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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
烟草主要栽培类型的 SRAP标记研究
王日新　任民　贾兴华　冯全福　杨爱国　付宪奎　王绍美　罗成刚
(中国农业科学院烟草研究所 中国烟草总公司青州烟草研究所 ,青岛 266101)
　　摘 　要 : 　利用 SRAP分子标记从 700对引物中筛选到普通烟草栽培种内 (N icotiana tabacum L1)两条晾烟 (马里兰烟、白
肋烟 )类型的特征标记带、一条晒烟 (香料烟和名优晒烟 )类型的特征标记带 ,一条烤烟与晾烟特征标记带。这些标记不但可
以直接转化成 SCAR标记 ,而且可通过分离群体的遗传分析用于烟草类型间遗传转化的特征带 ,也可进一步用于测序发掘新
基因。在分子水平上为研究普通烟草种内不同栽培类型间的遗传差异和类型划分奠定了可行性实验基础。
关键词 : 　烟草 　分子标记 　SRAP
Study of SRAP Markers in Major Cultivated
Form s of N icotiana tabacum L1
W ang R ixin　Ren M in　J ia Xinghua　Feng Quanfu　Yang A iguo　Fu Xiankui　W ang Shaomei　Luo Chenggang
( Tobacco Research Institu te of CAAS, Q ingzhou Tobacco Research Institu te of CN TC, Q ingdao 266101)
　　Abs trac t: 　 In this study, four characteristic bands for distinguishing cultivated form s of N icotiana tabacum L1 were screened by
700 pairs of SRAP p rimers1 Among the four characteristic bands, air2cured tobacco including maryland tobacco and Burley tobacco, sun
cured tobacco including oriental tobacco and sun2cured tobacco, and flue2cured tobacco and air2cured tobacco were distinguished1 The
four bands can be used either directly as the characteristic bands of in genetic transformation among cultivated form s of N icotiana taba2
cum L1, or as SCAR markers for further study1 Furthermore, the characteristic bands could be sequenced and the corresponding genes
of which could be isolated in the future research1 Therefore, the results p rovided a feasible research foundation for exp loring the genetic
diversity of different cultivated form s and the division of N icotiana tabacum L1 at molecular level1
Key wo rds: 　Tobacco　Molecular marker　SRAP
收稿日期 : 2008212210
基金项目 :国家烟草专卖局烟草育种战略性课题优质高香气烤烟新品种选育 ( 110200601003) ,中国农业科学院作物科学研究所基金基本科研
业务费专项 (08206030209)
