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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
外显子拼接法克隆紫杉烷 2α-羟基化酶
基因与生物信息学分析
黄仕杰1，2 陈平1 陈晓阳2 辛燕花1，2 郭丽琼1，2 林俊芳1，2
(1华南农业大学食品学院，广州 510640;2华南农业大学生物质能研究所，广州 510640)
摘 要: 紫杉烷 2α-羟基化酶是形成紫杉醇核心骨架的羟基化反应关键酶之一，以 taxusin 作为底物进行氧化生成 2α，
7β-dihydroxytaxusin。利用蔓地亚红豆杉的总 DNA为模板，采用 PCR技术克隆出紫杉烷 2α-羟基化酶的 DNA 序列，利用在线
比对和生物学软件分析其内含子，采用外显子拼接法克隆出紫杉烷 2α-羟基化酶基因的 cDNA序列。测序结果表明该基因含
有 1 个 1 488 bp的开放阅读框，编码 495 个氨基酸的多肽;同源性比较分析结果表明，其碱基序列及氨基酸序列与已经报道的
加拿大红豆杉的紫杉烷 2α-羟基化酶基因的一致性为分别为 98%和 89%。利用 SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对
其列进行了序列分析，为利用代谢工程的方法生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。
关键词: 蔓地亚红豆杉 紫杉醇 紫杉烷 2α-羟基化酶 基因克隆 生物信息学
Molecular Cloning of Taxoid 2-alpha-hydroxylase Gene from
Taxus x media by Exon Spicing and Sequence Analysis
Huang Shijie1，2 Chen Ping1，2 Chen Xiaoyang2 Xin Yanhua1，2 Guo Liqiong1，2 Lin Junfang1，2
(1College of Food Science，South China Agriculture University，Guangzhoug 510640;
2 Institute of Biomass Energy，South China Agriculture University，Guangzhou 510640)
Abstract: Taxoid 2-alpha-hydroxylase is one of the key enzymes that catalyzes the hydroxylation reaction of core skeleton of taxol;
it can use(taxusin)as a substrate and catalyze the 7β-hydro taxusin to form 2α，7β-dihydroxytaxusin． In this study，the genomic DNA of
taxoid 2-alpha-hydroxylase from Taxus x media was isolated by PCR． The DNA sequence was analyzed by software to figure out the in-
trons and exons． Based on this analysis result，specific primers were designed to amplify the exon sequences which were then spliced by
PCR reaction． The result of sequencing showed that the length of the DNA sequence and cDNA sequence is 1 659 bp and 1 488 bp，re-
spectively． The gene contained an opening reading frame of 1 488 bp，which coded for 495 amino acid residues． The result of alignment
showed that its cDNA sequence has 97% similarity to the taxoid 2-alpha-hydroxylase gene of Taxus wallichiana var． chinensis which has
