全 文 ：收稿日期:2007-11-02
基金项目:四川省应用基础研究项目(No.2006J13-169)
作者简介:吴明霞(1979-),女,研究生,研究方向:微生物代谢调控
透明质酸(HyaluronicAcidHA)又名玻璃酸,是
一种大分子酸性粘多糖,广泛地存在于生物体的结
缔组织中,由 Meyer和 Palmer[1]于 1934年首先从牛
眼玻璃体中分离出来。20世纪 60~70年代 Balazs
首先将 HA用于眼科手术并获得理想的疗效后,其
应用研究得到飞速的发展。20世纪 80年代中期
HA被应用于化妆品,1987年又作为关节炎治疗药
上市,近年来作为药物载体和组织工程材料而广泛
应用[2]。随着其在化妆品和医药方面应用研究的不
断开发,HA必将作为一种新的重要生化药物,日益
受到国内外的高度重视。
1 透明质酸的分布及生理作用
HA广泛存在于动物的各种组织间质中,如皮
肤、脐带、眼玻璃体、鸡冠、关节滑液、软骨、卵细胞
和血管壁等,其中以人脐带、鸡冠、关节滑液和玻璃
体 含 量 较 高 。 另 外 , 透 明 质 酸 也 是 链 球 菌
(Streptococcus)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)等
菌株荚膜的主要成份。虽然不同来源获得的 HA分
子量不同,它们之间却无种属差异,而且对人及动
物无抗原性[3]。
HA的生理作用随着其所在组织的不同而变
化,如在皮肤中主要表现为保水作用,在关节滑液
中主要为润滑作用,在血管壁中主要调节通透性。
HA作为聚阴离子电解质,由于分子上所带的大量
负电荷可调节周围正负离子的浓度,抑制多种酶的
活性[4]。
2 透明质酸的理化特性
HA是由相同的二糖单体重复排列而形成的无
透明质酸制备的研究进展
吴明霞 邓静 吴华昌 陈艺德
(四川理工学院生物工程系,自贡 643000)
摘 要: 透明质酸(Hyaluronicacid简称HA)是一种国际上公认的生物大分子保湿剂,用于眼科显微手术、关节炎
治疗、高级化妆品等领域。目前,透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。细菌发酵法生产透明质
酸具有产量不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量,分离纯化工艺简便,易于大规模生产等特点成为
透明质酸生产的发展方向,应当进一步深入研究。综述了透明质酸的化学结构、理化性质、应用及生产方法等方面的研究
现状,并预测了其以后发展趋势。
关键词: 透明质酸 制备 发酵 发展 诱变 优化 提取
ReviewofPreparationofHyaluronicAcid
WuMingxia DengJing WuHuachang ChenYide
(DepartmentofBioengineering,SichuanUniversityofScience&Engineering,Zigong643000)
Abstract: Hyaluronic (HA)isahugebiologicalmolecularwhichiswidelyregardedasagoodagenttopreserve
moisturewhichusedinvariousfieldssuchasophthalmicsurgery,treatmentofinflamedkneejoints,cosmeticusesetc.
Today,traditionalhyaluronicacidproducingmethodbyextractionofanimaltisueshasbeguntoturntomicrobialroute.
Becauseofsuficientsources,lowcost,highoutput,relativelyhighmolecularweighandeasypurification,hyaluronicacid
bybacterialfermentationshouldbepaidmoreatentionandstudiedfurther.Thepaperstatedthatthestudyonchemical
structure,physicalandchemicalnature,applicationandproductiontechnologyofHA athomeandabroad,andits
developmenttrendwasalsoforecasted.
