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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
藏红花细胞悬浮培养体系的建立及优化
陈书安1，2 王晓东1 袁晓凡1 赵兵1 王玉春1
(1中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 100190;
2科技部中国生物技术发展中心，北京 100036)
摘 要: 基于诱导的藏红花细胞系，通过摇瓶法，优化了其液体培养基、接种量和种龄等培养条件，以建立藏红花细胞
悬浮培养体系。结果表明，将生长在固体培养基上的藏红花愈伤组织接种在 MS液体培养基(添加了 2 mg /L 2，4-D，1 mg /L 6-
BA和 300 mg /L CH)中，于(22 ± 0. 3)℃，120 r /min的摇床上，暗培养 30 d，便可获得藏红花的悬浮细胞系。经优化其培养基、
接种量和种龄，将种龄为 20 d的细胞系，按照 5%接种量接种在液体 B5 培养基(添加了 2 mg /L NAA，1 mg /L 6-BA和 300 mg /
L CH)中，于(22 ± 0. 3)℃，120 r /min的摇床上，培养 36 d，细胞生物量(13. 4 g /L)和藏红花素产量(0. 91 g /L)均达到最高。本
研究建立的藏红花细胞悬浮培养体系为其生物反应器放大培养奠定了基础。
关键词: 藏红花 悬浮 培养体系 摇瓶 生物反应器
Establishment and Optimization of Crocus sativus L． Cell
Suspension Culture System
Chen Shu-an1，2 Wang Xiaodong 1 Yuan Xiaofan Zhao Bing1 Wang Yuchun1
(1The State Key Laboratory of Biochemical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190;
2China National Center for Biotechnology Development，Beijing 100036)
Abstract: Based on the screened callus line，the liquid medium，inoculation size and cell age were optimized by shake-flask
culture to establish the cell suspension culture system of Crocus sativus L. cell． When callus was cultured in MS liquid medium
supplemented with 300 mg /L CH，1 mg /L 6-BA and 2. 0 mg /L 2，4-D on shaking bed at(22 ± 0. 3)℃ for 30 d，its suspension
cell could be obtained． The maximum biomass(13. 4 g /L)and crocin production(0. 91 g /L)reached when 20 d age cells were
cultured in B5 liquid medium supplemented with 300 mg /L CH，2 mg /L NAA and 1 mg /L 6-BA by 5% inoculation size． The
cell suspension culture system established in this research could provide references for the scale-up culture of Crocus sativus L. cell
by bioreactor．
Key words: Crocus sativus L． Suspension Culture system Shaking flask Bioreactor
收稿日期:2010-01-11
基金项目:国家“863”计划(2002AA241121)
作者简介:陈书安，男，博士，副研究员，研究方向:生化工程和微生物工程;E-mail:chenshu@ cncbd． org． cn
通讯作者:赵兵，研究员，博士生导师，E-mail:bzhao@ home． ipe． ac． cn;王玉春，研究员，博士生导师，E-mail:ycaang@ yathoo． com． cn
