全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
甘草内生真菌的分离及鉴定
帖卫芳1, 2 胡鸢雷 1, 2 祝建波 1 林忠平 1, 2
( 1 石河子大学生命科学院,石河子 832000;北京大学生命科学院,北京 100871)
摘 要: 植物体内普遍存在着内生菌, 为了探寻传统药材甘草的质量与其内生菌之间可能存在的关系。对采自新疆的
甘草根部进行了内生真菌的分离及鉴定。选用 CYM真菌培养基, 对其内生真菌进行分离及纯化, 选择其中最占优势的两种
菌落分别进行了菌落形态观察及菌丝形态 (棉兰染色 )观察,以及基因组 DNA的 18S rDNA和 ITS rDNA序列鉴定和系统进化
分析。本研究结果表明从甘草根部主要分离到两种内生真菌,分别属于 Fusar ium 镰刀菌属和 G ibberella赤霉菌属。
关键词: 内生真菌 甘草 鉴定 18S rDNA ITS rDNA
Isolation and Identification of Endophytical Fungus in
L icorice Collected from X injiang Area
T ieW eifang
1, 2
Hu Yuanlei
1, 2
Zhu Jianbo
1
L in Zhongping
1, 2
(
1
College of Life Sciences, Shihez i University, Shihezi 832000;
2
Co llege of Lif e Sciences, P ek ing University, B eijing 100871)
Abstrac:t The plants in naturew idely grow w ith specific endophytes. In o rder to exp lo re the possib le linkage betw een the qua lity
o f licoricea trad itiona lm edicina l plant, and its endophy tica l fung,i the endophyte w as isolated from the root of lico rice co llected from
sou th o fX in jiang fo rmo rpho log ica l and DNA m olecu lo r identification. CYM m ed ium was used for purify ing and grow ing the iso la ted en
dophy te and two dom inant clon ies o f fung iw ere se lected for m icroscopic obse rvation and 18S rDNA and ITS rDNA sequence analysis.
M o reover, the ir phy logenic re la tionsh ip w ith o ther fung iwas analysized by NCBI b last, the results o fw hich show that this tw o endophytic
fung i iao lated from licor ice root be long toFusar ium and G ibberella genus, seperative ly.
Key words: Endophytical fung i L icor ice Identifica tion 18S rDNA ITS rDNA
收稿日期: 20100310
作者简介:帖卫芳,女,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学; Em ai:l tw f_ss@ 163. com
通迅作者:胡鸢雷,女,工程师,博士,研究方向:植物分子生物学; Em ai:l huy@l pku. edu. cn
内生菌 ( endophyte )是指那些在其生活史的一
定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器
官内部的微生物 [ 1, 2] ,被感染的宿主植物 (至少是暂
时 )不表现出外在病症, 可通过组织学方法或从严
格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接
扩增出微生物 DNA的方法来证明其内生 [ 3]。在植
物体内不同的内生菌占有着不同的生态位 [ 4] , 不仅
包括互惠共利、中性的内共生微生物,也包括那些潜
伏在宿主体内的病原微生物。自 1898年 Vog l从黑
麦草种子内分离出第一株内生真菌以来, 植物内生
菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注,从
内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外
研究的又一热点。近年来, 我们在研究植物内生真
菌与宿主植物次生代谢产物合成的相关关系方面做