作者简介 :王日新 (19802) ,男 ,在读博士研究生 ,研究方向为烟草品质育种 ; E2mail: rxwang79@163. com
通讯作者 :贾兴华 ,男 ,研究员 ,博导 ,长期从事烟草遗传育种研究 ; E2mail: xhjia@sohu1com　　烟草在长期自然进化和由原产地传向世界各地的过程中 ,由于自然因素、品种特性、栽培技术、调制方法等多种因素影响下 ,其形态特征特性不断发生变异 ,形成了多种多样的烟草类型。从植物分类学意义看 ,目前已知烟属含有 66个种 ,但是可供栽培利用的栽培种只有普通烟草种 (N icotiana tabacumL1)和黄花烟草种 (N icotiana rusitica L1) ,其中普通烟草种是世界范围的主要栽培种。在人工选择和栽培驯化过程中 ,普通烟草又形成有多种多样的栽培类型。关于烟草栽培品种的类型差异 ,习惯上多以所产烟叶品质特点为主并适当考虑调制方法和生物 学特性综合划分的。国外通常把普通烟草按调制方法划分为烤烟 ,又称火管烤烟 ;晾烟 ,包括浅色晾烟(白肋烟、马里兰烟 )和深色晾烟 (古巴型雪茄烟 ) ;晒烟 ,包括浅色晒烟 (印度晒烟 )和深色晒烟 (香料烟 ) ;烟熏烟 ,又称明火烤烟。根据上述的类型划分标准 ,结合生产实际和品种特性 ,我国将普通烟草划分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟 5个类型。目前 ,对普通烟草类型间栽培品种即基因型的差异研究 ,多集中在植物学性状、栽培调制特点、烟叶外观特征、化学成分、香吃味风格的表现型描述上。受环境因素的影响 ,表现型的研究与描述结果 ,
2009年第 6期 王日新等 :烟草主要栽培类型的 SRAP标记研究
多数表现重演性差或缺少可量化的性状指标 ,导致
其相关研究徘徊难进。DNA是生物固有的遗传信
息 ,它受环境影响较小 ,随着分子生物学的快速发
展 ,在分子水平上利用 DNA检测技术进行植物性状
遗传鉴定的理论与方法日趋成熟并受到广泛关注。
其中 , L i和 Quiros[ 1 ]于 2001年在研究芸薹作物中开
发的相关序列扩增多态性 ( sequence2related amp li2
fied polymorphism, SRAP) ,是一种基于 PCR的新型
标记。由于 SRAP标记操作简便快速、成本低、可信
度高、易于测序 ,已开始成功地应用于植物遗传图谱
构建、遗传多样性评价、基因定位、杂种优势预测以
及比较基因组学等研究。
本研究利用 SRAP标记技术 ,研究和分析了烤
烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟等不同栽培类型间的
基因型差异 ,初步筛选出了能够在分子水平上反映
不同烟草类型差异的特征性标记带 ,在 DNA水平上
为栽培烟草类型间品种的遗传鉴定和类型划分奠定
了有利地实验基础。
1　材料与方法
111　供试材料
根据我国烟草栽培类型的划分和烟草生产实
际 ,从目前主要栽培的普通烟草不同栽培类型中分
别选取 4个代表性品种为研究对象 ,材料类型和名
称包括 : ( 1)烤烟类型种植品种 : NC89、K326、G28、
大白筋 599。 ( 2 )晾烟类型种植品种 : 马里兰烟
MD40,白肋烟 Ky17、Burley21、TN90。 ( 3)晒烟类型
种植品种 :小牛舌、千层塔、青梗、小花青。 ( 4)香料
烟类型种植品种 : Sum sun、Basma、komotini Basma、
Xanthi Basma。
各供试材料于 2006～2007年在中国农业科学院
烟草研究所试验场单独布置田间试验。3月 20日播
种 , 4月 23日营养盘假植育苗 , 5月 28日大田移栽。
供试材料田间顺序排列 ,单行区 ,小区行长 1215 m,行
距 1 m,株距 015 m。移栽前土壤养分测定结果 :速效
氮 9317 mg/kg, P2O5 8192 mg/kg, K2O 47162 mg/kg,
pH610。实际施肥量折合纯氮 8121 g/m2 , P2O5 8132
g/m2 , K2O 24196 g/m2 ,N∶P∶K比例为 1∶1∶3。各供试
材料的田间管理同常规措施 ,环境条件基本一致。
