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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
HIV
1 Gag多表位嵌合基因的构建
及表达蛋白的抗体制备
柳发勇1  韩莉2  刘朝奇 1  覃晓琳 1  杨凡 1  余枫华 3
( 1三峡大学分子生物学研究所,宜昌 443002; 2三峡大学医学院,宜昌 443002; 3湖北省宜昌市疾病预防控制中心,宜昌 443002)
  摘  要:  旨在通过构建 Gag的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达, 为 H IV诊断及可能的疫苗制备提供试验基
础。选定 H IV
1 Gag基因中 3个片段包含较多抗原表位的区域, 设计带有酶切位点的引物,用 PCR的方法从 H IV
1HXB2全基因
扩增编码这 3个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性, SDS
PAGE和W estern blotting测定融
合蛋白的表达, 并免疫动物制备相应抗体。结果显示,构建的 H IV
1 Gag多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基
因序列正确,基因全长 576 bp。在大肠杆菌 BL21( DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为 27 kD,以包涵体的形式存在。纯化目的蛋白
免疫家兔,制备多克隆抗体 IgG。ELISA和免疫荧光方法检测显示制备的多克隆抗体能具有特异性反应。成功构建和高表达了 H IV

1 Gag多表位融合蛋白,纯化蛋白制备的抗体与 H IV
1 Gag有特异性结合。为进一步研究 H IV
1奠定了试验基础。
关键词:  H IV
1 G ag嵌合基因 蛋白表达 抗体 免疫原性
Construction and Expression of Chimeric Domains Derived
from H IV
1 Gag and ItsAntibody Preparation
L iu Fayong
1
H an L i
2
L iu Chaoqi
1  Q in X iaolin1 Yang Fan1  Yu Fenghua3
(
1
Institute of M olecular B iology, Three Gorges University, Yichang 443002;
2
M edical College of Three Gorges
University, Yichang 443002;
3
Centers forD isease Control of Yichang, Yichang 443002)
  Abstrac:t  H um an imm unodefic iency v irus ( H IV ) is the etio log ic agent of A IDS. Fo r clinica l diagnosis and deve loping vacc ine
o fH IV
1, we prepared H IV
1 Gag fusion prote in and its antibody. Three gene fragments ofH IV
1 Gag conta in ing h igh ly imm unogen ic
ep itopes w ere am plified by PCR from plasm id o fH IV
1 HXB2. The PCR produc tsw ere liga ted and c loned into a prokaryo tic express ion
vec to r pET28a( + ) and the accuracy o f the inserted fragm ents w as identified by sequenc ing. To express theH IV
1 G ag fusion ep itopes
in E. coli cells and identify fusion prote in, the induced prote in w as checked w ith SDS
PAGE andW estern b lo tting (WB). The pur ified
prote in w as used to imm un ize rabb it for 3 tim es to prepare po lyc lonal antibody. Rabbit anti
serum spec ific ity and its titer toH IV
1 Gag
w ere assayed by EL ISA and cell immunofluorescence ( CIF ). Resu lts indicated that the length o f the chim e ric fragm ent derived from
H IV
1 Gag was 576 bp, and encoded 27 kD prote in. Procaryo tic express ion plasm id was constructed successfu llyw hich can h igh effec

tive ly express Gag fusion pro te in. Recom binant fusion pro tein w as expressed in Eser ichia coli BL21( DE3) as an insolub le prote in. A
h igh titer an tibody through imm un izing rabb it w ith the purified pro te in w as obta ined. The da ta of CIF dem onstrated tha t the anti
serum
had h igh spec ificity forH IV
1 Gag expressed in B16 ce lls. Therefore, it proved tha t pro ca ryotic expression p lasm id wh ich can h ighly ex

press Gag fusion prote in was successfully constructed. P repared polyc lona l antibody was high spec ific and affinitic by immunized rab

