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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
乌拉尔甘草内生真菌拮抗菌株的筛选和鉴定
王丽　刘磊　韩素贞
(首都师范大学生命科学学院 ,北京 100048)
　　摘 　要 : 　从乌拉尔甘草样品的根、茎中共分离出 54株内生真菌 ,统计发现从根中分离得到的内生真菌的种类比茎中多。
抑菌实验共得到 20株活性菌株 ,其中编号为 dG921的菌株对多种病原菌有抗菌活性。通过进一步对其培养特征 ,显微形态特
征观察以及 ITS序列测定和系统发育树构建与分析 ,发现该菌与灰黄青霉 ( Penicillium griseofu lvum )的亲缘关系最接近 ,相似
性为 99146 %。
关键词 : 　乌拉尔甘草 　内生真菌 　抑菌活性 　鉴定 　 ITS序列
Screen ing and Identif ication of Antim icrobe Activ ity of
Endophytic Fungus in G lycyrrh iza u ra lensis
W ang L i　L iu Lei　Han Suzhen
(College of L ife Science, Capital N orm al University, B eijing 100048)
　　Abs trac t: 　Fifty2four endophytic fungus were isolated from roots, stem s of Glycyrrh iza uralensis1Twenty strains were obtained by
the inhibitory activity screening and dG921 had the best antim icrobial function among them1Through colony characteristics and morpho2
logical characters by m icroscopy and ITS sequence, analysis results showed that the strain dG921 was sim ilar to Penicillium griseofu l2
vum , and the sim ilarities was 99146% 1
Key wo rds: 　Glycyrrhiza ura lensis　Andophytic fungus　Antim icrobe activity　 Identification　 ITS sequence
收稿日期 : 2008212215
基金项目 :北京市教委基金 ( KM200510082008)
作者简介 :王丽 (19812) ,女 ,硕士生 ,主要从事植物内生菌的研究 ; E2mail: laiyang1981@1631com
通讯作者 :韩素贞 , E2mail: hansuzhen99@ vip1 sina1com
　　内生菌是指在其生活史的部分或全部阶段都生
活在植物组织内的细菌、真菌或放线菌 , 且不会引
起植物病害。由于生活环境的特殊性 ,某些药用植
物内生菌形成与宿主植物相同或相似的代谢途径 ,
产生一些诸如抗菌、抗病毒的活性物质 [ 1 ]。十几年
研究表明 ,从内生真菌分离得到的生物活性物质中
51%都是未知的 [ 2 ]。至今 ,研究内生菌资源的植物
种类也很少 ,因此从植物内生菌中寻找新物质的前
景是很广阔的 ,并且植物内生菌本身作为新的微生
物资源也具有很重要的研究价值。
甘草是我国常用药材之一 ,有“十方九草 ”之
称 [ 3 ]。乌拉尔甘草 ( Glycyrrh iza u ra lensis)为豆科多
年生草本植物 ,主要分布在内蒙和甘肃 ,耐寒、喜干 ,
具有适应恶劣自然条件的特性 ,为主流药用商品。
当前对甘草内生菌有一定的研究 [ 4, 5 ] ,但今对乌拉
尔甘草内生真菌的研究报道较少。本研究对乌拉尔
甘草根、茎内的内生真菌进行了分离。通过拮抗性
筛选得到一株高抑菌活性菌株 ,通过培养特征、显微
形态观察、ITS序列测定和系统发育树构建与分析
对其进行了鉴定。
1　材料和方法
111　材料
11111　样品采集 　乌拉尔甘草于 2007年 8月采自
