全 文 ：收稿日期:2007-10-08
基金项目:国家自然科学基金项目(30670163);教育部留学回国人员科研启动基金(2005-55);本研究获云南省中青年学术与技术带头人培养
费(2004PY01-5);昆明理工大学人才培养费联合资助
作者简介:马莉(1982-),女,湖北宜昌人,硕士研究生;E-mail:marypao@21cn.com
通讯作者:陈丽梅,教授,E-mail:chenlimeikm@yahoo.com.cn
SHMT(E.C.2.1.2.1)普遍存在于很多的原核生
物和真核生物中,在亚甲基四氢叶酸(CH2-THF)存
在时 SHMT催化甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)可逆性
相互转换产生 N5,N10-亚甲基四氢叶酸 (Ser+THF←→
Gly+CH2-THF),该反应伴随着一碳(C1)单位的产
生和消耗,包含 C1单位的反应对所有的生物都很
重要[1]。SHMT在高等植物的一碳代谢和光呼吸中
起着非常重要的作用,在植物中的主要功能是在蛋
白质和嘌呤的生物合成中提供 Gly,并为 C1库提
供 N5,N10-亚甲基四氢叶酸[2]。植物如果缺少 SHMT,
通常会导致严重的生长延迟。
在结构上,来源于哺乳动物的 SHMT是一个由
分子量大概为 53kDa含有 1个 PLP的亚基构成的
同型四聚体,但是来自 Escherichiacoli以及许多其
他细菌的 SHMT都是二聚体,研究结果说明动物和
微生物的 SHMT都具有变构调控功能[3]。从植物中
纯化出来的 SHMT也是同型四聚体,研究结果显
示有些植物的 SHMT也具有变构调控作用[4]。由于
SHMT在植物中有多种重要而又普遍的生理功能,
因此目前围绕它研究越来越多,主要对植物 SHMT
基因的克隆和表达调控方面的研究进展进行综述。
1 SHMT基因的克隆与结构
1.1 微生物 SHMT基因的克隆
在原核生物中,由单基因编码 SHMT的功能,
植物丝氨酸羟甲基转移酶基因研究进展
马莉 陈丽梅
(昆明理工大学生物工程技术研究中心,昆明 650224)
摘 要: 丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)是一个含有磷酸吡哆醛(PLP)的四聚体的蛋白质,在亚甲基四氢叶酸
(CH2-THF)存在时催化丝氨酸和四氢叶酸生成甘氨酸和N5,N10-亚甲基四氢叶酸的可逆反应。SHMT在高等植物的一
碳代谢和光呼吸中起着非常重要的作用,最近随着植物SHMT纯化技术的进步和重要模式植物基因组测序的完工,使很
多植物SHMT基因被克隆出来,并对它们的结构和功能及表达调控进行研究。
关键词: 丝氨酸羟甲基转移酶 基因克隆 光呼吸 基因表达调控
TheResearchAdvancesonSerineHydroxymethyltransferase
GeneinPlants
MaLiChenLimei
(BiotechnologyResearchCenter,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming,650224)
Abstract: Serinehydroxymethyltransferase (SHMT),atetramercontainingpyridoxal-5-phosphate,catalysesthe
reversibleconversionofserineandTHFtoglycineandN5,N10-methleneTHFinthepresenceofCH2-THF.SHMT
playsimportantrolesinone-carbonmetabolism andphotorespirationinhigherplants.AstheprogresesinplantSHMT
purificationandthecompletionoftheimportantmodeplantgenomesequencing,manyplantSHMT encodinggenes
werecloned.Moreover,thestructures,functionsandexpresionregulationsofthesegeneswerestudied.Inthisreview,
theadvancesonplantSHMTgenesweredescribed.