been reported in NCBI，and its protein sequence has 95% similarity to taxoid 2-alpha-hydroxylase of Taxus wallichiana var． chinensis．
Bioinformatics softwares were used to analysis the protein sequence． This research could provide the molecular base for producing Taxol
and its premature materials by metabolic engineering．
Key words: Taxus x media Taxol Taxoid 2-alpha-hydroxylase Gene clone Bioinformatics
收稿日期:2010-10-14
基金项目:国家自然科学基金项目(30371000，31071837)
作者简介:黄仕杰，男，硕士研究生，研究方向:功能基因挖掘与开发;E-mail:huangshijie1986@ 163． com
通讯作者:林俊芳，男，研究员，博士生导师，E-mail:linjf@ scau． edu． cn
紫杉醇(Taxol)是 20 世纪 70 年代发现的一种
具有独特抗肿瘤作用的二萜类天然产物，目前已用
于治疗卵巢癌、乳腺癌、直肠癌等癌症，由于其毒副
作用较小，因此一直是开发治疗癌症药物的研究热
点之一。
紫杉醇(C47 H51 NO14)是一种结构复杂的二
萜类化合物，它是以三环二萜为基本骨架，包含
11 个手性中心［1］。紫杉醇作为抗癌药物的作用
机制是同细胞内的微管蛋白结合并将其冻结，从
而阻止微管蛋白的解聚，进而使癌细胞停止分
2011 年第 4 期 黄仕杰等:外显子拼接法克隆紫杉烷 2α-羟基化酶基因与生物信息学分析
裂，直到死亡［2］。其中 C-13 位置的侧链被认为
是整个紫杉醇分子的活性必要基团，研究发现若
将 C-13 构位由 α 型改为 β 型，则其活性下降将
近 20 倍［3］。
紫杉醇主要从红豆杉的树皮中提取，但由于其只
占红豆杉树皮干重的万分之几，因此从红豆杉中直接
提取紫杉醇不能满足临床应用的需求。目前较常使
用化学半合成紫杉醇的方法，即以 10-去乙酰巴卡亭
III作为合成的起始物，从侧链合成开始需要约 10 个
步骤合成紫杉醇［4］。但是化学半合成法也存在明显
的缺陷，那就是起始化合物 10-去乙酰巴卡亭 III虽然
在部分红豆杉品种枝叶中的含量是紫杉醇的 3 倍以
上，但也是必须从红豆杉中进行提取，而随着紫杉醇
需求量的不断增大，从天然红豆杉中提取 10-去乙酰
巴卡亭 III也将大量消耗自然界中红豆杉的数量。近
年，通过构建紫杉醇代谢途径关键酶基因的组合表达
系统来生产紫杉烯等紫杉醇前体物质的研究已有报
道［5 － 7］，利用微生物作为表达宿主，通过代谢工程的
方法生产紫杉醇或其衍生物的方法成为可能，因此，
对紫杉醇代谢途径中的各个关键酶基因的研究成为
现阶段紫杉醇研究邻域的重点任务之一。
紫杉烷 2α-羟基化酶是紫杉醇下游合成途径中
的关键酶之一，它能以 taxa-4(20) ，11(12)-dien-5-
α，9α，10β，13α-tetraol tetraacetate(taxusin)作为底物
利用，并能将 7β-hydro taxusin 氧化成 2α，7β-di-
hydroxytaxusin。这种 C2 羟基化酶可能会促进紫杉
烷核心骨架 C2 位的中间途径功能化，最终使紫杉
烷核心骨架 C2 位携带一个苯甲酰基团作为重要的
紫杉醇药效基团［8］。
本研究从蔓地亚红豆杉的基因组总 DNA 中克
隆出紫杉烷 2α-羟基化酶基因的 DNA 序列，根据测
序结果进行内含子分析，首次利用外显子拼接法克
隆出紫杉烷 2α-羟基化酶基因的 cDNA序列，并对该
基因的结构与推导的氨基酸序列进行生物信息学分
析，为进一步利用该基因进行紫杉醇代谢工程研究
奠定了分子基础。
1 材料与方法
1. 1 材料、菌株及主要试剂
蔓地亚红豆衫购自广东省韶关市金山地红豆杉
科技有限公司。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株
DH5ɑ，本实验室保存。克隆载体 pGEM-T Easy vec-
tor购自广州莱德尔生物科技有限公司。Ex Taq 酶
购自大连宝生物工程有限公司。Pfu 聚合酶、dNTP
购自广州东盛生物科技有限公司。质粒小提和胶回
收试剂盒购自天根生化科技有限公司。引物合成由
上海捷瑞生物工程有限公司完成。测序由华大基因
科技有限公司完成。
1. 2 总 DNA的提取