藏红花(Crocus sativus L．)是一种名贵的妇科良
药，又可用于功能食品和化妆品的开发，被誉为“植物
黄金”，其柱头还含有良好抗癌作用的藏红花素等活
性成分，有望成为最理想的抗癌药物之一［1 － 3］。但藏
红花主要是柱头入药，田间栽培过程易感染植物病
毒，产量极低，又因种植条件苛刻、适宜栽培的地区有
限，致使其资源短缺，价格昂贵［3，4］。通过植物细胞培
养体系生产藏红花素等，是解决藏红花资源短缺的有
效途径之一［3］。
为建立藏红花细胞培养体系，本实验室从诱导
的 229 株藏红花愈伤组织中筛选出一株藏红花素含
量较高、生长快速的细胞系［5，6］，经脱毒处理，该细
胞系无鸢尾花叶病毒等国内外报道的侵染藏红花的
病毒［7］;经二步法，建立了其固体培养体系［8］。为
通过生物反应器规模化培养藏红花细胞，须进一步
建立其悬浮培养体系。与和固体培养相比，液体悬
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浮培养有良好的流动性、更高的传质效率、便于规模
化应用等优点［9］。基于以往研究，本研究通过摇瓶
法，建立和优化藏红花细胞悬浮培养体系，为其生物
反应器培养提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
藏红花愈伤组织:球茎 1 细胞系，黄色，质地疏
松，不透明［5，6］。
1. 2 培养基
以 MS［10］和 B511］为基本培养基，添加 6-苄氨基
嘌呤(6-benzyladenine，6-BA) ，2 4 氯化苯氧乙酸(2，
4-dichlrophyenoxy acetic acid，2，4-D) ，a-萘乙酸(naph-
thaleneacetic acid，NAA) ，吲哚乙酸(indole-3-acetic
acid，IAA)和水解酪蛋白(casein hydrolysate，CH)等形
成如下培养基。M1培养基:添加 2 mg /L 2，4-D，0. 25
mg /L 6-BA和 300 mg /LCH的MS培养基，M1培养基
是在球茎 1细胞系的诱导培养基［5］中添加 300 mg /L
CH而形成。M2 培养基:添加 2 mg /L NAA，1 mg /L
6-BA和 300 mg /L CH的 B5 培养基，M2 培养基是通
过二步法建立的适宜细胞生长的培养基［8］。M3 培养
基:添加2 mg /L IAA，0. 5 mg /L 6-BA和 300 mg /L CH
的 B5培养基，M3培养基是通过二步法建立的适宜藏
红花素合成的培养基［8］。
1. 3 生物量的测定方法
将藏红花细胞悬浮培养液，经 3 500 r /min 离心
20 min，取离心沉淀的细胞置于烘箱，60℃烘干至恒
重，称得其干重即为生物量。
1. 4 藏红花素含量测定方法
将藏红花细胞悬浮培养液，经 3 500 r /min 离心
20 min，回收上清液;将离心沉淀的细胞用 20 mL
50%的甲醇在室温下振荡(100 r /min)提取 2 h后，经
3 500 r /min离心 20 min，回收上清液;将二次离心沉
淀的细胞再用 10 mL 50%的甲醇在室温下振荡(100
r /min)提取 1 h，3 500 r /min 离心 20 min，回收上清
液。合并上述 3次离心回收的上清液，经真空浓缩直
至 1 mL以下，膜过滤(0. 22 μm)后于 HPLC 测定。
藏红花素的检测色谱柱:Nucleosil C18(3. 9 mm
(150 mm，5 μm 粒度) ;紫外可见光检测器(波长范
围:190 － 800 nm) ;检测波长:440 nm;流动相:53%
甲醛溶液;流速:0. 7 mL /min，进样量:10 μL。
2 结果与分析
2. 1 藏红花悬浮培养细胞系的获得
松散的愈伤组织常常是植物细胞悬浮培养的适
宜材料，稍经机械振荡，即可使愈伤组织分散成单细
胞或由几个细胞组成的小细胞团，并在悬浮培养中
迅速增殖;而坚实愈伤组织中的细胞间被果胶质紧
紧地粘着，往往不能形成良好的悬浮系统。将 2 g
生长在 M1 固体培养基上的藏红花愈伤组织(黄色，
质地疏松，不透明)放入 20 mL M1 液体培养基中，
于(22 ± 0. 3)℃，120 r /min 的摇床上，暗培养 10 －
15 d，培养基经 100 目不锈钢滤网过滤，除去大的细
胞团，置于新鲜的培养基中继续培养 10 － 15 d;再次
过滤，再次置于新鲜的液体培养基中培养 10 － 15 d，
便可获得藏红花悬浮培养细胞系。
2. 2 不同培养基对藏红花悬浮细胞生长和藏红花
素累积的影响
植物细胞悬浮培养基的种类很多，但各种培养
基一般由无机盐、碳源、维生素、氨基酸、激素等 5 大
