全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-04-08
基金项目：国家 948 项目（2006-4-123）
作者简介：谭力（1982-），男，在读硕士，主要从事大肠杆菌代谢工程方面的研究；E-mail：tanlitanli1982@163.com
通讯作者：陈介南，Tel：0731-5623078，Fax：0731-5623078，E-mail：chenj@besti.org
木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源之
一，主要由纤维素 ，半纤维素和木质素三大成分组
成。经物理，化学及生物方法处理，纤维素和半纤维
素可分别水解成为六碳糖（葡萄糖，半乳糖和甘露
糖）和五碳糖（木糖和阿拉伯糖） [1]。 但是目前自然
界尚未发现能兼性发酵戊糖和己糖产生酒精的微
生物，理想的生物质乙醇发酵微生物应该具有发酵
所有生物质来源的糖， 其中包括五碳糖和六碳糖，
并有较高的乙醇转化效率。而传统用于乙醇发酵生
产的微生物酿酒酵母菌 （Saccharomyces cerevisiae）
和运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis）等都能很好
地利用葡萄糖，且乙醇发酵效率高，乙醇耐受力强，
但缺陷就是均不能代谢五碳糖，造成能源的浪费 [2~4]。
而能利用五碳糖的微生物大肠杆菌和克雷伯氏菌
等的乙醇生产能力非常有限，副产物多，乙醇只是
其中很小部分 [5]。 因此 ，当前纤维燃料乙醇生产中
的热点之一是对五碳糖和六碳糖共发酵过程特性
进行研究致力于构建可以高效转化木质纤维素水
解产物为乙醇的微生物菌种，来生产廉价的酒精实
现其产业化，对解决未来能源短缺以及环保问题等
都具有非常重大意义和潜在的商业价值。
在大肠杆菌中，一般用基因工程手段将运动发
酵单胞菌的两个关键基因 ， 乙醇脱氢酶 （pyruvate
decarboxylase）基因 pdc 及乙醇脱氢酶基因 （Alcohol
运动发酵单孢菌 ZM4 adhⅡ基因的克隆及在
大肠杆菌 TOP10中的表达
谭力 陈介南 张伟涛 王义强 何钢
（中南林业科技大学 生物环境科学与技术研究所，长沙 410004）
摘 要： 利用高保真聚合酶从运动发酵单胞菌中克隆出乙醇脱氢酶基因，加 A 后克隆到 pGM-T 载体，测序验证
无误。经酶切、酶连到表达载体 pUC-18。形成重组质粒 pUC-18-adhⅡ，转化到大肠杆菌 TOP10中，经定性定量分析乙醇脱
氢酶酶基因在大肠杆菌中高效表达，成功构建出乙醇脱氢酶基因的表达载体。
关键词： 运动发酵单胞菌 乙醇脱氢酶基因 克隆
Cloning of Alcohol DehydrogenaseⅡGene from Zymomonas
mobilis and Expression in Escherichia coli TOP10
Tan Li Chen Jienan Zhang Weitao Wang Yiqiang He Gang
（Institute of Biological and Enviromental Science & Technology，Central South University of Forestry and Technology，
Changsha 410004）
Abstract： The genes encoding alcohol dehydrogenaseⅡof Zymomonas mobilis was amplified by using high-fidelity
DNA Polymerase from total DNA，and cloned into pGM-T vector after added A. The vector was verified by
sequencing. The recombinant plasmid PUC18-adh Ⅱ was constructed by inserting expression vector pUC-18 after
endonucleases digesting and ligating，and then transformed into E.coli TOP10. The recombinant strains were induced by
IPTG to beexpressed. Alcohol dehydrogenaseⅡgene was expressed highly by means of quantitive-qualitative analysis，and
expression vector PUC18-adhⅡ was constructed in E.coli TOP10.
