全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
梅花鹿 FSHβ亚基基因克隆与融合表达
张建肖　关洪斌
(山东大学威海分校海洋学院 ,威海 264209)
　　摘 　要 : 　以原构建的克隆载体为模板 , PCR扩增梅花鹿 FSHβ亚基基因 , TA克隆后经双酶切插入表达载体 pGEX26P22,
阳性克隆导入 E. coli BL21, IPTG诱导表达 GST2FSHβ融合蛋白 , SDS2PAGE进行分析鉴定。结果显示 , FSHβ PCR产物大小约
410 bp,测序结果与 GenBank序列一致 ,成功构建了重组表达载体 pGEX26P222FSHβ,融合蛋白经 SDS2PAGE分析 ,在相对分子
量 39. 5 kD处 ,出现特异性蛋白条带 ,说明梅花鹿 FSHβ亚基基因片段已在 E. coli BL21中成功表达了 FSHβ2GST融合蛋白 ,融
合蛋白功能有待进一步分析。
关键词 : 　梅花鹿 FSHβ亚基 　基因克隆 　融合表达
Gene Clon ing and Fusion Expression of
Cervus n ippon FSHβ2subun it in E. coli
Zhang J ianxiao　Guan Hongbin
(M arine College of Shandong University, W eihai 264209)
　　Abs trac t: 　FSHβ2subunit gene segments were cloned by PCR, from the original constructed vector. Then the PCR p roduct was
TA cloned, sequenced and inserted into the carrier pGEX26P22. The recombinant p lasm idswere identified by restricted enzymes diges2
tion, and then the positive clones were transformed into E. coli BL21. GST2FSHβ fusion p roteins were exp ressed via the induction of
IPTG, and detected by SDS2PAGE. Results showed that the PCR p roduct was about 410 bp in size and sequencing result was identical
with GenBank’s report. The pGEX26P222FSHβ positive clone p roduced a 39. 5 kD fusion p rotein on SDS2PAGE gel, and the function of
which needs further study.
Key wo rds: 　FSHβ2subunit　Gene clone　Fusion exp ression
收稿日期 : 2009206208
基金项目 :山东省教育厅项目 (1070504430053)
作者简介 :张建肖 (19842) ,女 ,硕士生 ; E2mail: zhangjianxiao1985@ yahoo. com. cn
通讯作者 :关洪斌 (19612) ,男 ,博士 ,副教授 ; E2mail: guanhongbin@ sdu. edu. cn　　卵泡刺激素又叫促卵泡激素 ( follicle stimulatinghormone, FSH) ,是动物体内分泌的一种促性腺激素 ,在动物的繁殖中发挥作用 [ 1 ]。其分子量大约为30 kD,由可解离的α和β两亚基以非共价键结合 ,两亚基结合在一起引起结构的变化 , FSH才具有生物活性。β亚基由 109～115个氨基酸组成 [ 2, 3 ] ,在同一物种内α亚基是确定的 [ 4 ] ,β亚基不能互换 ,是激素生物活性和免疫活性的决定因素 ,一般认为β亚基是功能亚基 ,参与受体结构。后经研究发现 , α、β亚基均参加受体结合和信号传导作用 [ 5 ]。FSH在各种动物模型中均可诱导排卵 ,对动物和人类的繁殖起到了极大的推进作用。利用重组 DNA技术生产重组 FSH 已成为推动动物繁殖育种的有效手段 [ 6 ]。目前梅花鹿 FSH两亚基已分离并测序 [ 4 ] ,本实验室亦已构建成功梅花鹿 FSHα亚基的原核表达载体。本研究旨在构建梅花鹿 FSHβ亚基的原核表达载体 ,在大肠杆菌中大量表达 FSHβ蛋白 ,为进一步深入研究梅花鹿重组 FSH奠定基础 ,为重组梅花鹿 FSH尽早应用到梅花鹿的繁殖育种生产提供科学理论和试验依据 ,对提高养鹿业的生产能力与经济效益具有重要的学术价值和实际生产意义。1　材料与方法111　质粒与菌株大肠杆菌 BL21、载体质粒 pGEX26P22均购自
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
Amersham B iosciences公司 ,大肠杆菌 ( E. coli) JM 109