内蒙古呼和浩特市 ,由内蒙古师范大学生命科学学
院苏哈拉图副教授鉴定。
11112　指示菌　枯草芽孢杆菌 (B acillus subtilis)、金
黄色葡萄球菌 (S taphyloccus aureus)、大肠杆菌 ( Esch2
erichia coli )、酒精酵母 (Saccharom yces cerevisiae)、黑
曲霉 (Aspergillus n iger)。酒精酵母和黑曲霉购自中国
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
微生物菌种保藏中心 ,其余菌种来源于首都师范大学
微生物系菌种保藏室。
11113　培养基　 (1)马铃薯培养基 ( PDA ) :固体培
养基用于内生真菌的分离纯化 ,液体用于发酵。 (2)
牛肉膏蛋白胨培养基 :培养枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、
金黄色葡萄球菌。 (3) 186YM培养基 :酵母提取物 10
g,蛋白胨 20 g,葡萄糖 20 g,琼脂 15 g,蒸馏水 1 000
m l, pH610。培养酒精酵母。 (4)查氏培养基 :培养黑
曲霉。
112　方法
11211　内生菌的分离纯化 　新鲜的乌拉尔甘草用
自来水冲洗干净 , 用刀将根、茎横切成约 5 cm的小
块 ,按下列程序进行表面消毒 : 75%的酒精浸泡 2～
3 m in,无菌水冲洗 3次 ,浓度为 011%的升汞漂洗
30 s,无菌水冲洗 3次。自然晾干后 ,用无菌刀将
根、茎切成约 013 cm ×013 cm的小段 ,用无菌镊子
接种于含 0104%氯霉素的马铃薯固体培养基
( PDA)中 ,分置于 20℃和 28℃培养。7 d左右长出
适当大小的菌落后 ,用接种铲切取菌落边缘 012 cm2
的小块转接于 PDA,反复转接至纯培养 , 4℃斜面保
藏。以消毒后不做切割的样品作为对照。
11212　内生真菌发酵和指示菌培养 　将纯化后的
内生真菌分别接入含 100 m l PDA液体培养基和若
干玻璃珠的 250 m l三角瓶中 , 180 r/m in、28℃震荡
培养 8 d。取发酵液 2 m l, 12 000 r/ m in离心 5
m in,除去菌丝和孢子 ,上清液用于抑菌试验。
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌用
牛肉膏蛋白胨液体培养基 37℃培养 24 h,酒精酵母
用 186YM液体培养基 28℃培养 72 h,黑曲霉用查氏
液体培养基 28℃培养 5 d。
11213　内生真菌拮抗菌株的初筛 　将半固体培养
基冷却至 45℃左右 ,按 20∶1的比例与指示菌培养
液混合 ,摇匀 ,制成平板。等待平板凝固后 ,将圆形
无菌滤纸片 (直径 5 mm )贴在培养基表面 ,加入内
生真菌发酵上清液 10μl,盖好培养皿盖。将大肠杆
菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌指示菌平板置
37℃培养 ,酒精酵母和黑曲霉置 28℃培养 , 24 h后
观察结果。
11214　杯碟法筛选内生真菌拮抗菌株 　用杯碟法
对初筛有抑菌活性的菌株再进行筛选。方法与初筛
类似 ,用牛津杯代替滤纸片 ,每个杯中放入 200μl
发酵上清液。
11215　dG921菌种鉴定 　将 dG921接种在 PDA固
体培养基上 , 28℃培养一周 ,观察菌落特征 ; 28℃在
PDA固体培养基上进行插片培养 ,分别在 3、5、7 d
取插片 ,以蒸馏水为浮载剂制成玻片 ,在显微镜下观
察显微形态。
将要鉴定的内生真菌接种到 PDA固体培养基上 ,
28℃培养 7 d左右。用 CTAB 方法提取真菌的总
DNA[7 ] ,用 110%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。1PCR
扩增引物为 ITS1f (5′2CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA2
3′)和 ITS4 (5′2TCCTCCGCTTATTGATATGC23′) [8 ] ;反应
体系为 25μl,DNA模板 1μl,上下引物分别为 1μl, 2
×master mix 1215μl, ddH2O 915μl; PCR扩增反应流