Key words： Zymomonas mobilis Pyruvate decarboxylase Cloning
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
Dehydrogenase）adh，克隆到大肠杆菌中对大肠杆菌
菌种改造，控制其细胞内的碳代谢方向使其向生成
乙醇的方向进行，增强其产乙醇能力，构建其高效
率的工程菌。目前通过类似的方法和手段已经构建
的大肠杆菌工程菌株中主要有 Ingram 构建的 PLO-
I295 质粒型表达载体、Ohta 等人设计构建外源基因
整合型菌株 K011、Hespell 设计的利用营养缺陷型
菌株 FMJ39 引入 PLOI297 构建的 FBR3/4/5[6，7]，以及
国内构建的 pGM-T-PDC、EoliPp +a、PSE-PDC-ADH
Ⅱ-teminator 等 [5]。 本研究在这基础上率先在乙醇脱
氢酶基因的结构基因前加入合适的 SD 序列， 调整
合适的 SD 与起始密码子 AUG 之间的距离 [11]，并利
用高保真的聚合酶来扩增其序列，保证其碱基的正
确性，测序结果与 GenBank 公布完全一致证明了基
因的保守性强， 将乙醇脱氢酶基因导入大肠杆菌
中，并对其转化菌株进行 SDS-PAGE 分析和乙醛平
板检测，使其在大肠杆菌中得到高效表达。 表明成
功的构建出乙醇脱氢酶基因的表达载体，为下一步
构建利用木质纤维素高产燃料生物乙醇的新型基
因工程菌，提高其乙醇产率奠定基础和提供方向。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 运动发酵单胞菌 （Zymomonas
mobilis ATTCC31821 CICC10273）购自中国工业微生
物菌种保藏中心， 大肠杆菌 TOP10 和质粒 pGM-T
购自北京天根生化科技有限公司， 表达载体 pUC-
18 购自 Takara 公司。
1.1.2 培养基 RM 培养基 （10%葡萄糖，1%酵母
膏，0.1%磷酸二氢钾，pH5.0）用于培养运动发酵单
胞菌 。 LB 培养基 （1% 蛋白胨 ，0.5% 酵母膏 ，1%
NaCl，pH7.0）用于大肠杆菌培养 ，固体培养基添加
2%琼脂。 乙醛指示平板：将 100 ml LB 固体培养基
加热溶解后加入 200 μg/ml Amp，倒平皿，并在每皿
上分别加入 20 μlmmol/L IPTG，200 μl 无水乙醇和
150 μl 无菌希夫（Schiff）试剂 [8]，避光保存。
1.1.3 主要试剂和仪器 Tris base 购自 Amersco
公司，SDS 购自 Sigma 公司，EDTA 购自上海生工生
物工程技术服务有限公司； 蛋白酶 K 购自 Merk 公
司 ，加 A 试剂盒 、PCR 纯化试剂盒 、质粒抽提试剂
盒购自北京北京天根生化科技有限公司，高保真聚
合酶 PrimeSTARTMHS、rTaq 酶、T4 DNA 连接酶、内切
酶、 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自 Takara 公司；PCR
扩增仪为 MJ Research Inc.生产的 RTC-100 型，岛津
UV-5420 紫外分光光度计。
运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶（Alcohol Dehydrog
enaseⅡ）基因 adhⅡ扩增引物：上游引物 5-ACT TC
T AGA CTG AAC GAG GAG GTC GAC GAT GGC TT
C TTC AAC TTT T-3， 含内切酶 XbaI 序列和 SD 序
列；下游引物 5-GAC CTG CAG TTA GAA AGC GCT
CAG GAA GA-３，含内切酶 PstI 序列。
1.2 方法
1.2.1 运动发酵单胞菌总 DNA 的提取 供试菌株
在 RM 液体培养基中培养至对数期后，离心收集菌
体 ，经 STE 缓冲液洗涤后 ，用 TE 悬浮菌体 ；加入
10%的 SDS 使其终浓度为 1%， 反复倒转离心管使
菌体裂解 ； 加入蛋白酶 K 至终浓度为 50 μg/ml，
37℃保温至菌液透明； 加入 5 mol/LNaCl 至终浓度
为 1mol/L， 混匀后加入等体积苯酚-氯仿抽提至界
面无蛋白 ；取上清液，经乙醇沉淀、洗涤、干燥并溶
解在低浓 TE 中，通过岛津 UV-5420 分光光度计定
量后贮存备用。
1.2.2 PCR 反应、加 A 反应和测序 每 20 μl 扩增
反应体系 ：10 ×buffer 2 μl，MgCl2 （25 mmol/L）2 μl，
dNTP（2 mol/LM）2 μl，adhⅡ（5-ACT TCT AGA CTG
AAC GAG GAG GTC GAC GAT GGC TTC TTC AAC
TTT T-3，50 μmol/L）0.5 μl，pcd2（5-GAC CTG CAG
TTA GAA AGC GCT CAG GAA GA-３，50 μmol/L）
0.5 μl， 模板 DNA 50 ng，PrimeSTARTMHS 高保真聚
合酶（2.5 U/μl）2 U，加 ddH2O 补足。反应程序：94℃
4 min；94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，30 个循
环；72℃ 5 min。
将扩增平末端产物纯化后在 3-末端加 A，反
应体系：平末端 DNA 片段 15 μl，加 A 反应液 4 μl，
rTaq 酶 1 μl。 反应条件：72℃保温 20~30 min。
将加 A 后的产物克隆在 pGEM-T 载体上，转化
大肠杆菌 TOP10，委托上海生工生物工程技术服务
有限公司测定其全序列。
1.2.3 酶切、 酶连接及阳性转化子的筛选 将经过
测序验证过的 pGEM-T经 PstI和 XbaI酶切及 T4 DNA
连接酶连，其反应体系参照说明书，酶切及酶连时
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2009年第 1期
间均过夜 。 目的片段经纯化后插入到同样酶切
pUC18 中 ， 形成重组质粒 pUC18-adhⅡ转化 E.