进入旺长期 ,在各供试材料中选取性状表现整齐
一致的 5个单株采集嫩叶 ,混合 , - 20℃低温保存备用。
112　DNA提取
用稍加改进的 CTAB法提取烟草基因组 DNA。
取采集保存的叶片组织 ,液氮研磨后 ,取适量置于 115
m l离心管中 ,加入 600μl裂解缓冲液 ( 100 mm l/L
Tris2HCl、114 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA 、012%
PVP)洗涤一次 ,离心去上清液 ,加入 300μl裂解缓冲
液悬浮沉淀 ,然后加入 300μl的裂解液 (4% CTAB、
100 mm l/L Tris2HCl、114 mol/L NaCl、20 mmol/L ED2
TA 、012% PVP) ,上下颠倒数次混匀 ,置于 65℃水浴
30 m in;水浴后取出冷却至室温 ,加入 600μl氯仿 2异
戊醇 (24∶1) ,缓慢颠倒充分混匀后 , 12 000 r/m in离心
5 m in;取 600μl上清液另置 115 m l离心管中 ,加入
400μl异丙醇 ,颠倒混匀后 , - 20℃放置 1 h;经 1 200
r/m in离心 5 m in,沉淀经 70%乙醇洗涤两次 , 100%
乙醇洗涤一次 ,放置干燥后 ,加入 100μl TE溶解。
紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA
质量。稀释至 30～50 ng/μl, - 20℃保存备用。
113　SRAP引物序列
利用的 SRAP主要引物如表 1,前引物以 SF加
数字命名 ,后引物以 SR加数字命名。27条前引物
与 27条后引物随机组配成 700对引物 ,用于研究烟
草不同类型间的基因型差异。
114　PCR扩增反应
PCR总反应体系为 25μl[ 2 ] ,其中 30～50 ng/μl
DNA 样品 2μl, 10 ×reaction buffer ( KCl) 215μl, 25
mM MgCl2 115μl, 25 mM dNTPs 215μl, 10μmol/L
正反向引物各 215μl, Taq DNA 聚合酶 1 U。所用
试剂购自 MB I。
PCR反应在 96孔 MJ Research PTC2100型基因
扩增仪上按以下程序运行 : 94℃预变性 5 m in;前 5
个循环程序为 94℃ 45 s, 35℃ 45 s, 72℃ 1 m in;随
后的 35个循环 : 94℃ 45 s, 50℃ 45 s, 72℃ 1 m in;最
后 72℃延伸 10 m in, 4℃保持。
115　电泳检测
完成 PCR循环 48 h内 ,向反应混合液中加入 10
mM loading buffer (015 M EDTA pH810, 98%甲酰胺 ,
01025%溴芬兰 , 01025%二甲苯青 ) 3μl,然后 95℃变
性 5 m in。取 5μl PCR产物在 6%聚丙烯酰胺凝胶上
恒电压 1 700 v电泳 90 m in,改进的 Sanguinetti法银
染显 [ 3 ]。
101
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
表 1　SRAP标记的引物序列
前引物
名称 序列 (5’→3’)
后引物
名称 序列 (5’→3’)
SF1 TGAGTCCAAACCGGAAT SR1 GACTGCGTACGAATTAAT
SF2 TGAGTCCAAACCGGAAG SR2 GACTGCGTACGAATTTGC
SF3 TGAGTCCAAACCGGATA SR3 GACTGCGTACGAATTGAC
SF4 TGAGTCCAAACCGGACC SR4 GACTGCGTACGAATTTGA
SF5 TGAGTCCAAACCGGAGC SR5 GACTGCGTACGAATTAAC
SF6 TGAGTCCAAACCGGTAG SR6 GACTGCGTACGAATTGCA
SF7 TGAGTCCAAACCGGTAA SR7 GACTGCGTACGAATTATG
SF8 TGAGTCCAAACCGGTTG SR8 GACTGCGTACGAATTAGC