b it. The found ing and sub jects we re prov ided for the research o fH IV
1 d iagnosis k it and vacc ine.
Key words:  H IV
1 Gag fusion gene P rocaryo tic expression An tibody Imm unogen icity
收稿日期: 2009
12
10
基金项目:湖北省卫生厅科研项目 ( 2007
JX3B80) ,宜昌市科技项目 ( 2008
A08302
26 )
作者简介:柳发勇,男,硕士研究生,研究方向:病毒免疫学和分子生物学; E
m ai:l L iu fayong 1983@ yahoo. com. cn
通讯作者:韩莉, E
m ai:l hlyyh@ ctgu. edu. cn
获得性免疫缺陷综合征 ( A cquired immunode fi
ciency syndrome A IDA ), 简称艾滋病, 已成为危害全
2010年第 4期     柳发勇等: H IV
1 Gag多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的抗体制备
球的一种严重传染性疾病 [ 1]。目前尚无有效的疫
苗和治疗药物。人免疫缺陷病毒 1型 (H IV
1) gag
基因编码的病毒核心蛋白 Gag, 由于具有高度保守
的氨基酸序列,在 H IV感染的诊断、治疗和病程预
测等方面具有重要的作用, Gag抗原作为免疫原能
够诱导广泛交叉反应性的细胞和体液免疫反应,是
几乎所有 H IV疫苗的重要组分 [ 2 ]。因此,克隆编码
H IV
1 gag上具有较强免疫原性的蛋白基因,将其进
行原核表达,制备多克隆抗体, 以期为疫苗及检测试
剂的研究奠定试验基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
限制性内切酶、T4连接酶及 TaqDNA聚合酶均购
自 Fermentas公司。菌株 E. coli DH5
、E. coli BL21
( DE3)、质粒 pET28
a( + )和 H IV
1 HXB2重组质粒
由本研究所保存。HRP标记的羊抗人 IgG购自北京
中杉金桥生物技术有限公司。H IV
1阳性血浆由宜
昌市 CDC确证后提供。新西兰大耳白兔购自湖北省
实验动物中心 (动物合格证号: 00002964)。
1. 2 pET28a( + )
Gag嵌合片段 ( Gag)重组质粒
的构建 [ 6]
选择 Gag中的能诱发机体产生抗体的重要区域
的 3段抗原表位, 以 H IV
1HXB2基因为模板, PCR
方法分别扩增 3段基因。通过引物中分别引入酶切
位点N co I/BamH I, BamH I / Xho I及小片段直接
合成的方法构建嵌合基因, 原核表达载体 pET28a
( + )用 N co I / Xho I双酶切将其线性化后, 与目的
基因的酶切产物于 16 连接过夜, 5 L连接产物
转入大肠杆菌 DH5a中, 接种 LB固体培养基 37
培养过夜。挑取单克隆至 3 mL卡那霉素抗性的 LB
培养基中 37 , 220 r /m in培养过夜, 次日提取质粒
进行测序鉴定。
1. 3 pET28a( + )
Gag嵌合基因原核表达与鉴定
将构建好的重组质粒 pET28a( + )
Gag转化
到宿主菌 BL21 ( DE3 )中, 经 IPTG (终浓度 1. 0
mmo l /L)诱导表达,收集的细菌加入等体积 2 ! SDS
凝胶上样缓冲液, 100 煮沸 3m in,冰浴 4m in,室温
下离心 ( 12 000 r /m in ) 1 m in, 取 20 L进行 SDS