Keywords: Hyaluronicacid Preparation Fermentation DevelopmentScreening Optimum Separation
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
2008年第2期
支链的直链多聚物,其中每个二糖单体由一个 N—
乙酰氨基葡萄糖(Glc-Nac)以 β-1,3糖苷键与葡萄
糖醛酸(GIcA)交替连接而成,二糖单位间以 β-1,4
糖苷键连接。透明质酸的相对分子量约为 106～107,
分子中含有 200～10000个双糖。电子显微镜下观
察证实 HA为一线性单链,分子量为 4×106,链长约
为 10μm。由于直链链轴上单糖之间氢键的作用,
HA分子在空间呈刚性的螺旋柱型,其半径为
200nm,柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性。在
溶液中 HA结合的水分可达其本身重量的 1000
倍,且这些水在螺旋柱内固定不动,不易流失[5]。
HA水溶液是一种非牛顿型流体,有着良好的
粘弹性和应变性。一般来说,溶液浓度和分子量的
增加会使溶液粘度增加。低浓度的 HA溶液主要表
现为粘性,而高浓度溶液则主要显示其弹性[6]。
3 透明质酸的制备方法
3.1 动物组织提取法
国内目前有十几家透明质酸的生产厂家,且这
些企业大都是用动物组织提取法。如山东福瑞达公
司、山东东营东辰集团公司、上海聚源生物科技公
司、广州申强化工有限公司、浙江瑞邦制药厂、江苏
无锡柯兰精细化学制品厂、重庆团结生化制品有限
公司、江苏吴江振兴生物制品厂、杭州嘉伟生物制
品有限公司等。从动物组织中提取 HA常用的原料
有鸡冠、脐带和猪皮等,主要工艺过程包括脱水、磨
碎、浸泡、提取、除杂、沉淀和分离。这种方法的特点
是工艺流程简单,适用于原料来源分散的小规模生
产。但由于原料有限,且原料中 HA的含量低,同时
HA又还与硫酸软骨素等粘多糖共存于生物组织
中,致使其收率低、提纯难、成本过高、产品质量差,
且难以应用于大规模生产。随着 HA需求量的不断
增大,迫切要求生产大量的高质量 HA,动物组织提
取法己不能适应这种要求,需要有新的方法来替代
它。
3.2 酶聚人工合成法
通过研究表明,在生物体内 HA是通过透明质
酸合成酶催化 UDP-G1cA和 UDP-G1cNAc合成[7]。
因此,近年有学者尝试在体外以酶法合成 HA,并取
得一些进展。小林四郎等[8]利用单体酶催化在体外
聚合合成透明质酸,首先使用多糖类聚合物合成透
明质酸氧氮杂环戊烯衍生物,然后添加透明质酸分
解酶制造出衍生物和酶的复合体,接着在 90℃反应
液中清除其中的酶合成透明质酸,然后再对其进行
沉淀、分离即可得到透明质酸精品。凌敏等[9]根据从
Streptococcusequi扩增出透明质酸合成酶(sqHAS)基
因,构建表达质粒 pSE-sqHAS并转化大肠杆菌
DHSa,诱导培养后在细胞膜中检测到 sqHAS蛋白
及活性。利用携带该酶的细胞膜以 UDP-G1cA和
UDP-G1cNAc为底物在体外合成了分子量为 3.6×
106Da的 HA,分别是发酵法生产和提取法生产的
HA的分子量的 2.5倍和 5倍左右。但是 HA体外
合成的前体物质价格昂贵,难于应用于实际工业化
生产中,因此这种方法仅适用于生产高分子量、高
纯度具有特殊用途的 HA。
3.3 微生物发酵法
利用细菌发酵法生产 HA的研究主要是集中
在日本,英美等国也有少量报道。20世纪 90年代
以来,对由细菌发酵法生产 HA的报道增多。日本
近几年用发酵法生产了 HA制剂,并对该产品做了
大量的药效、毒理、药代动力学等非临床实验和临
床实验。结果表明,发酵法生产的 HA无局部及全
身毒副作用、安全性高、疗效确切。发酵法生产的
HA由于生产成本低、相对分子量高、疗效好,因此