了初步研究 [ 2, 5]。
甘草作为一种重要的传统药材, 其药用部位根
与根茎中次生代谢物的积累可能与特定区域根系微
生物有密切关系。目前关于甘草内生菌方面的研究
主要集中于内生细菌 [ 4] , 对于内生真菌的报道较
少。我们认为在宿主植物特定部位的微生态环境
下, 不会有几十种微生物参与宿主与内生菌的互作,
因此关注 1- 2种优势内生真菌的作用。本研究不
仅拟从形态观察、染色制片方面, 而且从分子水平上
对甘草内生真菌进行鉴定及进化分析。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
1 材料与方法
11 材料
111 甘草材料 甘草材料取自南疆阿克苏地区
的一种胀果甘草 (G lycy rrhiza uralensis F isch. )的根
部的主根部位。将其洗净后用于内生菌的分离。
112 试剂 pMD18T Vector K it、ExTaq酶购自
TaKaRa公司;普通 Taq酶购自上海申能博彩生物有
限公司; DNA分子量标准标记物购自 Fermentas公
司; DNA回收试剂盒购自博迈德公司; 棉兰 (甲基
蓝 )购自北京化学试剂公司; 其它试剂均为国产或
进口分析纯试剂。
113 培养基 真菌培养基: CYM培养基,即每升
培养基含麦芽糖 10 g,葡萄糖 20 g,酵母提取物 2 g,
蛋白胨 2 g,无水硫酸镁 0244 g,磷酸二氢钾 46 g,
pH70。固体培养基含 1%琼脂粉。
12 甘草内生真菌的分离及纯化
121 甘草内生真菌的分离 选取甘草根部小段,
自来水清洗干净后, 沥干水分, 剪成 2 cm左右的小
段,然后按常规无菌操作进行如下表面消毒: 75%酒
精浸泡 1 m in, 01% 升汞浸泡 15 m in, 去掉两端约
05 cm的部分,用解剖刀纵切后接于 CYM平板上
培养, 将接种后 10- 15 d长出的真菌用接种针挑取
菌丝转接到加有头孢抑菌素的 CYM固体培养基上。
122 甘草内生真菌的纯化 待菌丝长出后连续
转接 4- 5次以纯化,转接时,将菌丝接于加有头孢
抑菌素的 CYM固体培养基上。纯化好的真菌接于
CYM斜面培养基上做好标记,存于 4 及 28 培养
箱中保存备用。
13 甘草内生真菌菌丝染色
选用棉兰染色液 (又名甲基蓝 )对菌丝进行染
色 [ 6, 7]。棉兰染液的配制:苯酚 (结晶品 ) 20 g, 乳酸
20 mL, 甘油 40 mL, 棉兰 ( Cotton blue) 0 05 g, 蒸馏
水 20mL, 将苯酚、乳酸、甘油溶解于蒸馏水中 (可微
加热 ), 再加入棉兰 , 摇匀 , 备用。棉兰染色, 制作
临时装片, 10m in后,在显微镜下观察其形态特点。
14 甘草内生真菌基因组 DNA的提取
提取缓冲液:含 68 mL TEN缓冲液 ( 05 mo l /L
N aC ,l 50 mmo l/L EDTA, 01 mol /LTrisHC ,l pH80;
室温存放 )、68mL 20% SDS和 125 L蛋白酶 K母
液 ( 20 mg /mL, 溶于双蒸水, - 20 保存 ) ; 随用随
配。将真菌菌丝接种于 CYM液体培养基中, 28 培
养 5 d, 取 01 g(湿重 )菌丝置于 15 mL的 Eppen
dorf管中,液氮冷冻数秒, 用与 Eppendorf管配套的
玻璃研棒将菌丝充分研碎,置冰上,待所有样品都研
磨完后各加入 1 mL提取缓冲液, 剧烈混匀; 37 摇
床 ( 200 r /m in)中温浴 30 m in; 4 , 12 000 r /m in离
心15m in,取上清, 冰浴 30 m in; 4 , 12 000 r/m in离
心15 m in,取上清, 用 C I(氯仿 !异戊醇 = 24!1)抽提
蛋白 1- 2次;加入 600 L异丙醇, 4 , 12 000 r /m in
离心 15m in,弃上清。沉淀用 70%乙醇洗涤, 置室
温中晾干;每管加入 20- 40 L双蒸水溶解。
15 内生真菌的 18S rDNA以及 ITS rDNA鉴定
PCR扩增 18S rDNA序列以及 ITS rDNA序列,
根据真核生物 18S rDNA保守序列设计引物 18S rD
NA ( up)和 18S rDNA ( down) ,根据真核生物转录间
隔区 ( internal transcribed spacers) ITS序列设计引物
28S rDNA ( up)和 18S rDNA ( down) [ 3, 8]。
两个 PCR反应条件相同 ,即在 20 L的 PCR
反应体系中加入 DNA模板 1 L, 10 ∀ PCR buffer
( M gC l2 ) 2 L, 25 mmo l /L dNTP m ix 15 L, 相
应的引物 ( 10 m ol/L )各 1 L, Taq DNA聚合酶
( 5 U /L ) 0 2 L, ddH 2O 13 L。 PCR反应条
件: 94 预变性 6 m in; 94 变 30 s, 55 退火 30
s, 72 延伸 30 s, 30个循环; 72 延伸 10 m in,
10 保温 1 m in。
16 DNA片段的回收连接与测序
161 PCR产物鉴定与回收 PCR产物经 12%