程 : 94℃预热变性 3 s后 ,作 35个循环 ,每一个循环包
括 94℃变性 30 s,退火 45 s, 72℃延伸 1 min,循环结束
后 72℃延伸 7 min;送上海生工生物公司测序。
将所得 ITS序列于 GenBank数据库中进行比对
并获得参比序列 ,利用 ClustalX 118软件进行多序
列比对 ,经人工仔细核查后采用 Mega 210构建系统
发育树。
2　结果与分析
211　甘草内生真菌的分离
从乌拉尔甘草植株中分离到内生真菌 54株 ,从
根、茎中分别分离到 44和 10株。其中 28℃培养时
分离到内生真菌 24株 ,根、茎内的内生真菌数分别
为 18和 6株 ; 20℃培养时分离到内生真菌 30株 ,
根、茎的内生真菌分别为 26和 4株 (表 1)。可以看
出 ,在 20℃培养条件下从甘草中可以分离到更多的
内生真菌。这和乌拉尔甘草的生活习性有关。
表 1　内生真菌菌株数统计
分离的内生真菌数 拮抗菌株数 拮抗菌株所占比例 ( % )
20℃ 28℃ 20℃ 28℃ 20℃ 28℃
根 26 18 14 4 53184 22122
茎 4 6 0 2 0 33133
212　拮抗菌株的筛选
采用 5种指示菌对 54株内生真菌的抗菌性进
行了测定。对上述菌株进行抑菌活性筛选发现 , 20
株具显著抑菌活性 ,占总菌株数的 37104% ,抑菌初
651
2009年第 6期 王丽等 :乌拉尔甘草内生真菌拮抗菌株的筛选和鉴定
筛试验部分结果见图 1。自 28℃分离的菌株中有 6
株有活性 ,各菌株分别编号为 G1、G2、G3⋯⋯G6;自
20℃分离的菌株中有 14株活性显著 ,分别编号为
dG1、dG2 、dG3⋯⋯dG14。乌拉尔甘草抗菌活性主
要表现为对枯草芽孢杆菌和酒精酵母的抗性 ,对枯
草的抗性达到了 80% ,对酒精酵母的抗性达到了
75% ,而对其他 3种指示菌抗性很低。抗菌谱最广 ,
活性最好的是 dG921,对 4种指示菌有很强的抑制
作用 ,而且多次发酵活性都很稳定。经过 8 d发酵 ,
菌株 dG921抑菌活性最高 ,对枯草芽孢杆菌的抑菌
圈直径达 27118 mm (图 2)。
213　菌株的鉴定
对 dG921菌株进行形态鉴定 ,菌落初白色 ,中央
渐变为兰绿色 ,中央突起 ,背面黄色 (图 3)。载片镜
检时发现 ,分生孢子梗从菌丝垂直生出 ,无足细胞 ,
分生孢子梗有横隔膜 ,顶端排列成帚状间枝 ,分枝多
次 ;分生孢子串呈不分枝的链状 ,单个孢子呈卵圆
形 , 浅绿色 ,光滑 ,无菌核。因此初步鉴定为真菌门
( Fungi)半知菌类 ( Fungi Im perfecti)从梗孢目 ( Mo2
niliales)丛梗孢科 (Dematiaceae ) 青霉属 ( Pencilli2
um )。
用 Mega软件对测序结果进行同源性分析 ,与
参比序列一起构建系统发育树 (图 4)。从系统树上
看 , dG921与灰黄青霉 ( Penicillium griseofu lvum )的亲
缘关系最为接近 ,相似性 99146%。
3　讨论
结果表明乌拉尔甘草中含有大量的活性内生真
菌资源 ,根中分离到的活性菌株种类比茎中多 ,而且
从 20℃得到的活性菌株种类比 28℃的多 ,原因可能
是低温抑制了生长迅速的真菌 ,从而没有把生长速
度慢的活性菌株掩盖。由于受采样时间、地点 [ 9 ]、
表面消毒的长短、生长环境、培养条件、生长速度、指
示菌范围的限制 ,有的活性菌株没有分离到 ,所以本
研究具有一定的局限性。形态学特征鉴定受到人为
因素和环境条件的干扰 ,仅仅用这个方法鉴定是不
可靠的。 rDNA2ITS区段位于 518S rDNA和 28S rD2
NA之间 ,既具保守性 ,又在科、属、种水平上有特异
性序列。通过对 ITS区进行 PCR及测序 ,可以准确
进行系统发育分析和真菌鉴定。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
在研究过程中 ,应用宿主与内生菌协同进化的原理 ,
参照宿主植物的活性物质来研究内生菌活性成
分 [ 10～13 ] , 从特殊生境和传统的药用植物中分离内
生菌 ,筛选药用活性物质 ,从而减少了对野生植物资
源的破坏。本试验筛选到的高活性菌株为以后的活
性物质研究奠定了基础 ,特别是 dG921,在以后的试
验中将对其活性物质做进一步的研究分析。