具有很好的应用前景。
1937年,Kendal[10]等首次发现链球菌可以制备
HA,随后很多人进行了大量的研究。研究结果证明
某些种属链球菌在一定的环境条件下,能同化吸收
葡萄糖或其他碳源,同时以代谢物形式产生 HA。发
酵法生产 HA的质量主要取决于菌种、培养基和分
离提纯工艺。
3.3.1 透明质酸生产菌株的选育 野生型的链球
菌作为 HA产生菌,首先要经过诱变使其成为溶血
素和透明质酸酶缺陷型菌株。链球菌多会产生溶血
素(Streptolysin),溶血素有溶解红细胞、杀死白细胞
和毒害心脏的作用。溶血素混入成品 HA,还会使
HA的品质降低,不能用于医药品和化妆品,所以规
模生产必须获得非溶血性的菌株。邓开野[11]从血琼
脂平板上筛选出一株不具有溶血性的突变菌株,其
性能比原始菌株有很大提高。野生型的产生 HA的
链球菌在产生透明质酸的同时产生透明质酸酶,透
吴明霞等:透明质酸制备的研究进展 69
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
明质酸酶可将透明质酸降解或低分子量化,因此透
明质酸酶的产生对 HA的发酵非常不利。虽可采用
在发酵培养集中添加透明质酸酶的抑制剂,如藻酸
硫酸盐等的方式来提高 HA的产量。但现在发酵生
产上所采用的菌种,一般都是经诱变处理得到的透
明质酸酶的缺陷型。冯建成[12]对马疫链球菌 SH-0
进行诱变,筛选出溶血素和透明质酸酶双缺陷型突
变菌株 SH-2,使透明质酸产量提高 5倍。
诱变菌种的目的是为了获得 HA产量高、优良
性状稳定的菌株。孙建[13]通过紫外线和 NTG复合
诱变处理得到溶血性弱的菌株,突变菌株比出发菌
株透明质酸产量提高 1倍以上。张淑荣等[14]利用物
理方法紫外线,γ射线及辅助磁场筛选诱变兽疫链
球菌,研究获得性状优良,产量相对稳定的透明质酸
高产菌种,透明质酸产量可稳定在3～5g/L。罗强[15]采
用 NTG诱变原生质体,选育了一株产透明质酸的兽
疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)H235。本实
验室采用对环境污染性较小的硫酸二乙酯作为化
学诱变剂,选育一株兽疫链球菌诱变菌株,其产量
相对于原始菌株提高了 13%。实验表明硫酸二乙酯
作为化学诱变剂对兽疫链球菌的诱变作用不明显,
这可能与兽疫链球菌的作用位点有关。化学诱变剂
污染环境、操作不安全,因此较为安全的物理诱变
方法越来越受到人们的关注,但诱变剂量的大小以
及突变后菌株的回复突变是采用物理诱变剂所需
进一步研究的工作。目前,HA产生菌的诱变方法
多为紫外线照射和化学诱变剂等常规方法,本实验
室使用微波诱变、超声波诱变及微波-超声波复合
诱变的方法选育出高产菌株,其诱变菌株比原始菌
株透明质酸产量高出 61%,且该菌种经 5次传代后
透明质酸产量稳定,实验证明该诱变选育方法具有
一定的研究价值。另外,郝宁[16]等运用基因诱变育
种将 vgb基因导入兽疫链球菌以促进细胞在低氧
状态下的生长,同时 HA合成基因的导入将增加
HA合成途径的前体供应,使 HA产量增加 31%。此
法生产的 HA相对分子质量相对均一、分散性小,
由于 2个前体物 UDP-N-乙酰氨基葡糖和 UDP-葡
萄糖醛酸价格昂贵。因此,此法生产 HA成本高,目
前只用于实验室中。
3.3.2 透明质酸发酵条件的优化 链球菌的营养
需求较为苛刻,通常在含血清、脑心浸液等培养基
上菌体才能较好地生长,但这类营养物质价格昂
贵,大规模生产成本太高,所以通常以蛋白胨、酵母
膏或浸出粉、牛肉浸膏等的复合氮源代替。另外,有
研究表明在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨
酸,可以提高 HA的产率。国内外文献资料大多使
用葡萄糖作为碳源,也有用蔗糖、半乳糖等研究链