以幼嫩的蔓地亚红豆杉叶片为材料提取基因组
DNA。总 DNA的提取采用 CTAB 法:取 0． 5 g 植物
材料，放入冷冻的研钵中并加入适量 PVP 研成粉
末，加入 1 mL CTAB 继续研至匀浆，然后在低温下
研磨成匀浆，具体操作参考已报道的文献［9］。
1. 3 紫杉烷 2α-羟基化酶基因的克隆
1. 3. 1 基因组 DNA序列的克隆 根据已报道的加
拿大红豆杉基因序列(GenBank 登录号:AY518383)
设计 PCR 引物:上游引物 7F:5-ATGGACGCCATG-
GATCTCACAG-3;下游引物 7R:5-GGATCGAGAAAT
AAGTTTAATAGG-3。使用 7F /7R 引物对，Ex Taq 聚
合酶，以提取的总 DNA为模板进行 PCR扩增，50 μL
的反应体系中，分别加入 10 × PCR Buffer 5． 0 μL，
dNTP． 2． 0 μL，7F 和 7R 引物各 2． 0 μL，DNA 模板 2
μL，Ex Taq聚合酶 0． 5 μL，ddH2O 38． 5 μL，PCR程序
为 94℃ 5 min，94℃ 40 s，52℃ 45 s，72℃2 min，35 个
循环;72℃延伸 8 min。PCR 产物经 1%的琼脂糖凝
胶电泳检测后回收目的片段，按 pGEM-T Easy载体快
速连接试剂盒操作说明将回收的目的 DNA 片段与
pGEM-T Easy载体连接，连接产物转化 DH5α感受态
细胞，蓝白斑筛选获得单克隆，取阳性菌落质粒提取，
酶切鉴定正确后送华大基因科技有限公司测序。
1． 3． 2 外显子拼接法克隆 cDNA 序列 利用 NCBI
Spidey以及 DNAssist 对所克隆的 DNA 序列进行内
含子分析，显示有两个内含子序列，且均符合 GT-
AG rules。根据外显子序列设计并合成引物，如表 1
所示。其中 P1引物 5端与外显子 2 的 5端同源，3
端与外显子 1 的 3端同源;P2引物 5端与外显子 1
的 3端同源，3端与外显子 2 的 5端同源;P3引物 5
端与外显子 3 的 5端同源，3端与外显子 2 的 3端
同源;P4引物 5端与外显子 2 的 3端同源，3端与外
显子 3 的 5端同源，P1与 P2两个引物前 26 个碱基反
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
向互补，P3和 P4两个引物前 26 个碱基反向互补。
用 7F和 P1引物扩增外显子 1，用 P2和 P3引物扩增
外显子 2，用 P4和 7R引物扩增外显子 3。将所得的
外显子 1、外显子 2 和外显子 3 的核酸片段分别进
行回收纯化，以外显子 2 和外显子 3 的纯化产物为
模板进行外显子拼接反应，反应体系为 50 μL，其中
10 × PCR Buffer 5． 0 μL，dNTP 2． 0 μL，外显子 2 和 3
的回收片段各 5． 0 μL，Pfu 聚合酶 1 μL，ddH2 O 28
μL。反应条件为 94℃ 5 min，94℃ 1 min，50℃ 1
min，72℃ 4 min，预拼接两个循环后加入 P2和 7R引
物各 2 μL进行 PCR 反应，反应条件为 94℃ 5 min，
94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 2 min，35个循环，72℃延
伸 8 min。PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测后
回收纯化目的片段，与外显子 1的纯化片段进行拼接
反应，条件同上。PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳
检测。外显子拼接试验流程见图 1。
表 1 用于外显子拼接的引物
引物 引物序列(5→ 3)
P1
P2
P3
P4
ATCTCCAATTGCTCTTGAACTACTTTTTCAT
AAAGTAGTTCAAGAGCAATTGGAGATAGCTT
TTGCCCATGAAAATTGCCATCCTTTTGGAAT
AAAAGGATGGCAATTTTCATGGGCAACTTAT
图 1 外显子拼接过程示意图
1. 4 TA克隆与序列测定
回收目的片段，按 pGEM-T Easy 载体快速连接
试剂盒操作说明将回收的目的 cDNA片段与 pGEM-
T Easy载体连接，连接产物转化 DH5α感受态细胞，
蓝白斑筛选获得单克隆，取阳性菌落质粒提取，酶切
鉴定正确后送华大基因科技有限公司测序。
1. 5 生物信息学分析
核酸序列比对在 NCBI BLAST(http:/ /blast． nc-
