全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-19
基金项目:内蒙古自治区自然科学基金重大项目(编号200408020402)
作者简介:侯越(1982-),男,硕士研究生,研究方向:动物学生物技术
通讯作者:吴应积,教授
引言
抗体是一种特殊的蛋白质分子,被作为体外诊
断的试剂、治疗疾病的药物、免疫亲和层析的配基
等,在生命科学研究、生物技术及医学领域中有着
广泛的应用。尤其是抗体作为各种免疫分析的核心
试剂,对免疫分析结果的灵敏度、特异性起着至关
重要的作用。在对一些与生命体功能关系密切的新
基因产物的研究中,是否拥有相应的抗体以检测与
鉴定新基因的产物蛋白质,是整个研究工作能否深
入开展的关键。
抗体技术是免疫学领域中的一个重要方面,广
泛应用于生命科学和医学各学科。从第一代抗
体——血清多克隆抗体开始,它就在疾病治疗和体
外诊断中发挥了很大的作用。由于免疫动物制备血
清抗体的免疫原性和非均质性,给抗体研究和应用
造成了困难[1],激发了人们对抗体进行深入研究的
热情。1975年 Kohler和 Milstein通过杂交瘤技术制
备出针对一种抗原决定簇的抗体即第二代抗
体——单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb),是
均质的异源抗体[2]。单克隆抗体具有高度均质性、高
度特异性,促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的
准确性,是目前应用最广泛的抗体。单克隆抗体的
出现,引起了生物学理论的革命,生物学技术的广
泛应用提供了重要的工具[3]。20世纪 80年代采用
基因工程的手段研制抗体,并对抗体的基因进行改
造和重组等,制备出第三代抗体——基因工程抗体
(geneticengineeringantibodyGEAb)。基因工程抗体
主要对现有的鼠源性单克隆抗体进行人工改造,并
抗体分离纯化技术的研究进展
侯越 罗奋华 吴应积
(内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特 010021)
摘 要: 制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败。抗体
的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗
体。但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化。重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法。对
当前的纯化方法进行了一个简要的综述。
关键词: 抗体 分离 纯化
ProgressinTechnologyofAntibodyPurificationandSeparation
HouYue LuoFenhua WuYingji
(KeyLaboratoryofEducationMinistryofChinaforMammalianReproductiveBiologyandBiotechnology,
UniversityofInnerMongolia,Hohhot010021)
Abstract: Preparationofantibodiesposesedhighspecificityandafinityisthebaseofimmunology.Thesucces
ofexperimentdependsonthequalityofantibodies.Preparingantibodieshastwoways:oneiscommonlycurent
method,tobeusedtoobtainpolyclonalantibodiesviaimmunizinganimalswithpurifiedantigen;theotherispreparation
ofmonoclonalantibodybyusinghybridomatechnique.Whatevertechnologyused,thepreparedantibodiesneedstobe
purified.Itisesentialtochoosetheproperprocedureforisolationandpurificationofanantibody,accordingto
propertiesandsourceoftheantibody.Thisreviewisfocusedonthecurentpurificationmethods.
Keywords: AntibodiesIsolation Purification
2008年第3期
通过噬菌体抗体库筛选,克隆新的单克隆抗体[4]。
不论是多克隆抗体、单克隆抗体还是基因工程
抗体,不论用何种方法制备抗体,都需要在后期对
抗体进行分离和纯化,所以根据目标抗体,选择合
适的分离纯化方式就尤为重要。
1 抗体的分离与纯化
通过不同方法制备的抗体往往与多种杂蛋白
混杂在一起,为了获得成分相对单一的抗体或将抗
体用于特定的用途,就需要对抗体进行纯化处理。
从成分的角度分析,抗体分子是一类蛋白质分子,
与其他蛋白质一样,它有一定的等电点、溶解度、荷
电性及疏水性,可以用电泳、盐析沉淀或其他层析
技术进行分离、纯化。
抗体的纯化有 2个原则:抗体的用途和抗体的
来源[5]。
(1)抗体的用途 在确定抗体的具体纯化方法
之前,首先要明确纯化后的抗体的用途,不同用途
的抗体,纯化要求也不同。
(2)抗体的来源 从多抗、单抗到基因工程抗
体,制备方法的不同导致最终所含的杂蛋白也有很
大的差异。另外重链类别、亚型、相对分子质量的不
同也将使纯化的方法间彼此有差别。目前,常用的
纯化方法主要有以下几种。
1.1 盐析法
盐类对于蛋白质的溶解有双重作用,当少量盐
类存在时,盐类分子和水分子对蛋白质分子的极性
基团产生静电作用力,使蛋白质的溶解度增大;当
大量盐类存在时,水的活度降低,带电离子破坏蛋
白质周围的水化层,使蛋白质表面的电荷被中和,
