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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1 核苷酸序列分析
孙桂金1，2 潘杰2 刘可春1 王雪1 彭维兵1 何秋霞1 王思锋1
(1山东省科学院生物研究所，济南 250014;2山东师范大学生命科学学院，济南 250014)
摘 要: 对毛蚶、泥蚶和魁蚶 3 种贝类的 ITS1 序列进行 PCR扩增、测序及分析，并用 Mega3. 1 软件对其进行系统进化
分析。毛蚶、泥蚶和魁蚶的 ITS1 序列长度分别为 424、456 和 431 bp，3 种蚶的 479 个序列位点中，共有 330 个保守位点，98 个
变异位点，94 个单突变位点。系统进化分析表明，毛蚶和泥蚶先聚为一支，而后与魁蚶聚为一支。ITS1 分析结果显示毛蚶和
泥蚶种间的遗传关系较近。
关键词: 泥蚶 毛蚶 魁蚶 ITS1 序列分析
Sequence Analysis on ITS1 in Scapharca subcrenata，Tegillarca
granosa and Scapharca broughtonii
Sun Guijin1，2 Pan Jie2 Liu Kechun1 Wang Xue1 Peng Weibing1 He Qiuxia1 Wang Sifeng1
(1Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014;2College of Life Sciences，Shandong Normal University，Jinan 250014)
Abstract: Scapharca subcrenata，Tegillarca granosa and Scapharca broughtonii ITS1 sequences were amplified，sequenced and an-
alysed. With the software of Mega3. 1，we analysed the phylogenetic development． The results showed that the size of Scapharca subcre-
nata，Tegillarca granosa and Scapharca broughtonii ITS1 sequences were 424，456 and 431 bp，respectively． There are 479 sequence loci
which contain 330 conserved loci，98 variable loci and 94 singleton loci in this three species． The result of phylogenetic development
showed that Scapharca subcrenatas and Tegillarca granosa were classified in one branch of phylogenetic tree，then were classified with
Scapharca broughtonii in another branch． The analytical result of ITS1 sequences indicate that the genetic relation between Scapharca
subcrenata and Tegillarca granosa were close．
Key words: Scapharca subcrenata Tegillarca granosa Scapharca broughtonii ITS1 Sequence analysis
收稿日期:2010-12-27
作者简介:孙桂金，女，博士，研究方向:分子细胞生物学;E-mail:rosesgjin@ 163. com
通讯作者:刘可春，男，博士，研究员，研究方向:天然药物活性筛选;E-mail:hliukch@ keylab. net
毛蚶(Scapharca subcrenata)、泥蚶(Tegillarca
granosa)和魁蚶(Scapharca broughtonii)隶属于软
体动物门、双壳纲、蚶目及蚶科，但从分类学上来
看，毛蚶和魁蚶属于同一个属，而泥蚶是另一个
属。核糖体 DNA(rDNA)是由 18S、5． 8S 和 28S
rDNA，位于 18S rDNA 和 5． 8S rDNA 间的转录间
隔区 ITS1(internal transcribed spacer)及位于 5． 8S
rDNA和 28S rDNA 间的转录间隔区 ITS2(internal
transcribed spacer)等串联重复单元组成［1］。18S、
5． 8S和 28S rDNA 高度保守，变异小。ITS 区最终
不参与核糖体的形成，受到的选择压力较小，进化
速率较快，具有较大的变异性、信息量丰富及序列
短。许多研究表明，ITS1 序列可用于研究无脊椎
动物种间和种内分子进化、系统发育以及种群遗
传多样性，是种类鉴定和系统发育分析的重要分
子标记［2 － 7］。
本试验对毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1 的核苷酸序列
特征进行初步研究分析，为蚶科 3 种贝类的遗传进
化关系提供分子学上的证据，同时为这 3 种贝类的
分类提供分子生物学依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试验材料 试验用毛蚶、泥蚶和魁蚶均采自
海鲜市场，取其肌肉约 50 mg，用于提取基因组 DNA。
1. 1. 2 试剂 海洋动物组织基因组 DNA提取试剂
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
盒和 DH5α 购自天根公司;Taq DNA 聚合酶、dNTPs
和 DNA Marker 购自 TaKaRa 公司;蛋白酶 K 购自
Merk公司;克隆载体 pGEM-T 购自 Promega 公司;
氨苄青霉素购自 AMRESCO 公司;PCR 产物纯化
试剂盒购自 Omiga 公司;其余试剂为进口或国产
分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA 提取 提取基因组 DNA 的具
体步骤参照试剂盒说明。
1. 2. 2 引物设计与合成 上游引物:5-GGTGAAC-
CTGCGGATGGA-3;下游引物:5-GCTGGCTGCGCTCT-
TCAT-3，由上海博尚生物工程有限公司合成。
1. 2. 3 PCR 扩增 反应体系:10 × PCR 缓冲液 5
μL，dNTP(2. 5 mmol /L)8 μL，上下游引物(10
μmol /L)各 2 μL，Ex Taq酶(5 U /μL)0. 25 μL，模板