球菌的利用情况,姚敏杰等[17]以不同碳源进行对比
实验,发现只有蔗糖不能被利用,而高海军[18]等发
现蔗糖仅比葡萄糖利用率低。考察兽疫链球菌对于
常用碳源的利用情况,发现可溶性淀粉作碳源其菌
体量和透明质酸产量较大;其次,才为葡萄糖和蔗
糖。产生如此大的差异的原因是因为菌种的差异
还是方法所造成的仍需要深入的研究。氮源不仅
为菌体生长氮元素,而且大多数有机氮源还能提
供多种生长因子。国外有报道用化学合成培养基
(Chemicaldefinedmedia)与酵母粉为复合氮源培养
基比较,发现在化学合成培养基中兽疫链球菌生长
速率降低,而 HA产率系数和比合成率却与复合氮
源中的类似。国内大多采用有机物作为氮源,包括
胨、酵母膏、大豆水解物等。不同的菌株对于氮源利
用情况相差也较大,高海军[19]等发现酵母膏作为单
一氮源时,HA产量及菌体量均较高,其次为酵母膏
与蛋白胨的混合氮源以及玉米浆。安海平[20]等发现
对于马链球菌 N2506,蛋白胨与酵母膏以 1:1比例
效果最好,无机氮源对 HA发酵过程作用不大。本
实验室考察了链球菌对于多种无机氮源和有机氮
源的利用情况,发现菌株对于无机氮源如硫酸铵、
尿素等几乎不利用,而复合有机碳源明显好于单一
有机碳源,其中当酵母膏、蛋白胨、牛肉膏体积比为
1:1:1时 效 果 最 好 。无 机 盐 中 一 般 以 NaHCO3,
KH2PO4,MgSO4最为常用,碳酸氢盐的作用可能是使
兽疫链球菌发酵过程维持环境一定的 CO2浓度,相
当于起到缓冲作用;而磷酸氢盐为其间磷酸稀醇式
丙酮酸转变提供了物质基础。
在摇瓶和种子罐培养阶段,温度一般控制在
37℃,也有的采用 35℃或 33℃等较低的温度,或在
不同的阶段采用不同的温度。在种子培养阶段和发
酵的初期,37℃培养可使菌体较快的生长繁殖,发
酵中期和后期可适当改变温度。据报道通过变温可
70
2008年第2期
使葡萄糖的代谢方向由合成菌体细胞壁转向合成
HA从而可以提高 HA的产率。本实验室考察分阶
段控温工艺对兽疫链球菌的影响,发现菌种的最适
生长温度与最适产酸温度不一致。通过考察菌种的
生长曲线和不同工艺对 HA的影响,初步确定分阶
段控温工艺,使该菌种 HA产量有一定程度的提
高。
链球菌是一种乳酸菌,产生乳酸、乙酸等小分
子有机酸,发酵过程中需要用碱液进行中和,以维
持适当的 pH值。在 HA的发酵过程中,pH值一般
控制在 7.0左右,低于 5.5或高于 8.5菌体都不再
生长。M.R.Johns等[21]发现以 Streptococcuszooepi
demicus生产 HA在不通气的情况下,6.7±0.2为其
较适 pH值。本实验室考察兽疫链球菌在好氧的条
件下,最适生长 pH值为 7.2,最适产酸 pH值为
7.5。因此以后的实验可在发酵罐可通过分阶段控
制 pH值提高透明质酸产量。
Ogrodowski等[22]发现添加溶菌酶能够提高透明
质酸的产量,这是因为透明质酸生产菌需分泌大量
的透明质酸以保护其细胞壁免遭破坏;同时,溶菌
酶能诱导透明质酸合成酶的活性。在发酵过程中添
加含有羟基的酚类化合物如苯酚、丹宁等能大幅提
高透明质酸的产量;此外葡糖胺、丙酮酸、尿嘧啶等
因为是 HA合成的前体物质,通过添加也可获得高
分子量的 HA[23]。孟庆繁[24]添加十二烷基硫酸钠
(SDS)能够大幅度提高 HA产量。这是因为菌体在
产生 HA的同时会产生 HA酶,该酶可以使 HA分
解,导致 HA产量下降。而 SDS作为 HA酶活性抑制
剂,保护 HA不被降解。
3.3.3 透明质酸的提取 发酵法之所以没有得
到广泛应用其原因是多方面的,其中对发酵液中
HA产物的提取工艺不成熟是一个重要方面。具体
表现在缺少一条被广泛认可和接受的可用于工业
生产的下游分离工艺。分离纯化发酵液中的 HA有
多种报道,如有机溶剂沉淀法、离子交换法等。沉淀