从而引起蛋白质相互聚集而沉淀。基于上述原理,
盐析法利用抗体与杂质蛋白之间对盐浓度敏感程
度的差异来分离。一般通过选择某一特定的盐浓
度,令大部分杂质呈现“盐析(沉淀)”状态,而抗体
蛋白则处于“盐溶(溶解)”状态。
目前用于盐析的盐类主要是硫酸铵,因为它的
溶解度大,对温度不敏感,分级效果好,对蛋白质有
稳定结构的作用,价格低廉,处理样品量大。
1.2 正辛酸-饱和硫酸铵法
这是一个经验性的方法,正辛酸-饱和硫酸铵
可以在偏酸的条件下沉淀血清或者腹水中除 IgG
外的蛋白质,使上清液中只含有 IgG,所以该法一
般用来纯化 IgG1和 IgG2b,不能用于 IgM,IgA的纯
化,而对 IgG3的纯化效果也不佳。在实际操作中,
正辛酸的量随抗体的来源不同而有所差异。正辛
酸-饱和硫酸铵纯化法具有下列优点:(1)快速:整
个操作过程 1d内即可完成;(2)简单易行:仅用 2
次沉淀,无需复杂的仪器及设备;(3)价格低廉:实
验中所用试剂均为普通试剂,容易得到且便宜;(4)
一次可纯化大量抗体。本法与柱层析法不同,不受
标本多寡的限制;(5)应用范围广,可用于多种动物
血清及小鼠腹水中抗体及单克隆抗体的纯化 [6]。
1.3 亲和层析法
亲和层析是利用生物活性物质之间的特异亲
和力,使目标产物得以分离纯化。可应用于任何两
种有特异性相互作用的生物大分子,如酶与底物
(包括酶的竞争性抑制剂和辅助因子)、抗原与抗
体、多糖与蛋白复合体等。正是因为利用的是生物
学特异性而不是依赖于物理化学性质,因而非常适
合于分离低浓度的生物产品。由于抗体与抗原作用
具有高度的专一性,并且它们的亲和力极强,所以
许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用
了单克隆抗体作为亲和配基。亲和层析技术具有高
收率、高纯度、能保持生物大分子天然状态等优点,
广泛的应用于生物大分子的分离纯化,特别是对含
量极少的基因工程抗体的一步纯化更显示出这一
技术的优越性。正是因为亲和层析技术的高度特异
性,才能制备出高纯度的生物大分子[7,8]。
1.4 凝胶过滤层析法
凝胶过滤层析法又称空间排阻层析,工作原理
是应用该技术进行分离的蛋白质分子具有相似的
分子结构而其分子量有差别而进行分离纯化,简而
言之,凝胶过滤层析是通过分子量的差异将蛋白质
分离开来。
应用凝胶过滤层析时,将含有抗体的溶液通过
装有多孔性介质填料的层析柱床,收集流出的抗体
组分。当样品从层析柱的顶端向下运动时,大的抗
体分子不能进入凝胶颗粒而迅速洗脱。小的抗体分
子能够进入凝胶颗粒,其在凝胶柱中的迁移被延
缓。因此,抗体分子从凝胶过滤柱洗脱的先后顺序
一般是按照分子量的大小由高到低。
侯越等:抗体分离纯化技术的研究进展 61
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
所用的大多数凝胶基质都是化学交联的聚合
物分子如葡萄糖、琼脂糖、丙烯酰胺和乙烯聚合物
制备的,交联程度控制凝胶颗粒的平均孔径。交联
程度越高,平均孔径越小,凝胶颗粒的刚性越强。在
任何给定的条件下使用什么孔径的凝胶取决于目
标抗体的分子量和主要杂质蛋白质的分子量 [9~11]。
1.5 疏水层析法
在组成蛋白质的常见的 20种氨基酸中,有 8
种氨基酸的侧链是非极性的,属疏水性氨基酸。多
数蛋白质分子都是折叠的,这样可以使其中大多数
疏水性氨基酸残基包埋在分子内部,因而与周围的
水性坏境隔离。包埋在内部的疏水性基团通常与临
近的疏水基团发生作用。不同的蛋白质分子表面的
疏水性氨基酸残基的数量和类型不同,因而表面的
疏水程度也不同。疏水层析根据蛋白质分子表面疏
水性的不同分离蛋白质,需要蛋白质表面疏水基团
和共价连接到适当基质的疏水基团之间发生疏水
作用。
由于免疫球蛋白大多是疏水的,且不同的抗体
的疏水程度也不同,所以在一般的情况下,疏水层
析能够除去大多数宿主免疫球蛋白的其他杂质。常
用的疏水层析柱材料有 PhenylSuperose和 Alkyl
Superose。但因为疏水层析的操作复杂,并无通用的
程序可循(需要大量的条件摸索),柱再生困难,洗
脱时要采用剧烈的洗脱条件等因素,目前较少采用
这种方法[12]。
2 结语
以上介绍的几种方法是目前对抗体包括蛋白
质纯化比较成熟而且常用的方法,根据不同的目的
和试验条件,可以采用比较合适的方法对所制备的
抗体进行纯化。随着抗体在生物学领域应用的不断
延伸,特别是对于一些物种的未知抗体的需求越来
越迫切,对于抗体的制备和纯化方法也将得到提高
与改进,必将出现更为有效的纯化方法,这对抗体
技术的发展和应用会是一个很大的推进。大量制备
抗体将变得更为方便,将会有更多的抗体应用于科
学研究中,促进生命科学向前发展。
参考 文献
1 陈永峰,胡建林,何正田.生命的化学,2001,20(3):250~253.
2 KohlerG,MilsteinC.Nature,1975,256:495~497.
3 朱学泰,谢溱,马瑞君.甘肃科技,2005,21(3);
4 张靖,张富昌.科技情报开发与经济,2006,16(10):10~12.
5 冯仁青,郭振泉.现代抗体技术及其应用.北京:北京大学出版
社,2006,16~20.
6 白丽,钱金木伏,王晶.大理医学院学报,2000,9(4);16~18.
7 陈勇,徐燚,应汉杰,等.离子交换与吸附,2001,17(3);
276~280.
8 孙维敏.离子交换与吸附,2005,21(3):283~288.
9 SuzanneAldington,JulianBonnerjea.JournalofChromatographyB,
2007,848:64~68.
10 DuncanLow,RhonaO’Leary,NarahariS.JournalofChromatography
B,2007,848:48~63.
11 AnaCA,RoqueClaudiaSO,Silva,M.AngelaTaipaJournalof
ChromatographyA,2007,1160:44~55.
12 GGaryWalsh著,王恒樑,等译.蛋白质生物化学与生物技术.
北京:化学工业出版社,2006,74~75.
62