1 μg，无菌 ddH2O加至 50 μL。PCR反应程序:94℃
预变性 5 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，共
35 个循环;72℃延伸 10 min。PCR 产物于 1. 5% 琼
脂糖凝胶电泳检测。
1. 2. 4 PCR 产物克隆和测序 PCR 产物经纯化试
剂盒纯化后与 pGEM-T 载体连接，转化大肠杆菌
DH5α，在含有氨苄青霉素的 LB 平板上筛选阳性克
隆，于 LB 液体培养基摇菌。菌液送至上海博尚生物
工程有限公司测序，所测 ITS1 核苷酸序列在 Gen-
Bank 注册。
1. 2. 5 分析 用 MEGA3. 1 软件对 ITS1 核苷酸序
列进行分析。
2 结果
2. 1 ITS1 的 PCR 扩增
对毛蚶、泥蚶和魁蚶的 ITS1 序列进行 PCR 扩
增，结果(图 1)显示，在 500 bp 附近见特异性条带。
图 1 毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1 的 PCR 产物
2. 2 毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1 序列碱基组成
对毛蚶、泥蚶和魁蚶的 ITS1 进行 PCR 扩增，测
序后去除两端的 18S rDNA 和 5. 8S rDNA 序列，获
得 424 － 456 bp 的核苷酸序列。毛蚶、泥蚶和魁蚶
序列于 GenBank 注册获得序列号分别为 HQ
612182、HQ 612181 和 HQ 612183。
在毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1核苷酸序列中，G + C含
量在 48. 26%－ 53. 51% 间，A + T 含量在 46. 49%－
51. 74%间。毛蚶和泥蚶的 G + C含量均大于 A + T含
量，而魁蚶的 A +T含量大于 G + C含量，泥蚶的G + C
含量是 3种蚶中最高的。毛蚶和魁蚶碱基总数差异不
大，毛蚶和魁蚶与泥蚶碱基总数差异较大(表 1)。
表 1 毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1 序列的碱基组成
样品名称 碱基总数(bp)
碱基含量(%)
A G C T A + T G + C
毛蚶 424 23. 9 26. 18 25. 47 26. 42 48. 35 51. 65
泥蚶 456 20. 39 28. 07 25. 44 26. 1 46. 49 53. 51
魁蚶 431 23. 9 25. 29 22. 97 27. 84 51. 74 48. 26
2. 3 毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1 序列比对
使用 Mega3. 1 软件对 3 种蚶的序列进行比对
后发现，在 3 种蚶的 479 个序列位点中，共有 330
个保守位点(conserved)、98 个变异位点(variable)
和 94 个单突变位点(singleton) (图 2)。
2. 4 毛蚶、泥蚶和魁蚶间的遗传距离
应用 MEGA3. 1 软件得出 3 种蚶的遗传距离
(表 2) ，毛蚶与泥蚶间遗传距离相对较小，魁蚶与其
他两种蚶的遗传距离相对较大。
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2011 年第 7 期 孙桂金等:毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1 核苷酸序列分析
图 2 毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1 序列比对
表 2 基于 ITS1 序列的毛蚶、泥蚶和
魁蚶间的遗传距离
S. s T. g S. b
S. s
T. g 0. 1606
S. b 0. 1855 0. 193
S. s-毛蚶;T. g-泥蚶;S. b-魁蚶
2. 5 毛蚶、泥蚶和魁蚶的分子进化分析
根据 ITS1 核苷酸序列，使用邻位相连法
(neighbor-joining，NJ)和未加权组对算术平均法
(unweighted pair group method with arithmetic mean，
UPGMA)构建 3 种蚶的系统进化树(图 3-a，图 3-b)。
由图 3 可知，毛蚶和泥蚶先聚为一支，遗传关系较
近;魁蚶后和毛蚶及泥蚶聚为一支。
3 讨论
毛蚶、泥蚶和魁蚶同属于泥蚶科，是我国重要的
经济贝类。其中，泥蚶更为我国海水养殖四大贝类
之一。根据佩尔森纳贝类分类法:毛蚶和魁蚶为泥
蚶科中的毛蚶属，泥蚶为泥蚶科中的泥蚶属。
S． s －毛蚶;T． g －泥蚶;S． b －魁蚶
图 3 基于 ITS1 序列构建的 3 种蚶 NJ(a)和 UPGMA(b)分子进化树
吴洪喜等［8］通过流式细胞仪测定 3 种蚶血细
胞中的 DNA含量。结果表明，泥蚶在进化程度上
要比毛蚶和魁蚶高级，毛蚶和魁蚶的遗传关系近。
本研究对 3 种蚶的 ITS1 序列比较分析发现，3 种蚶
的 ITS1 序列在碱基组成上具有大的差异。根据喻
达辉等［9］的理论，本研究中魁蚶的 A + T 含量低于
G + C含量，毛蚶和泥蚶的 G + C 含量高于 A + T 含
量，这表明魁蚶的变异程度高于毛蚶和泥蚶，在进化
程度上高于毛蚶和泥蚶。这与吴洪喜等研究得出的
结论不一致。吴洪喜等测定 3 种蚶血细胞中的
DNA 含量，分析 3 种蚶进化关系，由于生物体中存
在 C值悖论，因此 DNA 含量的多少并不能说明亲
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
缘关系的远近，所以吴洪喜的观点并不一定正确。
本研究通过分子生物学手段，基于分子水平，对 3
种蚶的 DNA 进行序列分析，所得结果比较可靠。
我们利用邻接法(NJ)和不加权算术平均值法
(UPGMA)构建进化树，对 3 种蚶进行遗传进化分
析。结果表明，毛蚶首先与泥蚶聚合，然后与魁蚶聚
合，说明毛蚶与泥蚶间存在较近的亲缘关系。这与
张波等［10］根据 ITS2 序列构建系统进化树对 3 种蚶
的遗传关系进行研究所得结果一致。
本研究测定了毛蚶、泥蚶和魁蚶 3 种蚶科贝类
的 ITS1 核苷酸序列，并对它们进行分析后发现毛蚶
和泥蚶的遗传关系较近。从分类学上来看，毛蚶和
魁蚶属于同一个属，而泥蚶是另一个属;从形态学分
类角度来讲，毛蚶和魁蚶的亲缘关系较近。但从
ITS1 和 ITS2 分析来看［10］，结果并不是这样的，也许
要确定它们之间的关系，还需要通过其他方法进行
深入研究。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)
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