Keywords: Serinehydroxymethyltransferase Genecloning Photorespiration Geneexpresionregulation
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
在动物和真菌中,由不同的核基因编码两种异构型
的 SHMT。现在 GENE-BANK数据库中已收录了 35
种以上的 SHMT序列,人的细胞质型和线粒体型同
工 SHMT的 cDNA均被克隆出来。此外,也克隆到原
核生物和粗糙脉孢霉 (Nerosporacrassa)的 SHMT
(GlyA)基因[5],确定了兔肝脏,Salmonelatyphimurium,
Bacilusstearothermophilus,大肠杆菌,大豆根瘤菌及
Campilobact-erjejuni的 SHMT的一级结构。从大肠杆
菌 AB90054菌 株 中 克 隆 到 编 码 SHMT的 基 因
(glyA)全长 1254bp,编码 417个氨基酸。从甲基营
养型细菌 HyphomicrobiummethylovorumGM2中分
离到的 SHMT基因编码一个由 434个氨基酸组成
的蛋白质,该酶的氨基酸序列与大肠杆菌(55%)和
兔肝(44%)中的酶有较高的同源性[5],这说明甲基
营养型细菌 SHMT拥有其他物种中的 SHMT的同
源结构。
1.2 豌豆 SHMT基因 cDNA的克隆
用纯化的豌豆线粒体 SHMT制备抗体筛选豌
豆叶片 cDNA表达文库,分离到一个阳性克隆,其
序列包含一个开放阅读框,它编码的序列与成熟
SHMT蛋白 N端氨基酸序列测定的结果一致。开放
阅读框编码 487氨基酸的成熟蛋白,分子量(Mr)为
54000,还有一个富含 Ser的 27~31氨基酸的引导
序列,可能与线粒体定位有关。cDNA可以和一个
小的多基因家族中的 2~3个基因杂交,这几个基因
在叶子中的表达水平很高。把推测到的氨基酸序列
与兔线粒体、胞质 SHMT氨基酸序列进行对比说明
豌豆线粒体 SHMT与这两种 SHMT都相似[5]。
1.3 马铃薯 SHMT基因 cDNA的克隆
以豌豆叶片 SHMT的 cDNA为探针,从马铃薯
叶片的 cDNA文库中分离到一个全长的 SHMT克
隆,它的序列和其它相应的 SHMT的 cDNA序列同
源性较低:与粗糙脉孢霉和人类不同同工酶形式
(线粒体和胞质来源的)的 SHMT同源性分别为
68.7%、61.4%和 60.1%。在蛋白质水平上,这个酶
和原核生物有 42%~45%同源性,和粗糙脉孢霉及
人类细胞质来源的 SHMT有 57%同源性,和人类线
粒体来源的 SHMT有 60%同源性,和豌豆线粒体
SHMT同源性最高为 89%。不同的细胞区域和物种
中的所有 SHMT都有几个高度保守区域[1]。
1.4 拟南芥 SHMT基因的克隆
最初拟南芥 SHMT基因是用豌豆线粒体 SHMT
基因做探针筛选拟南芥 cDNA文库而分离出来的,
研究结果说明拟南芥 SHMT由一个基因家族编码,
基因组序列中有 7个 SHMT基因,包括 AtSHM1-
AtSHM7[1]。McClung等(2000)鉴定了其中的 5个
SHM基因序列,这 5个基因在核酸和氨基酸水平
上都有高度同源性。SHM基因中的 4个(SHM1,
SHM3,SHM4和 SHM5)位于第 IV染色体上,SHM2
位于第 V染色体上 (图 1A)。SHM1和 SHM2编码
的氨基序列中 N末端的延长部分可能是将 SHM1
和 SHM2蛋白定位到线粒体基质的信号肽。其余的
3个 SHM基因的编码序列没有可识别的定位序列,
因此推测它们可能定位于细胞质中,SHM1和
SHM4的编码序列与从完整的 cDNA序列推测的结
果一致[2]。
1.5 拟南芥 SHMT基因的结构