HA的有机溶剂有乙醇、丙酮、乙酸等,有机溶剂的
作用是通过降低水溶液的介电常数从而增加溶质
分子异性电荷库仑力的引力达到沉淀的目的。乙醇
沉淀法是制备粘多糖中最常见的一种,链球菌 HA
的分离目前也多采用此法。为了使 HA完全沉淀溶
液中应有足够的离子强度。乙醇所沉淀的 HA浓度
约在 1%～2%之间,如果乙醇的用量足够大的话,
HA浓度小至 0.1%也可基本沉淀完全。目前报道中
多采用 3倍于液体体积的乙醇量沉淀,也有报道用
量 1～2倍[25]的。乙醇分级分离的缺点在于其分辨率
低,即一组很相似的多种成分以及它们个体的不均
一性如分子量、硫酸化程度、糖醛酸含量的差别不
能达到完全分离。1973年 LeeSheng-san[26]提出一套
改进的工艺,即用季铵盐分离 HA和其它粘多糖。
粘多糖是一类高分子物质,含有大量酸性基团,在
溶液中以聚阴离子形式存在,与碱性表面活性剂如
溴化十六烷基三甲铵(CTAB)及氯化十六烷基吡啶
(CPC)等可形成水溶性极小的季铵络合物。此外,
纯化 HA还有许多方法:Cifoneli[27]用活性炭和纤维
素粉末混合制成吸附柱,让经乙醇析出的 HA粗品
反复通过吸附以除蛋白杂质;Warvenn[28]采用丙酮浓
缩、冰醋酸和乙醇析出法;Thonard[29]等先用(NH4)2SO4
除蛋白后,将(NH4)2SO4浓度增至 65%通过盐析作用
沉淀出 HA粗品,用氯仿一丁醇混合液洗涤,1～5
倍体积乙醇(含 2.5%乙酸和 5%乙酸钠)沉淀 HA;
黄日农[30]等提出用硅藻土和活性炭来吸附微生物
细胞等杂质和脱除溶液颜色,过滤分离后用乙醇
沉淀,真空干燥;Cazzola[31]等则主张用孔径为 0.1～
10μm滤纸预先过滤,后用孔径为 0.45μm的过滤
器微过滤,进一步除去细菌,用蒸馏水透析培养基,
将所得浓化溶液冷冻干燥;Polistefano[32]使经粗过滤
后的液体先后分别流经阳离子交换树脂床和阴离
子交换树脂床,发现:任何分子量的 HA都不留在
树脂上,而不改变其他条件地通过二树脂床,杂质
则吸附在树脂床上,所得液体直接冷冻干燥减压干
燥可得纯度 98%以上的 HA。这些方法多是从动物
组织提取 HA的方法借鉴来的,但由于发酵法生产
HA有其自身的特点如发酵液体积大,且其中含有
大量的菌体及其代谢物等,这就决定了从发酵液中
分离 HA的处理量和复杂程度要比组织提取法大
的多,完全照搬组织提取的方法是不可行的,必须
根据发酵法的具体情况设计出一条新的工艺路线。
对发酵法生产 HA进行分析可以知道:从发酵液中
提取 HA首先要解决发酵液中有大量菌体的问题,
这些菌体可以分泌一种可解离 HA的透明质酸酶,
吴明霞等:透明质酸制备的研究进展 71
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
使 HA分子量降低,从而影响到 HA产品的质量,
所用进行下游分离纯化时,必须尽快杀灭和除去发
酵液中的菌体,并使酶失活,所以必须经过预处理
步骤。其次,发酵液中的 HA含量高、分子量大,所
以发酵液的粘度很高,这就给分离的过程带来许多
不便,如不能用离心法除菌体,收率会因 HA的吸
附而降低等。最后,由于对 HA产品分子量有十分
严格的要求,而 HA易因酸、碱或加热处理而分解
或在铁、铜等金属离子和抗坏血酸或半胱氨酸等还
原剂共存下,经氧自由基、x射线、Y射线、紫外线
和超声波作用而降解。因此,工业生长应从发酵法
自身特点出发,寻求适宜的提取方法。
4 展望
国外自 20世纪 70年代开始研究利用发酵法
生产 HA。日本资生堂在 20世纪 80年代后期实现
了发酵法生产 HA的工业化,并将 HA成功应用于
其生产的各种化妆品中,至今国际上发酵水平已达
到 6～7g/L。我国的 HA年产量在 2t左右,山东福瑞
达等几家己开始通过发酵法生产 HA,但总体规模