类成分构成，有时需要附加水解酪蛋白等复合有机
物;许多培养基以 MS、B5 等为基本培养基，添加
NAA、2，4-D、IAA 和 6-BA 等组成［12］。将生长 18 d
的细胞，按 2%的接种量，分别接种在装有 M1、M2
和 M3 液体培养基中，于(22 ± 0. 3)℃，120 r /min 的
摇床上，暗培养 36 d，藏红花细胞生长和藏红花素合
成情况见图 1 和图 2。
图 1 和图 2 显示，在 M2 中悬浮培养，藏红花最
高生物量和藏红花素最高产量均比在 M1 和 M3 中
高。在 M2 中培养 20 d，细胞生物量达到 4. 9 g /L;
培养 28 d，藏红花素产量达到 0. 28 g /L，因此以下悬
浮培养的优化研究均以 M2 为培养基。
图 1 培养基对悬浮细胞生长的影响
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2010 年第 7 期 陈书安等:藏红花细胞悬浮培养体系的建立及优化
图 2 培养基对悬浮细胞藏红花素产量的影响
2. 3 接种量对藏红花细胞悬浮生长和藏红花素累
积的影响
植物细胞在悬浮培养过程中具有群聚效应，细胞
密度太低，细胞生长缓慢;细胞密度过高，细胞生长速
度过快，细胞液泡变大，容易积累有害物质，不利于悬
浮细胞系的生长和次生代谢产物的合成［9，12］。将生
长 18 d的细胞，按1% －8%的接种量接入M2培养基
中，于(22 ±0. 3)℃，120 r /min的摇床上，藏红花悬浮
细胞生长和藏红花素合成情况见图 3和图 4。
图 3 接种量对悬浮细胞生长的影响
图 4 接种量对悬浮细胞藏红花素产量的影响
图 3 表明，接种量对于细胞生长影响较大。随
着接种量的增加，细胞的生长得到明显促进，当接种
量为 1%，细胞最高生物量仅为 3. 3 g /L;当接种量
增加至 5%，培养 20 d 后，细胞生物量达到 13 g /L，
继续增加接种量，细胞生物量没有明显提高。图 4
表明，接种量对藏红花素产量影响也较大。接种量
低于 5%时，随着接种量的增加，藏红花素产量得到
明显提高;当接种量为 5%，培养 28 d 后，藏红花素
产量达到 0. 88 g /L;当接种量继续增至 6% － 8%
时，藏红花素产量没有增加。因此，无论为了促进细
胞生长，还是提高藏红花素产量，均以 5%的接种量
最佳。
2. 4 种龄对藏红花细胞悬浮生长和藏红花素累积
的影响
处于不同生长时期的细胞，其生理状况不同，细
胞内的代谢活动情况有较大的差别，因此会对细胞
生长和次生代谢产物的合成均有影响［9］。选择不
同种龄的细胞，按 5%的接种量接入 M2 培养基，于
(22 ± 0. 3)℃，120 r /min 的摇床上，暗培养 28 d，20
d时藏红花细胞生物量和 28 d 时藏红花素产量
见图 5。
图 5 种龄对悬浮细胞生长和藏红花素产量的影响
图 5 表明，适宜的种龄是促进藏红花细胞生长
和藏红花素合成的关键因素。细胞种龄小于 8 d
时，细胞生物量和藏红花素产量均较低;当种龄为
20 d时，细胞生物量达到最高，为 13. 4 g /L，藏红花
素产量也达到最高，为 0. 91 g /L;当种龄超过 28 d
时，藏红花细胞生物量和藏红花素产量均呈下降趋
势，因此悬浮培养时，选择种龄为 20 d的细胞最佳。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
3 讨论
植物悬浮细胞具有良好的分散性、均一性、生长
迅速等特点，已经被广泛地应用到生理学、细胞学、
发育学、生物化学以及分子生物学等领域;同时，悬
浮细胞为植物从细胞水平上进行遗传操作提供了理
想的材料，如快速筛选突变体、分离原生质体、杂交
细胞、转基因、调控次生代谢产物等［13 － 16］。建立一
个稳定的细胞悬浮系主要取决于所诱导的愈伤组
织，一般能建立悬浮系的愈伤组织表现生长旺盛，质
地松散，呈浅黄色［12］。本实验室获得的愈伤组织质
地疏松，不透明，生长快速［5，6］，易建立其悬浮培养
体系。
为通过药用植物细胞悬浮培养体系生产其次生
代谢产物等药用成分，必须优化其悬浮培养体系，其
中所选择的基本培养基、激素、水解酪蛋白、种龄和
接种量等培养条件均影响细胞的悬浮生长和次生代
谢产物的合成［17，18］。本研究通过优化藏红花细胞
的悬浮培养基、种龄、接种量等，建立了其摇瓶悬浮
培养体系，下一步将围绕其悬浮培养生长动力学、藏
红花素合成动力学、生物反应器优化、藏红花素的规
模化分离与纯化等方面开展研究工作，以通过生物
反应器规模化生产藏红花素，解决藏红花资源短缺
问题。
参 考 文 献
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