购自大连宝生物工程有限公司 ,含梅花鹿 FSHβ亚基
基因的载体源自关洪斌老师处。
112　试剂
PCR试剂、限制性内切酶 Xho I、EcoR I、胶回收
试剂盒、pMD182T、T4DNA连接酶、IPTG、DL2000 DNA
Marker和蛋白质分子量标准 (低 )均购自 TaKaRa (大
连 )有限公司 ; PCR引物由上海生工合成 ;其余化学试
剂均为国产分析纯。
113　pGEX26P222FSHβ原核表达系统的制备
11311　PCR扩增 FSHβ亚基 DNA序列 　根据 Gen2
Bank序列设计 FSHβ亚基上下游引物 ,两端引入
EcoR I和 X ho I限制性内切酶位点。
上游引物 : 5′2CCGGAATTCGGATGAAGTCCGT
CCAGTTC23′(5′端添加 EcoR I酶切位点 )
下游引物 : 5′2CCGCTCGAGTTATTCTCTGATGT2
CACTGA23′(5′端添加 X ho I酶切位点 )
FSHβ亚基 PCR扩增反应体系 : 10 ×PCR buffer
(Mg2 + ) 2. 5μl, dNTP 2. 0μl,上、下游引物各 1. 0μl,
模板 3. 0μl, ddH2O 15. 3μl, rTaq酶 0. 2μl,共 25μl。
模板为含梅花鹿 FSHβ亚基的原构建载体质粒 DNA。
PCR扩增反应程序 :预变性 94℃ 10 m in;之后进行
94℃30 s, 58℃45 s, 72℃30 s,共 35个循环 ; 72℃10
m in; 4℃保存。
11312　PCR产物回收、TA克隆 　将 PCR产物经胶
回收试剂盒回收纯化后 ,与 pMD182T载体按摩尔比
为 4∶1于 16℃连接 2 h,转化 E. coli JM109感受态
菌。随机挑取单菌落进行菌落 PCR鉴定 ,阳性者碱
裂解提取质粒 DNA ,酶切鉴定阳性菌送上海生工测
序。重组质粒命名为 pMD182T2FSHβ。
11313　重组质粒的构建和鉴定 　X ho I、EcoR I双
酶切 pMD182T2FSHβ和表达载体 pGEX26P22,胶回
收目的基因和载体片段 , T4 DNA连接酶作用下 ,连
接成 pGEX26P222FSHβ重组质粒 ,菌落 PCR和酶切
鉴定阳性者送上海生工测序。
114　重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
将 pGEX26P222FSHβ重组质粒和表达载体
pGEX26P22质粒分别转化入 BL21感受态菌。选取
重组菌落及空载体菌落分别接种于 LB液体培养基
(Amp + ) , 37℃振荡培养过夜后 ,按 1∶100转入新鲜
LB液体培养基 , 37℃振荡培养至 OD600值为 1. 0时 ,
加入终浓度为 1. 0 mmol/L 的 IPTG继续诱导培养
3 h。各取诱导前和诱导后菌液 2 m l, 12 000 r/m in离
心 5 m in,弃上清。分别按 ODX50、ODX40、ODX10加
入 PBS、2XSDS上样缓冲液和 DTT (μl计算 )重悬菌
体 , 100℃煮沸 5～10 m in, - 20℃保存 ,用于点样 [ 7 ]。
蛋白质标准分子量的处理按照说明书进行。
115　SDS2PAGE鉴定
制备 12%分离胶和 5%积层胶 ,上样量为 20～
25μl,电泳至溴酚蓝进入底层琼脂 ,终止。考马斯
亮蓝 R250染色 2 h,脱色液充分脱色 ,观察。
2　结果
211　重组质粒的筛选与鉴定
21111 　 PCR 扩增 FSHβ亚基 DNA 及 pMD182T2
FSHβ酶切分析　1. 2%琼脂糖对 FSHβ亚基 PCR产
物电泳 ,在 410 bp处出现目的条带 ,见图 1。pMD18
1. PCR产物经试剂盒纯化 ; 2. FSHβ亚 PCR扩增产物 ;
3. DL2000 DNA Marker
图 1　PCR扩增 FSHβ亚基 ,回收纯化
1. DL2000 DNA Marker; 2. pMD182T2FSHβ双酶切 ; 3. pMD182T2FSHβ
Xho I单酶切 ; 4. pMD182T2FSHβ EcoR I单酶切 ; 5. pMD182T2FSHβ
质粒 DNA
图 2　pMD182T2FSHβ质粒酶切鉴定
801
2009年第 9期 张建肖等 :梅花鹿 FSHβ亚基基因克隆与融合表达2T2FSHβ质粒经 X ho I、EcoR I单酶切、双酶切 ,电泳
显示双酶切得到 pMD182T载体条带和目的基因条
带 ,与预期值相符 ,见图 2。上海生工测序结果显
示 , PCR扩增 FSHβ亚基基因序列与 GenBank中的
序列 (AY156688)一致 ,并成功引入 X ho I、EcoR I酶
切位点。
21112　重组质粒 pGEX26P222FSHβ的酶切 　1. 2%
琼脂糖凝胶电泳显示 ,重组质粒 pGEX26P222FSHβ
经 X ho I、EcoR I分别单酶切出现一条大小约 5 000
bp以上条带 ;双酶切得到约 4. 9 kb和 410 bp条带 ,
片段大小与预期值相符 ,见图 3。生工测序结果显