较小,还远远不能满足市场的需求。因此我们必须
从各个方面改进发酵法生产 HA,使之达到广泛化、
工业化。
4.1 诱变选育
如果直接用野生菌发酵,发酵液中会有一定量
HA,但含量极低,一般情况下不会超过 2g/L,得到
的 HA分子量也很低,因此必须经过诱变、筛选等
手段选育出高产菌株。而现阶段报道多以紫外诱变
和化学诱变为主,应从其它多种育种方法着手,以
期得到稳定的高产菌株。
4.2 提取纯化
提取的工艺路线应从发酵生产的具体情况分
析,找出其最佳方法。
4.3 基因构建
通过研究链球菌制 HA的代谢过程,完成基因
工程菌株的构建,为其产业化奠定基础。
参考 文献
1 MeyerK,PalmerJW.JBiolChem,1934,107:629~634.
2 凌沛学.透明质酸.北京:中国轻工业出版社,2000.
3 YamadaT,KawasakiT.JBioSicBioeng,2005,99(6):521~528.
4 朱广华,方熠平.中国医药工业杂志,1996,27(8):382~385.
5 FouissacE,MilasM,RinaudoM.AMacromolecules,1993,26:6945~
6951.
6 洪水声,陈佳,滕利荣,等.高等学校化学学报,2004,25(5):853~857.
7 ValarieL,BruceA.JBiolchem,1999,274:4239~4245.
8 小林四郎.触媒,2004,46(5):344~350.
9 凌敏,黄日波,黄鲲,等.工业微生物,2003,33(2):4~8.
10 KendalFE,HeidelbergerM.JBiolChem,1937,118(1):61~69.
11 邓开野,于雷,任露泉,等.吉林大学学报,2005,35(2):210~213.
12 冯建成,崔贞华,尹姣,等.湖北大学学报,2005,27(1):57~60.
13 孙建,霍向东,张志东.新疆农业科学,2006,43(1):72~74.
14 张淑荣,许伟坚,张鹏,等.北京化工大学学报,1999,26(1):1~4.
15 罗强,孙启玲.四川大学学报,2003,40(5):949~952.
16 郝宁,张晋宇,陈国强.中国生物工程杂志,2005,25(6):56~60.
17 姚敏杰,安海平,陈玉铭.江苏食品与发酵,1995,2:19~25.
18 高海军,陈坚,管轶众,等.无锡轻工业大学学报,1999,18(3):
17~22.
19 高海军,陈坚,章燕芳,等.生物工程学报,2000,16(3):396~399.
20 安海平,姚敏杰,陈玉铭,等.江苏食品与分酵,1995,(1):1~4.
21 JohnsMR,GohLT,OeggerliA.BiotechLet,1994,15(5):507~512.
22 OgrodowskiCS,HokkaCO,SantanaMH.AppBiochemBiotechno-
logy,2005,121:753~761.
23 StangohlS.USPatent:6537795,2003.
24 孟庆繁,滕利荣,洪水声,等.吉林大学学报,2004,42(1):121~125.
25 殷晓煌,李洪.中国生化药物杂志,1993,3(1):58~61.
26 LeeSheng-San.JMed,1973,19(64):25~32.
27 CifoneliJA.BiochemBiophysActa,1957,24:397~399.
28 WarenGH,GrayJ.PrasocAptBioMed,1959,256.
29 ThonardJC,etal.JBiochem,1964,239(3):26~29.
30 黄日波,CN1102435,1995.
31 Cozzola,etal.W095/04132,1995.
32 PoliStefano,etal.EP0694616,1996.
72