对拟南芥五个 SHM基因的内含子和外显子结
构的分析结果说明,SHM1和 SHM2相对于 SHM4
和 SHM5构成 2个亚群,SHM3不同于 SHM4-SHM5
进化枝,每个 SHM1和 SHM2含有 14个内含子,在
这 2个基因中内含子的位置是绝对保守的 (图
1B)。SHM3有 9个内含子,9个内含子中的 7个位
置很独特(图 1B)。SHM3的第 4和第 8个内含子的
位置在 SHM1和 SHM2中被第 8和第 12内含子占
据(图 1B)。SHM4和 SHM5有 2个共有的保守内含
子,其中一个所在的位置与 SHM1和 SHM2的很不
一样,另一个所在位置的保守性与 SHM1和 SHM2
图 1 拟南芥 SHM基因在染色体上的
分布和 SHMT基因的结构[2]
A:5个拟南芥 SHM基因在染色体上的分布 B:5个拟南芥
SHM基因的结构 白框代表外元 折线代表内元
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2008年第2期
的第 13个内含子相同(图 1B)。SHM4有一个额外
的内含子,SHM5和其它的拟南芥 SHM都没有这一
内含子(图1B)。这些SHM基因的内含子序列都较小
(大约为100nt),只在SHM4有一个最大的内含子是
409nt,这些基因内含子的长度都是不保守的[2]。
1.6 SHMT的进化及亲缘关系
比较拟南芥 SHMT氨基酸序列与 GenBank中
其他真核生物 SHMT氨基酸序列的同源性,发现与
拟南芥其余的 3个 SHMT蛋白相比,2个推测为线
粒体型的 SHMT1和 SHMT2之间的亲缘关系最近,
并且与其他已知的植物线粒体型 SHMT分布成为
一簇。SHMT3,SHMT4和 SHMT5形成一簇,在这一
簇中,SHMT4和 SHMT5间的关系比 SHMT3更紧密
(图 2)。与植物 SHMT的序列一样,来源于真菌和哺
乳动物群的线粒体型 SHMT分布成为一簇,但不与
细胞质型SHMT成为一簇,原生生物 Encephalitozoon
cuniculi的 SHMT与大肠杆菌 glyA基因编码的原核
生物 SHMT另外构成两个独立的分枝[2](图 2)。
在拟南芥中线粒体 SHMT由 2个基因编码,但
是还不知道这 2个基因是否一样重要,或者它们是
否在不同组织或者不同发育阶段起不同的作用。比
较单子叶植物和双子叶植物中编码 SHMT基因的
数量和结构,搜索水稻基因组中编码 SHMT的序
列,与拟南芥中的同源序列对比,可以得出 2个重
要结论:第一,在这 2个植物品种中这些基因的染
色体结构和推测的编码蛋白结构很相似。第二,水
稻中 SHMT同源基因数量与拟南芥相同,在水稻中
也有 7个 OsSHM,外显子-内含子的分界与拟南芥
7个 AtSHM一致。因此可以认为拟南芥基因组中
SHMT基因含量和组成的有关信息可以转移到谷
类作物中,其它被子植物中光呼吸基因的组织结构
可能也是相似的[1]。
1.7 拟南芥 SHMT的突变体
Ogren实验室利用化学诱变方法得到 3个拟南
芥SHM等位基因突变体。这些突变体与其它光呼吸
突变体一样,在正常环境条件下表现为生长延迟,有
白化症状,这些植物必须在 CO2浓度升高的环境条
件下才能生长。突变体叶片中全部 SHMT活性只有
野生型的 15%,这些突变体不能完成 Gly到 Ser的
转化作用。最近这些突变体中的突变位点被定位于
第5号染色体。但奇怪的是:stm的基因座与拟南芥
中 7个 AtSHM都无关[6]。这说明 stm突变体可能影
响到的基因座只是与 SHMT酶活性有关,但却不同
于编码 SHMT蛋白的 SHM基因座[2]。smt基因座可
能只是间接与 SHMT功能有关,然而,突变体对植物
生长的可见性影响效果说明这些突变位点在 Gly-