SF9 TGAGTCCAAACCGGTCA SR9 GACTGCGTACGAATTACG
SF10 TGAGTCCAAACCGGTCC SR10 GACTGCGTACGAATTTAG
SF11 TGAGTCCAAACCGGTGT SR11 GACTGCGTACGAATTTCG
SF12 TGAGTCCAAACCGGTGC SR12 GACTGCGTACGAATTGTC
SF13 TGAGTCCAAACCGGAAC SR13 GACTGCGTACGAATTGGT
SF14 TGAGTCCAAACCGGACT SR14 GACTGCGTACGAATTCAG
SF15 TGAGTCCAAACCGGACA SR15 GACTGCGTACGAATTCTG
SF16 TGAGTCCAAACCGGATC SR16 GACTGCGTACGAATTCGG
SF17 TGAGTCCAAACCGGATG SR17 GACTGCGTACGAATTCCA
SF18 TGAGTCCAAACCGGATT SR18 GACTGCGTACGAATTAAG
SF19 TGAGTCCAAACCGGAGT SR19 GACTGCGTACGAATTACA
SF20 TGAGTCCAAACCGGAGA SR20 GACTGCGTACGAATTAGT
SF21 TGAGTCCAAACCGGTAC SR21 GACTGCGTACGAATTAGA
SF22 TGAGTCCAAACCGGTAT SR22 GACTGCGTACGAATTCAT
SF23 TGAGTCCAAACCGGTCG SR23 GACTGCGTACGAATTCAC
SF24 TGAGTCCAAACCGGTCT SR24 GACTGCGTACGAATTGGA
SF25 TGAGTCCAAACCGGTGA SR25 GACTGCGTACGAATTGCT
SF26 TGAGTCCAAACCGGTTC SR26 GACTGCGTACGAATTTAT
SF27 TGAGTCCAAACCGGTTA SR27 GACTGCGTACGAATTTCT
116　引物筛选
在不同类型供试材料中取 G28、大白筋 599两个
烤烟型代表品种 ,千层塔、小牛舌两个晒烟型代表品
种 ,Burley21、ky17两个晾烤烟型代表品种和 Basma、
Sumaun两个香料烤烟类型品种作为引物筛选样本 ,
找到差异引物后 ,在供试各品种间进一步验证获得基
因差异的 SRAP引物和标记带。
2　结果与分析
211　DNA质量检测
利用改进的 CTAB法提取烟草 DNA ,经 018%
琼脂糖电泳 (150 V, 30 m in) (图 1)。由图 1可以看
出 , 7个样品在泳道中的主带大小约为 2 100 bp,符
合植物基因组提取的标准大小 ;同时在主带附近没
有弥散 ,说明在提取 DNA过程中没用机械损伤 ;而
处于图片下部的弥散 ,为烟草的 RNA,这是由于在
提取烟草 DNA时没有经过 RNase消化 RNA而造成
的 ,而 RNA的存在对 SRAP标记没有影响。
图 1　D NA琼脂糖照片
212　烟草 SRAP标记的多态性
为了有效、快速地找到具有多态性的引物组合 ,
用 8个具有代表性的品种对 700对 SRAP引物组合
的多态性进行筛选。图 2是 8对引物组合的 SRAP
扩增反应的产物模式。在大于 1 000 bp的区域 ,扩增
带多且密 ,不易辨认 ,小于 100 bp的扩增带多数较
弱 ,不易辨认 ,所以都未予记录 ;仅记录统计了处于
100～1 000 bp范围内扩增的易于辨认的带。在 700
对引物组合中 ,得到 115个扩增后带型好、品种间带
型有差异且易于识别的引物组合。在 100～1 000 bp
范围内每对引物产生 5～15个扩增带 , 115个引物组
合共扩增出 1 045条带 ,平均每个引物组合产生 911
条。115个存在多态的引物组合共产生 151个多态
带 ,每个引物产生 1～3个多态带 ,平均每个引物组合
产生 114个多态带。每对引物组合产生的多态带的
比例为 1%～3% ,平均为 14%。
图 2　SRAP扩增结果
213　烟草类型间的 SRAP特征带
115个多态引物组合中烟草同一类型共有的多
态性带较少 ,主要集中在 MD40、Burley21两个样本