bi． nlm． nih． gov)上进行，氨基酸序列比对在 EBI －
BLAST(http:/ /www． ebi． ac． uk)上进行，序列分析
用 DNassist 2． 0 和 NCBI Spidey完成，核酸与氨基酸
序列绘制用 DNAMAN完成，蛋白质结构与功能的预
测在 Swissprot(http:/ /www． expasy． ch /sprot /)网站
上提供链接的平台上进行。
2 结果与分析
2. 1 紫杉烷 2α-羟基化酶基因的克隆及序列比对
以蔓地亚红豆杉基因组 DNA 为模板，7F 和 7R
为引物进行 PCR 扩增，获得一条特异性扩增的条
带，大小约为 1． 7 kb。测序后的实际长度为 1 659
bp，将序列递交至 NCBI BLAST进行比对，与南方红
豆杉的紫杉烷 2α-羟基化酶的 DNA 序列相识性达
到 97%，将克隆的序列命名为 Tm2αhy-DNA，内含子
分析表明，具有 2 个内含子，分别位于 DNA 序列的
992 － 1 077 bp 和 1 266 － 1 350 bp 处，均符合 GT-
AG Rules，它把整个基因分为 3 个外显子。以连接
有 Tm2αhy-DNA的 T 载体为模板，进行外显子的
拼接，完整过程如图 1 所示，分别用特异性引物扩
增出外显子 1，2，3，大小约为 1 000 bp，200 bp，300
bp(图 2)。首先对外显子 1 和 2 进行拼接，获得
一条大小约为 500 bp的特异性条带，将条带回收
M． marker;1 － 3．分别为 exon1，exon2，exon3;4． cDNA
图 2 外显子及 cDNA PCR扩增电泳图
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2011 年第 4 期 黄仕杰等:外显子拼接法克隆紫杉烷 2α-羟基化酶基因与生物信息学分析
纯化，与外显子 1 进行拼接反应，获得一条大小约为
1． 5 kb的特异性条带(图 2) ，测序后的实际长度为
1 488 bp，cDNA 序列命名为 Tm2αhy，在 NCBI 上进
行比对，与加拿大红豆杉紫杉烷 2α-羟基化酶基因
序列相似性达到 98%，有 28 个碱基的差异，推导的
氨基酸序列在 EBI-BLAST 上进行比对显示与加拿
大红豆杉紫杉烷 2α-羟基化酶相似性为 89%，将
DNA序列利用 DNassist 2． 2 进行序列比对和 BLAST
分析显示它在外显子区与全长 cDNA 序列完全一
致。这些结果表明成功克隆了蔓地亚红豆杉紫杉烷
2α-羟基化酶基因，序列结果和推导的氨基酸序列见
图 3。
圆圈表示起始密码子和终止密码子，方框表示 N-糖基化位点，双线表示 N-酰基化作用位点，三角形表示细胞色素
P450 半胱氨酸血红素铁配体标签
图 3 Tm2αhy序列和推导的氨基酸序列
2． 2 紫杉烷 2α-羟基化酶基因的生物信息学分析
Tm2αhy编码一个长为 495 个氨基酸的多肽，利
用 SWISS-PROT网站的蛋白质初级结构分析工具计
算得其相对分子量为 55. 5 kD，等电点为 9. 54。利
用在线网站 iPSORT prediction 预测信号肽定位，结
果显示该氨基酸序列不含有信号肽、叶绿体定位肽
和线粒体转运肽，说明紫杉烷 2α-羟基化酶为非分
泌型蛋白，催化的羟基化作用发生在细胞质内。利
用 PredictProtein［10］网站预测该氨基酸序列含有 2
个 N-糖基化位点，9 个蛋白激酶 C 磷酸化作用位
点，4 个 N-酰基化作用位点，1 个细胞色素 P450 半
胱氨酸亚铁血红素配体标签(图 3) ，在酵母和大肠
杆菌中的半衰期分别为大于 20 h 和大于 10 h。利
用 protscale在线预测蛋白的溶解性，结果(图 4)表
明该氨基酸序列为亲水性蛋白。通过 NCBI 网站的
conserved domains 寻找氨基酸序列的保守结构，结
果显示该序列具有细胞色素 P450 超家族保守结构
域。将 Tm2αhy氨基酸序列递交 EBI-BALST进行序
列比对，只找到 2 条已报道的紫杉烷 2α-羟基化酶
氨基酸序列，与加拿大红豆杉紫杉烷 2α-羟基化酶
的相似性为 89%，与南方红豆杉紫杉烷 2α-羟基化
酶的相似性为 88%，并未找到其他物种中报道的紫
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
峰值大于零为疏水性峰，峰值小于零为亲水性峰
图 4 Tm2αhy的亲疏水性预测结果
杉烷 2α-羟基化酶序列，说明对紫杉烷 2α-羟基化酶
的研究尚出于起步阶段，还需继续深入。
通过 SOMPA 预测紫杉烷 2α-羟基化酶的二级