琼脂糖凝胶电泳, EB染色, 在紫外灯下显示条带位
置。从琼脂糖凝胶上切下 18S rDNA与 ITS rDNA条
带, 称重后装入 15 mL离心管中, 按照北京博迈德
科技发展有限公司的多功能 DNA纯化回收试剂盒
说明进行操作,得到纯化的 PCR产物。
162 PCR产物的连接与转化 连接是按 T aK aRa
公司的 pMD18T V ector K it的说明进行。将连接产
物转化到大肠杆菌感受态细胞, 感受态细胞的制备
过程按常规方法进行。
163 筛选阳性克隆并测序 挑取筛选培养基
(加入相应浓度氨苄青霉素钠的固体 LB )上长出的
单克隆,并扩大培养;再次进行 PCR鉴定, 选阳性克
隆送上海生工测序。
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2010年第 9期 帖卫芳等:甘草内生真菌的分离及鉴定
2 结果
21 甘草内生真菌的外形观察及染色分析
211 菌落外形观察 经过分离纯化之后,从甘草
中主要分离出两种形态及颜色有明显区别的内生真
菌:白色真菌及褐色真菌。两种菌的生长速度相似,
均比较快。 28 为其最适生长温度。两种菌的菌落
形态相似,外部边缘均为白色毛状,褐色真菌在其基
部有褐色成分分泌, 且两种真菌培养时均有强烈的
药味散发。其外部形态观察见图 1。
A, B.从表层除菌的根部长出的不同形态特征的真菌;
C.甘草白色真菌; D.分泌褐色成分的真菌
图 1 在 CYM 培养基中生长的甘草内生真菌
2 12 内生真菌的染色分析 对两种内生真菌
进行了棉兰染色处理, 主要观察其菌丝形态。从
显微镜的观察结果 (图 2 )可以看出, 白色内生真
菌处于分生孢子时期, 形态呈镰刀形, 中间有 2-
3不等的横隔 (图 2A ); 褐色内生真菌, 菌丝细
长, 有隔, 有分枝, 且有少量分生孢子散落 (图 2
B )。
22 内生真菌的 18S rDNA以及 ITS rDNA鉴定
真菌的 PCR产物经 12%琼脂糖凝胶电泳,两
种内生真菌 18S rDNA PCR扩结果如图 3。由于 18S
rDNA在真菌中是相对比较保守的序列, 进化上变
异性较小。所以用相同的引物克隆此片段, 结果显
示两种内生菌的 18S rDNA序列大小相近,约为 950
bp左右。
经 12%琼脂糖凝胶电泳, 两种内生真菌 ITS
rDNA PCR扩结果如图 4。转录间隔区 ITS常用于
系统发育方面的分析, 在进化上有一定的种属特异
性,大小约在 700 bp左右。
图 2 甘草白色内生菌 (A )及
甘草褐色内生菌 ( B )染色图片
23 测序结果分析
PCR产物的测序结果在 NCB I上进行 BLAST比
对, 并做进化树分析, 结果如图 5, 图 6所示。比对
分析发现,甘草白色真菌的 18S rDNA序列与 Fusar
ium solani的 18S rDNA序列同源性高达 99% , ITS
rDNA序列与 Fusarium solani的 ITS rDNA序列同源
性为 100%。由此证明试验分离的甘草白色真菌属
于 Fusarium 属,并将该序列与其他近缘属进行序列
进化分析,如图 5。
比对分析发现, 甘草褐色真菌的 18S rDNA序
列 G ibberella fujikuroi的 18S rDNA序列同源性高达
100% , ITS rDNA序列与 G ibberella fujikuroi的 ITS
rDNA序列同源性为 94% , 且主要保守区均吻合。
由此证明试验分离的甘草褐色真菌属于 G ibberella
属, 并将该序列与其他近缘属进行序列进化分析,如
图 6。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
M. DNA /H ind III+ EcoR IM ark er; CK.负对照 ( ddH2O ) ; 1.白色真菌; 2.褐色真菌
图 3 真菌 18S rDNA PCR电泳图 图 4 真菌 ITS rDNA PCR电泳图
图 5 甘草白色真菌的进化分析图
图 6 甘草褐色真菌在 NCBI上的进化分析图
3 结语
本试验所分离培养的内生真菌来自甘草 ( G ly
cyrrhiza uralensis Fisch. )根部。从外部的菌落形态
及菌丝特点,针对其中主要的两种内生菌进行了对
比观察,用棉兰染色对菌丝进行了显微镜观察,最后
通过设计引物进行 PCR分析,在 NCB I上进行比对,
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2010年第 9期 帖卫芳等:甘草内生真菌的分离及鉴定
可以得出结论: 甘草内生白色真菌属于 Fusarium
属;甘草褐色真菌属于 G ibberella属。内生菌和寄主
之间存在着代谢相关的基因信号交流, 这对于植物
的生长与发育关系十分密切 [ 5, 9 ] , 我们将在现有工
作的基础上做进一步研究。且内生真菌资源的有效
利用对于植物资源的保护有重要的意义, 需要我们
更加深入的研究。
致谢: 本研究在获得甘草材料的过程中得到了新疆农科
院微生物研究所杨新平先生的帮助,在此表示诚挚的感谢。
参 考 文 献
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