Ser代谢中具有重要的但还是未知的功能。
2 SHMT基因的表达调控
在拟南芥中有一个 SHMT基因家族,SHM1与
SHM2蛋白产物可能被定位于线粒体基质中,其它
3个 SHM基因编码胞质 SHMT。生物钟被用于协调
很多植物(生理生化)过程基因的表达时间[5~7],最
近的研究结果说明生物钟控制编码定位于光呼吸
反应场所的 3个不同亚细胞区中光呼吸途径组分
核基因的表达[2]。光呼吸 SHMT的 mRNA含量峰值
出现在早上,与其它发现的编码光呼吸或者光合作
用产物(LHCB,RBCS,RCA,及 CAT2)的 mRNA是同
样的时相。现有的证据说明 SHM1编码光呼吸
SHMT,SHM1mRNA能在叶中积累,并受光调节,在
转录丰度上有周期性。AtSHM2与 AtSHM1相似,在
叶片中的表达受光的强烈诱导。在连续光照下,
SHM1mRNA含量周期摆动持续 4个周期,这确定
图 2SHMT的系统进化树[2]
马莉等:植物丝氨酸羟甲基转移酶基因研究进展 17
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
了生物钟控制SHM1mRNA含量的时间模式。SHM4
mRNA在根中积累而不是在叶子中,SHM4mRNA不
受光的诱导,因此在光呼吸中可能不起作用,而在根
中参与C1代谢,但是,SHM4mRNA在幼苗根中的积
累却是受生物钟调节的。AtSHM4只在根和花中低水
平表达,AtSHM4不具备光诱导性,但是与AtSHM1一
样在转录丰度上有周期性[2]。
调节 SHM1的生物钟和光的相互影响是复杂
的,SHM1并没有表现出对持续白光刺激下的敏感
应答反应,这说明 SHM1不是直接对光应答。
SHM1mRNA摆动峰值时期取样后照射白、红光或
者蓝光 24h后,发现有 SHM1mRNA的积累,因为
SHM1mRNA摆动周期状态与 LHCB和 CATALASE2
mRNA摆动状态相似,都是光照 24h后到达最高
峰。有可能 SHM1mRNA含量对来自生物钟的动态
信号是直接应答的,也可能 SHM1mRNA含量对光
呼吸和光合作用碳代谢生物钟的诱导是间接应答
的[2]。
3 SHMT基因的应用与展望
3.1 大肠杆菌 SHMT基因的遗传操作与应用
缺乏 SHMT的 E.coli菌株 GS245glyA不能合成
Gly,在它生长的培养基中需要添加 Gly。大肠杆菌
中编码SHMT的glyA基因被克隆到一个高拷贝质粒
中,并且在缺失了野生型酶的突变菌株GS245glyA中
表达。含有 glyA基因表达质粒的 E.coli菌株与野生
型相比,其酶活力提高 26倍,因此可以用一个简单
的纯化过程得到大量纯酶,以便能够证实 E.coli酶
的氨基酸序列,鉴定其三维结构,将其与兔肝脏的
酶进行机制特征等的比较,并且研究巯基基团在酶
催化机制中的作用[3]。
SHMT在利用 Gly和甲醛合成 Ser工业生产中
很有用,然而,大多数野生型的原核酶活性和稳定
性不够好,难以满足商业应用的要求。因此,如果能
得到提高酶的活性和产率的突变体就能应用于商
业生产。在蛋白质工程中通过模仿蛋白质自然进化
机制(随机突变和重组筛选)的关键过程在体外使
酶直接进化是一种很有用的策略。在生物系统中直
接进化被应用于生物系统的很多方面:如蛋白质工
程、疫苗的开发、生化产品的生产及代谢工程等。因
此有人尝试利用体外直接进化的方法修饰 SHMT,
通过直接进化和蛋白质工程,提高 SHMT的活性和
产量。经过 3轮错误倾向 PCR使得 E.coliSHMT基
因(glyA)DNA连续重排 3次,用基因功能互补分析
方法筛选重组子,获得突变体 3E7,与野生型亲本
对比,3E7的酶活性大约增加 8倍,酶蛋白的产量
增加 41倍,突变体酶的 Vmax/Km与野生型相比有
明显的提高。突变体 3E7有 8个氨基酸被取代,纯