结构，结果(图 5)显示紫杉烷 2α-羟基化酶含有
49. 49%的 α-螺旋，13. 54%的延伸链，4. 44%的 β-
转角和 32. 53%的无规则卷曲。可以看出，紫杉烷
2α-羟基化酶蛋白含有较多的 α-螺旋和无规则卷
曲，而延伸链和 β-转角则散布于整个蛋白中。
竖线由长及短分别代表 α-螺旋、延伸链、β-转角及无规则卷曲
图 5 蛋白质二级结构预测图谱
将 Tm2αhy 推导的氨基酸序列递交至 EBI-WU
BLAST上进行蛋白质同源性比对，结果显示与加拿
大红豆杉以及南方红豆杉的紫杉烷 2α-羟基化酶的
相识性分别为 89%和 88%，与东北红豆杉的紫杉烷
7β-羟基化酶具有 60%的相识性，与日本红豆杉的
紫杉烯 5α-羟基化酶和东北红豆杉的紫杉烷 14β-羟
基化酶都具有 59%的相识性，与东北红豆杉的紫杉
烷 13α-羟基化酶的相识性则为 54%，此外，与红豆
杉内生真菌 Ozonium sp． BT2 的紫杉烷 10β-羟基化
酶的相识性为 56%。选择这 6 个与目的蛋白序列
相识性最高的紫杉醇合成羟基化酶的氨基酸序列，
利用 GENEDOC软件进行多重比对的同源性分析，
结果如图 6 所示。
2A(T． canadensis)．加拿大红豆杉的紫杉烷 2α-羟基化酶;2A(T． chinensis)．南方红豆杉的紫杉烷 2α-羟基化酶;10B(T． Ozonium sp．)．红豆
杉内生真菌 Ozonium sp． BT2的紫杉烷 10β-羟基化酶;5A(T． cuspidata)．日本红豆杉的紫杉烯 5α-羟基化酶;14B(T． cuspidata)．东北红豆
杉的紫杉烷 14β-羟基化酶;7B(T． cuspidata)．东北红豆杉的紫杉烷 7β-羟基化酶;Tm2αhy．本研究所克隆的羟基化酶
图 6 推导氨基酸序列的同源性比对图谱
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2011 年第 4 期 黄仕杰等:外显子拼接法克隆紫杉烷 2α-羟基化酶基因与生物信息学分析
选取以上进行氨基酸残基同源性比对的蛋白
质序列，采用 Neighbor-joining 方法(MEGA4)构建
了系统进化树(图 7)。图 7 显示，Tm2αhy 与加拿
大红豆杉和南方红豆杉的紫杉烷 2α-羟基化酶处
于同一个进化分枝，其中与已经报道的加拿大红
豆杉紫杉烷 2α-羟基化酶的亲缘关系最近，进一步
证明所克隆的基因是预期的目的基因。另外，2α-
羟基化酶与 7β-羟基化酶的亲缘关系最近，与 5α-
羟基化酶和 14β-羟基化酶的亲缘关系相对最远，
而真菌来源的 10β-羟基化酶则独立形成一个进化
小分枝。
图 7 Tm2αhy的进化树分析图
3 结论与讨论
紫杉醇是目前公认的抗癌效果好且毒副作用小
的天然化合物，但是由于红豆杉的生长周期很长且
紫杉醇从红豆杉中的提取量极少，使得紫杉醇在医
疗健康上的应用受到了较大的限制。近年来蓬勃发
展的植物次级产物代谢工程为紫杉醇的利用开辟了
新的道路［10］，国内外学者纷纷克隆紫杉醇合成途径
中的关键酶基因并在不同宿主中进行组合表达来获
得紫杉醇前体物质［5-7］。紫杉烷 2α-羟基化酶是紫
杉醇下游合成途径中的关键羟基化酶之一，将 7β-
hydrotaxusin 氧化形成 2α，7β-dihydroxytaxusin［8］。
目前已有报道从加拿大红豆杉和东北红豆杉中克隆
出紫杉烷 2α-羟基化酶，但在蔓地亚红豆杉中克隆
尚未有报道。
本研究首次从蔓地亚红豆杉中成功克隆出紫杉
烷 2α-羟基化酶 DNA 序列，并对其进行内含子分
析，利用外显子拼接法克隆出 cDNA 序列。利用
cDNA序列推导出假定的氨基酸序列，利用 NCBI 的
conserve domain进行保守结构域分析，结果显示属
于细胞色素 P450 超家族。同源性比对发现，与加拿
大红豆杉和南方红豆杉的紫杉烷 2α-羟基化酶的相
识性分别达到 89%和 88%，根据 P450 分类规则，具
有 45%氨基酸残基同源性的属于同一 P450 蛋白的
亚家族［11］，因此推断所克隆的 Tm2αhy 基因是编码
P450 亚家族 CYP725A的一种羟基化酶。选取氨基
酸序列相识性较高的不同羟基化酶构建进化树，结
果显示 Tm2αhy编码的蛋白质与紫杉烷 2α-羟基化
酶属于同一个进化小分枝，而与 2α-羟基化酶亲缘
关系最近的是 7β-羟基化酶，这可能是因为它们都
可以利用 taxusin作为底物，催化形成不同产物［12］，
需要进一步的验证它们的活性中心是否相识。
外显子拼接法被首次运用在紫杉醇关键酶基因
的克隆中，被证明是比传统的 RT-PCR 具有更高的