201
2009年第 6期 王日新等 :烟草主要栽培类型的 SRAP标记研究
上。经扩大样本量再扩增 ,共得到 4个引物组合符
合我国普通烟草类型的分类结果 ,仅占多态引物组
合的 315%。
在 4 对引物组合中 , 晾烟 MD40、Ky17、Bur2
ley21、TN90基因型共有的特征带有两对引物组合 ,
分别为 SF253 SR2, SF33 SR26 (图 3、图 4) ;晒烟小
牛舌、青梗、小花青和香料烟 Sum sun、komotini Bas2
ma、Xanthi Basma共有的特征带引物组合为 SF203
SR14 (图 5 ) ; NC89、K326、G28、大白筋和 MD40、
Ky17、Burley21、TN90 共有的特征带引物组合为
SF163 SR14 (图 6)。
由图 3和图 4可以看出 , 9～12号泳道在 340
bp和 250 bp左右各有一条扩增带 ,其带型清晰、与
其它带分离较好 ,而其它泳道在这两个位置均未产
生扩增带。就遗传背景来看 ,白肋烟来源于马里兰
烟的一个两对隐性重叠基因的突变体 ,马里兰与白
肋烟的遗传背景极其相近 ,因此可将这两条带作为
马里兰烟与白肋烟主要遗传差异的特征带 ,在烟草
类型划分时可将这两对引物组合作为区分马里兰烟
与烤烟、香料烟和晾晒烟的候选引物。
图 5表明 , 6、7、8、13、15、16泳道在大约 460 bp
有一条带型清晰的带 ,而其它泳道在相同的位置未
出现这样的带。我国栽培的晾晒烟多为印度、中国
类群 ,而香料烟为土耳其型香烟 ,说明我国的某些名
优晾晒烟与香料烟有相似的遗传背景。因此 ,可将
这条带作为大部分香料烟和晾晒烟的特征带、在烟
草类型划分时可将这对引物组合作为区分香料烟、
晾晒烟与烤烟、马里兰、白肋烟的候选引物。
1～41NC89、K326、G28、大白筋 599; 5 ～81Basma、Sum sun、komotini
Basma、Xanthi Basma; 9～121MD40、Ky17、Burley21、TN90; 13～16:小
牛舌、千层塔、青梗、小花青
图 3　引物组合为 SF253 SR2扩增结果
1～41NC89、K326、G28、大白筋 599; 5 ～81Basma、Sum sun、komotini
Basma、Xanthi Basma; 9～121MD40、Ky17、Burley21、TN90; 13～161小
牛舌、千层塔、青梗、小花青
图 4　引物组合为 SF33 SR26扩增结果
1～41NC89、K326、G28、大白筋 599; 5 ～81Basma、Sum sun、komotini
Basma、Xanthi Basma; 9～121MD40、Ky17、Burley21、TN90; 13～161小
牛舌、千层塔、青梗、小花青
图 5　引物组合为 SF203 SR14扩增结果
1～41NC89、K326、G28、大白筋 599; 5 ～81Basma、Sum sun、komotini
Basma、Xanthi Basma; 9～121MD40、Ky17、Burley21、TN90; 13～161小
牛舌、千层塔、青梗、小花青
图 6　引物组合为 SF163 SR14扩增结果
从图 6可以看出 ,泳道 1～4、9～12在 420 bp
左右存在带型清晰、与其它带分离较好的带 ,其余 8
个泳道中在此位置无扩增出现。烤烟、马里兰烟和
白肋烟这三类烟草从生态类群来看都属于美国烟草
类群 (亚热带烟草 ) ;而香料烟属于东方型烟草类群
(亚热带地中海气候烟草 ) ;因此可将其看做这三类
烟草的标记带 ,在烟草类型划分时可将这对引物组
合作为区分烤烟、马里兰烟、白肋烟与这香料烟、晾
晒烟候选引物。同时可以结合 SF25 3 SR2,或 SF33 SR26两对引物组合 ,将烤烟与其它类型的普通烟
301
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
草进行区分。
3　讨论
SRAP标记属于非特异性引物的分子标记 ,因
其使用较高的退火温度和较长的引物 ,从而保证了
其扩增的稳定性 ,同时兼有操作简便、费用低等优
点 ,已经成功的用于作物遗传多样性分析、遗传图谱