PAGE电泳。考马斯亮蓝染色, 通过凝胶成像系统
测定表达的产量。W estern b lo tt ing检测重组 pET28a
( + )
G ag蛋白, SDS
PAGE电泳后转移硝酸纤维
素膜,用 5%脱脂奶粉封闭;加抗 H IV
1阳性病血浆
(加入 0. 05% Tr itonX
100灭活病毒 )为一抗 ( 1∀
200)室温轻摇作用 2 h; TBST洗涤 3次,每次 5m in;
加入 HRP标记的羊抗人 IgG ( 1∀2 000)室温反应
2 h,同上洗涤; 在新配制的二氨基联苯胺 ( DAB )和
0. 03% H2O2溶液中于室温下摇动至出现紫黄色条
带, 蒸馏水冲洗终止显色。
1. 4 pET28a( + )
Gag蛋白的纯化
质粒 pET28a( + )
Gag阳性菌 BL21( DE3)经
IPTG诱导表达, 5 000 r/m in离心收集菌体,菌体用
PBS悬浮后再离心, 弃上清。菌体重悬于 Buffer A
中 ( 0. 5M N aC ,l 20 mM Tris
HC ,l pH8. 0) 4 超声
波粉碎,离心得到包涵体,洗涤后,沉淀用 10mL溶
液 B( 50mM Tris
HC l pH8. 0, 1mM EDTA, 2. 0M尿
素 )洗涤, 沉淀用 2mL 1 !上样缓冲液重悬, 水煮 5
m in, SDS
PAGE电泳。 SDS
PAGE胶用冰冷的 0. 25
M KC l染色 5- 10m in,切下目的蛋白,碾碎, 加等体
积的水, 4 放置过夜,低温离心取上清,获得的蛋白
应用 5%甘油的 PBS透析 36- 48 h, 即得到纯化的
目的蛋白, W estern b lotting进一步鉴定。
1. 5 纯化的重组蛋白抗原检测 H IV抗体
纯化的重组蛋白经 SDS
PAGE电泳后转移硝酸
纤维素膜, 制备成抗原条带。然后对随机抽取的
H IV
1阳性临床血浆标本和 H IV
1阴性血清标本进
行检测。用 5% 脱脂奶粉封闭; 加入血浆 (加入 0.
05% TritonX
100灭活病毒 )为一抗 ( 1∀200)室温轻
摇作用 2 h; TBST洗涤 3次,每次 5 m in; 加入 HRP
标记的羊抗人 IgG ( 1∀200)室温反应 2 h , 同上洗
涤; 在新配制的二氨基联苯胺 ( DAB )和 0. 03% H 2
O2溶液中于室温下摇动至出现紫黄色条带, 蒸馏水
冲洗终止显色。
1. 6 纯化蛋白多克隆抗体的制备
纯化后的 GAG蛋白免疫日本大耳白兔, 1
mL蛋白溶液 (约 500 g )与等量弗氏完全佐剂 ,
超声混匀制成乳化抗原, 在兔子脊柱两侧进行多
点皮内注射。分别在免疫 2周, 4周后用 500 L
(约 200 g )蛋白质加等量弗氏不完全佐剂通过
超声混匀, 在脊柱两侧皮内注射加强免疫。免疫
6周后, 颈动脉取血, 分离抗血清, EL ISA法测定
147
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
其抗体滴度。
1. 7 抗体滴度的测定
ELISA法测定多克隆抗体滴度: 用包被液
( pH9. 6 0. 05M碳酸盐缓冲液 )稀释原核表达纯化
后的 Gag蛋白,以 100 L /孔 ( 100 ng )包被 ELISA
板, 4 过夜; PBST( 0. 5mL /L Tw een20 PBS)洗涤洗
后用 10 g /L BSA
PBST封闭, 37 湿盒内保温 1 h ;
PBST洗涤,加入兔抗血清 ( 1∀100 - 1∀312 500)作
为一抗 ,同时用免疫前血清做阴性对照, 37 作用
1 h ; PBST洗涤,加入 HRP标记的羊抗兔 IgG ( 1∀
30 000) , 37 作用 1 h; PBST洗涤 4次; 每孔各加入
TMB 100 L显色, 37 避光作用 10 m in;加 50 L
终止液 ( 2 mo l /L H2 SO 4 )终止反应。酶标仪 450 nm
波长处测吸光度值。
1. 8 细胞免疫荧光法测定 GAG抗体的特异性
小鼠黑色素瘤 B16细胞系用 RPM I
1640培养
基常规培养。细胞以 1 ! 105 /mL接种于细胞培养
瓶,将 pCDNA3. 1 ( + )
Gag和 pCDNA3. 1 ( + ) (对
照 )质粒通过脂质体转染到细胞中, 待细胞长满后,
将细胞传入放有无菌玻片的 24孔板中, 培养 48 h
后取出细胞爬片;用冰冷的 PBS洗 3次, 用 2%多聚
甲醛 4 固定 30 m in, 0. 5% TritonX
100PBS处理细
胞 10m in; PBS洗 3次,用 10%的山羊血清室温封闭
1 h; PBS洗 3次, 滴加适当稀释倍数的上述兔抗血
清, 37 孵育 1 h; PBS洗 3次, 用罗丹明标记的羊
抗兔 IgG 37 孵育 1 h; PBS洗 3次,荧光显微镜观
察、拍照。
2 结果
2. 1 重组质粒 pET28a( + )
Gag片段的构建
应用 PCR方法从 H IV
1 Gag基因片段中获得 3
个片段,经过酶切将片段插入 pET28a( + )载体中,
获得 pET28a( + )
Gag融合片段的重组质粒。构建
的重组质粒 pET28a ( + )
Gag经 PCR和酶切鉴
定,其大小为 576 bp, 与设计的片段大小一致 (图
1)。进一步应用 DNA测序鉴定,其结果与我们设计
的 Gag的核苷酸序列一致。
2. 2 SDS
PAGE电泳和W estern blotting分析
将重组质粒 pET28a ( + )
Gag融合片段转化
大肠埃希菌 BL21 ( DE3)感受态细胞内。经 1. 0
mmo l /L IPTG诱导 4- 6 h后,表达蛋白经 10% SDS
A: 1. 1 kb DNAM arker; 2. PCR Gag片段 PCR产物; B: 1.
1 kb DNA M arker; 2.重组质粒 pET28 a( + )
G agdN co
I/ X ho I双酶切产物
图 1 重组质粒 PET28a( + )
Gag片段的鉴定