coliTOP10 中，在 LB-Ampr-X-gal-IPTG 平板上，筛选
得到白色转化子，再对所得白色转化子提质粒进行
电泳验证以及 PCR 验证。
1.2.4 乙醇脱氢酶定性检测 [9，10] 重组大肠杆菌在
IPTG 的诱导下能产生乙醇脱氢酶能将乙醇转化为
乙醛，乙醛与希夫试剂反应，使重组子菌落显紫红
色。 因此将重组菌株点种到乙醛指示平板上，同时
以空白质粒转入大肠杆菌作为对照， 在 IPTG 诱导
下，菌落变为紫红色表明有乙醇脱氢酶产生 ，反之
没有。
1.2.5 乙醇脱氢酶表达产物分析 将构建好的重
组质粒转化到大肠杆菌菌株 ， 挑取单菌落到含
100 μg/ml Amp 的 LB 培养液，37 ℃振荡培养过夜，
然后按 1%接种到新鲜的 LB 培养液中，37℃培养至
A600约为 0.4～0.6 时， 加入 IPTG 使终浓度达 1 mmol/
L，诱导表达 12 h，取一定体积菌液 8 000 r/min 离
心 5 min， 收集菌体， 加入 200 μl ddH2O 和 200 μl
上样缓冲液， 沸水浴 5 min 后， 取 10 μl 样品进行
SDS-PAGE 分析。
2 结果
2.1 运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因的克隆
以 Zymomonas mobilis ZM4 总 DNA 为模板 ，以
高保真聚合酶 PrimeSTARTMHS 扩增 。 PCR 产物在
1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增片断， 结果见图 1。
结果表明扩增片段大小约为 1 189 bp，与预期结果
一致。
2.2 加 A 反应和测序
将扩增平末端产物纯化后在 3-末端加 A，产
物克隆在载体上， 将构建的克隆载体 pGM-T- adh
Ⅱ转化大肠杆菌 TOP10， 送上海生工测定其全序
列，测序结果简要序列如下：
ACTTCTAGACTGAACGAGGAGGTCGAC-
Gatggctt.........gctttctaaCTGCAGGTC
下划线 TCTAGA为 XbaI的酶切位点，GAGGAGG
为 SD 序列，方框内 atg 为起始密码子，下划线 CT-
GCAG为 Pst I 的酶切位点。结构基因序列与网上公
布的 adhⅡ （登录号 ：AE008692； 片段 ：1634679~
1635830）基因一致。
2.3 表达载体 pUC18-adhⅡ的构建及重组子鉴定
克隆载体 pGM-T-adhⅡ经 Xba I 和 Pst I 双酶
切后， 与同样经 Xba I 和 Pst I 处理的 pUC18 载体
连接，连接后转化到大肠杆菌 TOP10 感受态细胞，
其构建总路线如图 2。
挑选白色重组子，提取质粒、电泳验证及 PCR
验证结果如图 3。 结果表明外源片段已经连接到表
达质粒上。 重组的表达质粒命名为 pUC18-adhⅡ。
2.4 乙醇脱氢酶的定性检测
将重组菌株接种到乙醛指示平板，37℃倒置培
养过夜，结果见图 4。 结果显示重组菌株显紫红色，
对照菌株没有呈现紫红色，说明重组菌株有乙醇脱
氢酶生成。
bp
M 1 3
1 200
1 000
图 1 adhⅡ基因的 PCR 产物鉴定电泳图
M.200 bp DNA maker；1.adhⅡ基因 PCR 产物
f1cri
AMP
pGEM-T
lacZ
pGEM-T-adhII
lac-P
Amp ori
puc18
puc18-adhII
lac-P
Amp ori
XbaI 和 pstI
酶切酶连接
PCR
加 A 反应 AA
adhII
lecZ
f1cn
AMP
图 2 pUC18-adhⅡ载体构建示意图
谭力等：运动发酵单孢菌 ZM4 adhⅡ基因的克隆及在大肠杆菌 TOP10中的表达 89
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
2.5 乙醇脱氢酶的蛋白电泳检测
TOP10（pUC-18- adhⅡ）表达蛋白的 SDS-PAGE
分析表明：重组菌株在有很明显蛋白质特征条带出
现， 而对照菌株在相同位置上没有特征条带出现，
该蛋白质分子量与基因序列推测所得理论分子量
40 kD大小一致，该蛋白质即为表达的乙醇脱氢酶。
3 讨论
要在大肠杆菌建立一个新的酒精产生途径，必
须同时在大肠杆菌中导入乙醇脱氢酶基因和丙酮
酸脱羧酶基因，使丙酮酸转化为乙醛，再有乙醛转
化为乙醇。本研究率先在乙醇脱氢酶的结构基因前
加入合适的 SD 序列 [10]，并利用高保真的聚合酶来
扩增其序列，保证其碱基的正确性，使其在大肠杆