的构建、重要性状的标记以及相关基因的克隆等方
面。在烟草上近几年应用 SRAP标记的研究也逐渐
展开 ,其反应体系也在不断优化 ,并在烟草种质资源
抗性、遗传多样性鉴定方面取得了一定进展 [ 4 ]。但
是 ,有关 SRAP标记在探索烟草栽培类型间基因型
差异的研究报道还不是很多 ,用于烟草分类学中的
分子生物学证据的研究与探讨尚未见报道。
本试验利用 SRAP标记初步探索了烟草栽培类
型间的基因型差异 ,由 700个引物组合筛选到 115
个引物组合存在多态性 ,每对引物组合的多态性条
带平均 114个 ,比 Budak等 [ 5 ]对野牛草品种研究的
多态性带数 8个、Ferrilo等 [ 6 ]对西葫芦种质研究的
518个和林忠旭等 [ 7 ]对棉花研究的 5114个都低。
分析这种现象产生的原因 ,可能主要是研究材料不
同造成的。普通烟草的基因组虽然比较庞大 ,为异
源四倍体 (2n = 12Ⅱs + 12Ⅱt = 24Ⅱsstt) ,但是 ,本试
验供试的烤烟、晾晒烟、马里兰烟、白肋烟、香料烟等
不同栽培类型 ,都属于普通烟草种 ,它们之间的遗传
背景相似、遗传距离较近 [ 8, 9 ] ,可能是造成多态率低
的主要原因。对 115对多态性引物进行进一步筛选
验证发现 ,获得的 4个引物组合在烟草同一类型间
存在相同的标记比例为 315% ,也表现较低。原因
可能是相同类型间的烟草品种 ,在植物学、农艺性状
上也存在差异 ,一个品种的差异带并不足以代表一
种类型间的整体差异。同时 ,由于普通烟草种类型
是依据其重要农艺性状和栽培调制方法划分的 ,虽
然决定烟草性状的遗传因素较多 ,但是某些相对差
异性状的表达 ,还需要相对一致的环境条件保证 ,这
也增加了筛选出烟草类型间的标记带的困难度。本
试验中由上述 4个引物组合及其扩增出的特征带 ,
就遗传来源和遗传背景来看 ,能够在分子水平上反
映烟草不同类型间的差异。结合不同的引物组合筛
选实验分析 ,本试验得到的 4个引物组合可以将烤
烟、晾烟同其它普通烟草栽培类型区分开来 ,可作为
标记普通烟草不同类型的特征带和烟草类型划分的
候选引物。研究结果同时说明了 SRAP标记可用于
研究烟草栽培类型间基因型差异和栽培烟草种内遗
传类型的划分 ,进而证明分子标记技术应用于烟草
类型划分的可行性。
烟草在长期自然进化、人工选择和栽培驯化过
程中形成了遗传性多样的栽培类型。根据表现型性
状分析和描述烟草植物遗传多样性的传统方法和技
术 ,受环境条件难以调控等原因的影响 ,研究结论多
缺乏可量化指标或良好的重演性 ,导致不易指导应
用实践。因此 ,找到一种稳定可靠量化的生物化学
评价指标是烟草性状鉴定中亟待解决的问题。利用
SRAP等分子技术标记不仅可以找的烟草遗传型间
不同差异的标记带 ,或直接转化成 SCAR标记 ,用于
分子标记鉴定或辅助选择。而且 ,通过分离群体的
遗传分析用于烟草类型间遗传转化的特征带 ,也可
进一步用于测序发掘新基因 ,为目的基因的遗传操
作等提供应用研究基础。
参 考 文 献
1　L i G, Quiros CF, Theor App l Genet, 2001, 103: 455～4611
2　陈万胜 ,王元英 ,罗成刚 ,等 1分子植物育种 , 2008, 6 ( 1 ) : 177
～1821
3　任民 ,贾兴华 ,蒋彩虹 ,等. 生物技术通报 , 2008, 1: 113～116
4　刘建丰 ,王志德 ,刘艳华 ,等. 中国烟草科学 , 2007, 28 ( 5 ) : 49
～531
5　Budak H, Shearman RC, Parmaksiz I, et al. Theoretical and App lied
Genetics, 2004, 108: 328～3341
6　FerriolM, Pico B, Nuez F. Theor App l Genet, 2003, 107: 271～2821
7　林忠旭 ,张献龙 ,聂以春. 遗传学报 , 2004, 31: 622～6261
8　肖炳光 ,杨本超. 中国农业科学 , 2007, 40 (10) : 2153～21611
9　杨友才 ,周清明 ,尹晗琪. 农业生物技术学报 , 2006, 14 ( 4 ) : 58
～5931
401