g e n . V i r o l . 5 5 5 3 15~ 5 2 2 .
〔2 0〕 A d a m 、 一 A . N . a n d D . J . B a r b a r a 2 9 5 2 : nA n . a p p l . B io l . 1 0 1 5 4 9 5一 5 00 。
IN D! R EC T E L! SA T O D E T EC T S ER O L O G IC A L R E L A T !O N SH I P S
A M O N G T U RN ! P MO SA! C V IR U SE S
L i Y a n y o n g
( A ” h u i A g r i e u l t u r a l oC l leg
e )
A B S T R A C T
D i r e e t E L I S A
a n d i n d i r e e t E L I S A w e r e e o m P a r e d w i t h r e s P e e t t o
t h e i r a b i l i t y t o d e t e e t a n d t o d i f f e r e n t i a t e s e r o l o g i e a l l y r e l a t e d d i f f e r e n t
s t r a i n s o f T u M V f
r o m v a r i o u s p a r t s
。
T h e s p e e i f i e i t y o f t h e d o u b l e
一 a n t ib o d y s a n d w i e h m e t h o d o f d i r e e t
E L I S A w a s 5 0 s t r o n g t h a t e n z y m e C o n j u g a t e s P r e p a r e d w i t h a n t i b o d i e s t o
o n e s t r a i n d i d n o t r e a e t w i t h e l o s e l y r e l a t e d s t r a i n s
.
A n i n d i r e e t
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b a s e d E L I S A w a s u s e d t o a s s e s s r e a e t i o n o f
1 0 s t r a i n s o r i s o l a t e s o f T u M V
a n d P V Y w i t h a n t i s e r a t o 6 T u M V
s t r a -
i n s
.
T h e r e w e r e n o s p e e i f i e r e a e t i o n s w i t h a n t i s e r a t o P V Y a n d d i f f e r e n t
s t r a i n s o f T u M V h
a v e b e e n s h o w n t o b e s e r o l o g i e a l l y r e l a t e d t o e a e h
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u t w e r e s e r o l o g i e a l ly
r a t h e r d i s t a n t ly r e l a t e d t o O M
s t r a i n
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I n d i r e e t E L I S A t e e h n i q u e d e t e e t s a b r o a d e r r a n g e o f s e r o l o g i e a l l y
r e l a t e d v i r u s e s a n d 15 m o r e s c n s i t i v e t l l a
: 1 t h e ( l i r e e t E L I S A n l c t ll o d s
。