化的 3E7和野生型 SHMT一样在 SDS-PAGE电泳
胶上均是一条 45kD大小的单带。除了 S355N能通
过与 TFH形成氢键增强其过度状态的结构稳定性
外,所有突变位点与底物都没有直接相互作用。对
进化酶的序列和结构进行研究将会为阐明 SHMT
的结构与功能的关系提供更有价值的信息[8]。
3.2 SHMT基因与甲醛同化作用
很多细菌都拥有 Ser代谢途径,这条途径的功
能是同化一碳化合物(甲烷,甲醇,甲醛)并为细胞
组分的合成提供由 C1化合物产生的前体物质[9],
此途径的关键酶是 SHMT,在 Ser代谢途径具有非
常重要的作用,SHMT把 THF添加到 Gly上生成了
该途径的主要中间产物 Ser。另一方面,在哺乳动
物、植物和其他微生物中,SHMT的主要功能是为
蛋白质和嘌呤合成提供 Gly,为 C1库提供 N5,N10-
亚甲基四氢叶酸[10]。两种情况都需要辅因子 THF和
PLP的参与[10,11]。通过仔细比较甲基营养菌的 Ser途
径和植物的光呼吸途径后发现这两个途径之间有
一些相似甚至是完全相同的反应步骤。从磷酸乙醇
酸转变成乙醛酸之后的几步反应都是相似或相同
的,如乙醛酸也是通过 Ser-乙醛酸氨基转移酶的作
用形成 Gly,此后在光呼吸植物叶片线粒体中,通
过 SHMT与 GDC复合体的联合作用,由 GDC催化
光呼吸 Gly的脱羧作用,生成 NH3,CO2和 C1单位,
C1单位将四氢叶酸转变成亚甲基四氢叶酸[12]。来
自亚甲基四氢叶酸的 C1单位与甲基营养菌的 Ser
途径一样也是由 SHMT催化转移到第二个 Gly分
子上形成 Ser,Ser也是在 Ser-乙醛酸氨基转移酶的
作用下形成羟基丙酮酸,在羟基丙酮酸还原酶的作
用下羟基丙酮酸转变成甘油酸,然后由甘油酸激酶
催化甘油酸产生 3-磷酸甘油酸,Ser转变为磷酸甘
油酸后再进入叶绿体卡尔文循环。
甲醛也是植物 C1化合物代谢的一种中间产
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物,以往的一些研究表明把吊兰的枝条暴露于用
[14C]标记的气体甲醛中 24h以后,在回收到的放射
活性中大约有 88%的放射性是植物关联性的,并且
发现这些放射性已掺入到有机酸、氨基酸、游离糖
类和脂类,还有细胞壁的成分中。把[14C]标记的液
体甲醛溶液添加到无菌培养的大豆细胞悬浮培养
物也得到了相似的结果,Ser和卵磷脂被确定为主
要代谢产物[13]。在用 14C标记的甲醛分析转基因拟
南芥中甲醛的光合作用同化途径代谢产物时发现,
即使在很短的标记时间(20min)内,在对照植物中
有大量标记的 Ser和少量的有机酸出现。因为在植
物体内大部分 Ser通过 GDC/SHMT系统形成,因此
推测叶片线粒体中 SHMT与此现象的出现有直接
的关系,从溶液中扩散进入植物细胞的甲醛与四氢
叶酸自发结合形成 CH2-THF,光呼吸途径中产生
的大量 Gly可以成为从甲醛产生的一碳单位的受
体,在 SHMT作用下二者结合形成 Ser。植物的光呼
吸途径很可能与甲基营养菌中的 Ser途径具有类
似的功能,是植物中天然存在的主要甲醛同化途
径。光呼吸途径中的 SHMT与甲基营养菌中的 Ser
途径中具有类似的作用,是负责 C1化合物同化作
用的核心酶。因此将来有必要利用植物基因工程技
术,改变光呼吸途径中的 SHMT基因的表达水平,
同时利用 13C核磁共振技术考察转基因植物中 Ser
和其他代谢中间产物的标记情况,证明光呼吸途径
中的 SHMT是否是负责植物中甲醛同化作用的关
键酶,探讨植物光呼吸途径中的 SHMT与甲醛的同
化作用是否有直接的关系。
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