参 考 文 献
1　李伟南 ,张慧如 1饲料工业 , 2007, 28 (6) : 63～641
2　 Schulz B, Boyle C, D raeger S, et al1Mycol Res, 2002, 106: 996
～10041
3　马君义 ,张继 1草业学报 , 2006, 15 (1) : 120～1231
4　饶小丽 ,沈德龙 ,李俊 ,等 1微生物学通报 , 2007, 34 ( 4 ) : 700
～7041 5　宋素琴 ,欧提库儿 ,马合木提 ,等 1微生物学通报 , 2007, 34 ( 5 ) :867～87016　魏景超 ,真菌鉴定手册 [M ]1上海 :上海科学技术出版社 , 197917　MurraryMG , Thomp son W F1 Nucleic Acids Research, 1980, l8:4321～432618　 Freeman J , W ard E , Calderon C , McCartneyA1 European Journalof Plant Pathology, 2002, 108: 877～88619　 Strobel G, Daisy B1 M icrobiology and B iology Revews, 2003, 12:491～502110　Kitagawa I, Sakagam iM , Hashiuchi F, et al1 Chem ical and Phar2maceutical Bulletin, 1989, 37 (2) : 551111　张如意 , 张建华 , 王茂田 1药学学报 , 1986, 21 (7) : 510112 　 Kajiyama K, Dem izu S, H iraga Y, et al1Nature, 1992, 55(9) : 1197113　张海军 , 刘援 , 张如意 1药学学报 , 1994, 29 (6) : 4711
献给初学者的生物技术 ·书 　讯 ·
　　莱因哈德 ·伦内贝格教授 (德 )任教于香港科
技大学 ,主要从事生物检测领域的研究。他编写的
《生物技术入门 》围绕学术探究和技术发展的主线 ,
用通俗的文字阐述了生物技术的基本原理、实际应
用和最新进展。这本献给初学者的入门书籍也着眼
于人类历史发展和人类文明的多个侧面 ,展现了生
物技术的概貌和远景。
《生物技术入门 》涵盖了生物技术的核心内容
及其在食品工艺、工农业生产、能源环境、医疗健康
和生物信息中的应用。作者在章节架构上没有拘泥
于已有的知识体系 ,而是选择某个领域的实用技术
作为主题 ,辅以发展沿革、专家视角等背景知识。生
物工艺与美食、基因工程的奇迹、环境生物技术 ———
从“单行道 ”到自然循环、生物技术拯救生命 ,有趣
的标题让十个章节更像“主题讲座 ”。几十位撰稿
人以不同方式参与了部分背景知识的创作 ,其中既
有各个领域的著名科学家 ,像发酵法生产氨基酸的
先驱木下祝郎、提出农业能源说的诺贝尔获奖者 A l2
an MacD iarm id、克隆羊多莉之父 Ian W ilmut等 ,亦不
乏科普作家 ,譬如获得过普利策奖的贾德 ·戴蒙。
除了畅达风趣的文字、广博的知识底蕴 ,书中的千余
幅插图也引人入胜 ———分子结构图、荧光图、描线
图、美术作品、老照片、电影海报 ,甚至还有搞笑的
漫画。
两次获得诺贝尔奖的弗雷德里克 ·桑格在看到
这本书时“觉得自己又回到了学生时代 ”。美国国
家科学院与艺术科学院院士、哈佛大学药学院教授
汤姆 ·拉波波特则赞许道 :伦内贝格的这本书传递
着对科学的热情与信念 ,这些也许可以改变我们的
世界。
《生物技术入门 》(德语 )于 2006年出版后 ,很
快就被翻译成了英语和西班牙语。2009年 ,科学出
版社科爱传播中心从 Elsevier出版集团引进了这本
书 ,并由四川大学生命科学学院的杨毅教授担纲翻
译成中文。《生物技术入门 》(中文全彩 )可供生物
专业的学生、教学和研究人员作为教科书或者参考
书。为了满足不同层次读者的需要 ,编译者根据章
节将原著拆分成《生物技术入门系列 》(全十册 ,中
文全彩 ) ,这套丛书可以作为高级科普读物 ,适合对
生物技术感兴趣的非专业人士。 (李小汀 科学出版
社科爱传播中心 L ixt@ kbooks. cn)
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