示 FSHβ基因正向插入 GST下游 ,表明已成功构建
pGEX26P222FSHβ重组质粒 ,并已转化 JM109宿主
菌中。
1. DL2000 DNA Marker; 2. pGEX26P222FSHβ双酶切 ; 3. pGEX26P222
FSHβ Xho I单酶切 ; 4. pGEX26P222FSHβ EcoR I单酶切 ; 5. pGEX2
6P222FSHβ质粒 DNA
图 3　pGEX26P222FSHβ质粒酶切鉴定
1. 蛋白质分子量标准 (低 ) ; 2. pGEX26P22对照菌 IPTG诱导 ;
3. pGEX26P222FSHβ重组菌经 IPTG诱导 ; 4. pGEX26P222FSHβ
重组菌未经 IPTG诱导 ; 5. pGEX26P22对照菌未经 IPTG诱导
图 4　SD S2PAGE检测蛋白表达
212　重组 GST2FSHβ融合蛋白表达及 SDS2PAGE
鉴定
蛋白表达产物以包涵体形式存在 ,上清中无蛋
白条带。pGEX26P22对照菌在 26 kD处出现一条浓
染条带 ;重组 pGEX26P222FSHβ质粒在 39. 5 kD处呈
现特异性染色条带 , FSHβ表达多肽约为 13. 5 kD,
GST2FSHβ融合蛋白分子量大小与预期结果一致
(图 4)。
3　讨论
卵泡刺激素 ( FSH )是一种糖蛋白激素 ,主要的
生理作用是促进雌性动物子宫内膜生长、排卵、刺激
多卵泡发育及刺激雄性动物精子发生 ,超数排卵、卵
母细胞体外成熟和治疗人类相关生殖疾病 [ 8 ]。应
用重组 FSH 促超排卵 ,可获得足量的高质量卵
子 [ 9 ]。用基因工程方法大量生产高纯度的梅花鹿
FSH,应用于繁殖育种 ,在一定程度上可提高梅花鹿
的繁殖性能 ,降低生产成本 ,带来广泛的经济前景。
梅花鹿 FSHβ亚基基因是由 390个核苷酸组成 ,
编码 130个氨基酸 [ 10 ]。pGEX26P22载体带有 IPTG
诱导启动子 ,其所表达的蛋白产物在 N端带有 GST
序列 ,融合蛋白产物可通过 GST层析柱快速、简便
的纯化 [ 11 ]。本试验将梅花鹿 FSHβ亚基连入原核
表达载体 pGEX26P22,构建重组表达载体。在构建
的原核表达质粒中 ,多克隆位点位于 GST基因之
后 , FSHβ插入时 ,只需选择正确的阅读框架 ,就可以
表达出 GST融合蛋白 [ 12 ]。且其表达更接近于天然蛋
白 ,为进一步研究梅花鹿 FSH的功能奠定了基础。
目的基因预期表达蛋白相对分子质量约 13. 5 kD, GST
相对分子质量为 26 kD, SDS2PAGE结果显示出现融
合蛋白目的条带。此研究为梅花鹿 FSH完整蛋白
的制备、纯化和抗体制备奠定了基础。梅花鹿
FSHβ亚基的实验研究正在进行中。随着研究的不
断深入 ,相信重组梅花鹿卵泡刺激素的研究定会在
梅花鹿的繁殖、养殖中发挥重要作用。
参 考 文 献
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6: 693～697.
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基因的分子生物学 (第六版 ) (译 ) (含光盘 )
〔美 〕J. D. 沃森 T. A. 贝克 　S. P. 贝尔 　A. 甘恩 M. 莱文
R. M. 洛斯克 　编著 　杨焕明 　等译
97827203202575628　　  128. 00　　　　　2009年 7月出版
内容简介 :本书由 DNA双螺旋的发现者之一 ———James D. W atson及其他几位著名学者
在第五版的基础上修订完成。本书除了反映分子生物学领域的最新进展之外 ,还涉及其他诸
多方面的内容。此次修订仍保留了上一版中的许多定义和特点 ,而且新增了调控 RNA和基因
组分析以及系统生物学的内容。全书共分五篇 :化学和遗传学、基因组的维持、基因组的表达、
调控以及方法。
本书具有权威性 ,内容新颖、详尽 ,堪称此领域的经典之作。为广大的生物爱好者及研究
人员提供了分子生物学的知识框架和实验途径 ,并强调了基因科学对于整个生物领域的重要
意义。
表观遗传学 (译 )
〔美 〕C1D1A llis　〔德 〕T1Jenuwein　〔美 〕　D1Reinberg
〔美 〕M1Caparros　编著 　朱 　冰 　孙方霖 　主译
97827203202380621　　  98. 00　　　　　2009年 7月 　出版
内容简介 :生命是一个复杂的过程 ,有很多的例外情况 ,许多最关键的现象往往不能用已
有理论来解释。表观遗传学正是在这些例外的基础之上发展成型的。这些非 DNA变化但可
继承的现象与癌、衰老、动植物发育等热点问题密切相关 ,受到广泛关注。本书是表观遗传学
领域领军人物的扛鼎之作 ,是该领域第一本系统性、权威性论著 ,不仅涉及一线研究的方方面
面 ,还用专门章节讲述了表观遗传学的发展历程。通过本书 ,读者可以对这门新兴热点学科有
一个深入而完整的认识。
本书适宜于相关领域的研究人员参考之用 ,作为该领域的教学用书也是非常合适的。
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