效率，并且避免了复杂的 RNA操作。该项技术更多
的应用于序列的定点突变［13］和载体的构建［14］，被
证明是一种简便高效的方法，近年来也被运用于基
因克隆［15，16］。本研究首次将外显子拼接法引入到
紫杉醇合成途径关键酶基因的克隆，降低了紫杉醇
代谢工程前期的基因克隆工作的难度并打下了分子
基础。
参 考 文 献
［1］ Mastropaolo D，Camerman A，Luo Y，et al． Crystal and molecular
structure of paclitaxel(taxol)． Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:
6920-6924．
［2］叶姜瑜，高峰．利用生物技术生产紫杉醇研究进展．贵州大学学
报，1998，15(2) :139-143．
［3］赵锐，赵玮玮． 抗癌植物药紫杉醇研究进展与动态． 中草药，
2009，40(7) :1172-1174．
［4］孔建强，王伟，朱平，等．紫杉醇生物合成的研究进展．药学学报，
2007，42(4) :358-365．
［5］DeJong JM，Liu YL，Bollon AP，et al． Genetic engineering of taxol bi-
osynthetic genes in Saccharomyces cerevisiae． Biotechol Bioeng，
2006，93:212-224．
［6］Wang W，Meng C，Zhu P，et al． Preliminary study on metabolic engineer-
ing of yeast for producing taxadiene． Chin Biotechnol，2005，25:103-108．
［7］Huang QL，Roessner CA，Croteau R，et al． Engineering Escherichia
coli for the synthesis of taxadiene，a key intermediate in the biosyn
thesis of taxol． Bioorg Med Chem，2001，9:2237-2242．
［8］Chau MD，Croteau R． Molecular cloning and characterization of a cy-
191
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
tochrome P450 taxoid 2 alpha-hydroxylase involved in Taxol biosyn-
thesis． Arch Biochem Biophys，2004，427(1) :48-57．
［9］闫苗苗，魏光成，潘效红，等． 一种适用于动物与植物总 DNA 提
取的方法———改良 CTAB 法． 安徽农业科学，2008，36(20) :
8488，8558．
［10］Sheludko YV． Recent advances in plant biotechnology and genetic
engineering for production of secondary metabolites． Cytology and
Gene tics，2010，44(1) :52-60．
［11］冯磊．中国红豆杉紫杉烷 13a-羟基化酶基因的克隆及表达［D］
曲阜:曲阜师范大学，2006．
［12］孔建强，王伟，朱平，等． 紫杉醇生物合成的研究进展． 药学学
报，2007，42(4) :358-365．
［13］苏燕，邵国，高嵩单，等．一种简便高效利用重叠延伸 PCR 进
行基因定点突变的方法． 包头医学院学报，2007，23(6) :
559-560．
［14］ Gibson DG，Young L，Chuang RY，et al． Enzymatic assembly of
DNA molecules up to several hundred kilobases． Nature Methods，
2009，6:343-347．
［15］胡亚平，夏玉平，吴刚，等． 重叠延伸 PCR 克隆拟南芥 ACCase
基因和植物表达载体构建． 中国油料作物学报，2009，31(4) :
407-412．
［16］张变玲，张儒，姬婧媛，等．重叠延伸 PCR 法克隆人脂联素基因
及其在毕赤酵母中表达． 生物工程学报，2008，24 (8) :
1480-1484．
(责任编辑 李楠)
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