PAGE电泳。诱导后的菌液在大约 27 kD处出现明
显的目的条带, 未经诱导的菌液无相应条带 (图 2

A )。蛋白凝胶分析图表明, pET28
G ag蛋白表达
量约占全菌体总蛋白的 21%。电泳分离的蛋白转
印到硝基纤维膜。以 H IV
1阳性病血浆为一抗,
HRP标记的羊抗人抗体为二抗, 对表达产物进行
W estern b lo tting分析, 得到的特异性蛋白的分子量
约为 27 kD的蛋白,且嵌合抗原可在原核表达系统
中表达,表达量高 (图 2
B )。
A: 1.蛋白质分子量标准; 2. 未经 IPTG诱导的 PET28

Gag表达产物; 3. 经过 IPTG诱导的 pET28
G ag表达
产物; 4. 纯化后的表达产物
B : M r.蛋白质分子量标准; 1. 未经 IPTG诱导的 PET28

Gag表达产物; 2. 经过 IPTG诱导的 pET28
G ag表达
产物
图 2 SD S
PAGE电泳 ( A)和 W estern blotting ( B)
分析 pET28a( + )
Gag融合片段的表达
148
2010年第 4期     柳发勇等: H IV
1 Gag多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的抗体制备
2. 3 pET28a( + )
Gag蛋白的纯化
SDS- PAGE分析结果表明, 表达产物主要存在
于超声破碎菌液的沉淀中,上清分布的很少,所以认
为目的蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经洗
涤、增溶后, 经切胶纯化分离蛋白, 所得 pET28
Gag
融合片段蛋白纯度达 98%以上 (图 2
A )。
2. 4 兔血清多克隆抗体制备及检测
将纯化的重组蛋白加入弗氏佐剂免疫日本大耳
白兔, 通过 ELISA检测制备的血清显示免疫家兔的
抗血清滴度可达 60 000以上, 以正常兔血清为阴性
对照 ( 100倍稀释 OD值为 0. 212) (图 3)。
图 3 ELISA法测定 H IV
1Gag抗血清效价
2. 5 抗体的特异性测定
用 RPM I
1640培养基常规培养的小鼠黑色素
瘤 B16细胞系表达 H IV
1 G ag抗原,细胞免疫荧光
染色检测 Gag抗体的特异性,加入待测兔抗血清,以
正常兔血清为阴性对照, 用罗丹明标记的羊抗兔
IgG为二抗进行染色, 显微镜下观察 Gag抗体在 B16
细胞中的结合情况 (图 4)。Gag抗体主要定位于细
图 4 细胞免疫荧光染色方法鉴定
H IV
1Gag抗体结合的特异性
胞浆,明显异于阴性血清染色的细胞。
3 讨论
H IV是诱发艾滋病的病原体, H IV的流行已成
为人类公共卫生健康的最大问题之一 [ 1]。对 H IV
抗体的检测可以用来确定 H IV感染、检测病情发
展。敏感实用的检测方法对于监测、诊断或血液筛
查, 控制艾滋病的流行尤为重要。H IV抗体检测是
H IV感染病原学检测最常用的方法。H IV核心蛋白
( G ag)是相对保守的结构蛋白,在临床诊断,疫苗疗
效评价方面进行广泛了研究 [ 3 - 5 ]。H IV gag基因编
码病毒的壳蛋白, 翻译时先形成一个相对分子质量
为 55 kD的前体蛋白 ( p55) ,然后在 H IV蛋白酶的
作用下裂解成 p17、p24、p15三种蛋白。有研究表
明, 只有抗 - Gag CTL应答与低病毒血症相关,它可
能在慢性感染中起着控制病毒载量的作用, 而针对
Env、N ef等蛋白的 CTL应答与高病毒载量相关。这
些研究提示 G ag可能是以诱导广泛的 CTL反应为
基础的候选疫苗的首选抗原 [ 2, 3]。本实验室对 NC

B I发表的 H IV
1序列做了同源比较, 分析了 H IV
1
Gag蛋白氨基酸的疏水性及潜在的抗原表位, 选择
了含有较多抗原决定簇且保守性强的三段基因组成
嵌合基因, 涵盖了 p17、p24、p15三种蛋白中具有较
强免疫活性的抗原决定簇, 构建高效的原核表达系
统, 获得了表达量高,易于纯化的重组蛋白。并用制
备的纯化 H IV Gag融合蛋白免疫动物制备了相应多
克隆抗体,所得抗体具有较强的免疫原性,能够与真
核细胞表达的病毒蛋白特异性结合。这些研究为
H IV疫苗制备及诊断试剂的开发奠定了试验
基础 [ 6, 7]。
参 考 文 献
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(下转第 160页 )
149
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
等 [ 7]进行的转基因试验了发现含有内含子时能比
cDNA的表达水平提高 5- 75倍。而国内学者卢一
凡等 [ 16]的研究也得出类似的结论,并且证明了内含
子插入的位置对转基因的表达没有影响。
本试验进行了两次重叠, 第一次重叠是以 cD

NA的 3个片段为模板的, 所以扩增出的片段使重叠
部分非常长, 5#和 3#重叠的部分分别为 83 bp和 109
bp,重叠延伸能能有效进行; 第二次重叠是在内含
子和切开的 cDNA片段的引物中均为重叠部分故有
两端都有 50 bp的重叠部分,重叠也能有效进行。
在应用重叠延伸 PCR技术时, 必须考虑 DNA
聚合酶的质量。应避免使用 Taq酶, 因其在 PCR产
物 3#
末端添加一个突出 A ,从而造成移码。本研究
使用 Phusion超保真聚合酶, 具有 3#外切纠错功能,
可以保证嵌合序列的正确性。其次, 重叠延伸 PCR
为多重扩增,极易发生碱基错配。本研究在进行重
叠时不直接使用两端片段的上下引物扩增, 而是仿
照巢式 PCR的设计引物的方法以预计的重叠产物
为模板重新设计新的内引物,以防止引物错配发生,
试验表明使用内引物可有效的增加引物的特异性。
另外在进行所有的 PCR是除了使用保真度高的聚
合酶外,扩增的循环数不能太多,否则突变出现的可
能性就会增大。
本研究以重叠延伸 PCR技术构建的重构分子
为下一步构建一种新的甘丙肽过表达转基因动物模
型提供了甘丙肽表达载体中的结构基因, 为甘丙肽
生理病理功能的研究奠定了一定的试验基础。
参 考 文 献
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