菌中得到高效表达。 由乙醛指示平板上可以看出，
导入了丙酮酸脱羧酶的重组菌显色既红又大而没
有导入丙酮酸脱羧酶的对照菌株既显色浅又小，表
明丙酮酸脱羧酶在重组菌中得到高效表达。
虽然已经成功得到了乙醇脱氢酶的活性表达，
但还不足已利用木质纤维素的糖化产物来生产生
物乙醇 ， 要在大肠杆菌建立一个新的酒精产生途
径，必须同时在大肠杆菌中导入乙醇脱氢酶基因和
丙酮酸脱羧酶基因，使丙酮酸转化为乙醛，再有乙
醛转化为乙醇今后的工作重点是今后的工作重点
是：（1） 利用基因工程手段将另外一关键基因丙酮
酸脱羧酶基因与乙醇脱氢酶基因串联一起置于 lac
启动子，同时得到高效的共表达 [11]；（2）再通过基因
阻断等手段改造其他代谢途径，控制其细胞内的碳
代谢方向使其向生成乙醇的方向进行；（3） 受体菌
中重组质粒的自主复制及编码基因的高效表达会
大量消耗能量，由于生存竞争，不含质粒的细菌生
长速度远比含有质粒的细菌要快，经过若干代繁殖
后，重组质粒会丢失。 解决的方法可以在培养基中
添加抗生素或将外源基因整合到受体细胞染色体
的非必需编码区上， 使之成为染色体 DNA 的一个
组成部分，从而增加其稳定性。 前者在大规模生产
上添加抗生素会提高生产成本， 且造成环境污染，
而后者则是一劳永逸的方法。 因此，在下一步工作
将把目的基因整合到大肠杆菌染色体的非必需编
码区上，使之成为染色体 DNA 的一个组成部分，从
图 3 重组子的质粒电泳图
M.λHindⅢ DNA marker；1.重组质粒 pUC-18-adhⅡ；
2.质粒 pUC-18
图 4 乙醛指示平板
A.含有重组质粒 pUC-18-adhⅡ的菌株；
B.含有质粒 pUC-18 的菌株
图 5 TOP10(pUC-18-adhⅡ)表达蛋白的
SDS-PAGE 分析
M.蛋白质分子 marker；1.TOP10 (pUC-18)表达蛋白 ；
2.TOP10 (pUC-18-adhⅡ)表达蛋白
adhⅡ
（ 下转第 94页）
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
而增加其遗传稳定性；（4）采用化学，物理或者基因
突变的方法诱变得到其突变菌株。进一步改进和完
善，以期构建出高效、稳定的，能够利用木质纤维素
降解产物生产燃料乙醇的新型工程菌株。
参考文献
1 高卫华，张敏华，刘成，等.工业微生物，2004，34（1）：56~62.
2 Ingram LO，Gomez PF，Lai X，et al. Biotechnol Bioeng，1998，58：
204~214.
3 Ingram LO，Aldrich HC，et al. Biotechnol Prog，1999，15：855~866.
4 Zaldivar J，Nielsen J，Olsson L.Appl Microbiol Biotechnol，2001，
56：17~34.
5 李学凤，田沈，潘亚平，等.微生物学通报，2003，30（6）：101~105.
6 Shi Ohta，Beall DS，Mejia J，et al. Appl Envir Microbiol，1991，57：
893~900.
7 Bothast RJ，Nichols NN，et al. Biotechnol Prog，1999，15：867~875.
8 李德和，李权太，实验有机化学.济南：山东科学技术出版社，
1980.
9 Conway T，Sewell GW，Osman YA，et al. Journal of Bacteriology，
1987，169：2591~2597.
10 Conway T，Sewell GW，Osman YA，et al. Jourl of Bacteriology，1987，
169：949~954.
11 RiesenbergD，Schulz V，Knorre WA，et al. Journal of Biotechnology，
1991，20：1727.
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（ 上接第 90页）
因此构建了种子特异性表达噬夏孢欧文氏菌
crtB 基因的植物表达载体 ， 并将其转化到农杆菌
EHA105 中， 为下一步农杆菌侵染植物并在植物种
子中特异性表达八氢番茄红素合成酶蛋白做好了
充分的准备。提高植物种子八氢番茄红素的表达水
平，为在植物种子合成类胡萝卜素奠定了坚实的基
础。
参考文献
1 Hausmann A，Sandmann G. Fungal Genet Biol，2000，30（2）：147~
153.
2 Miki W. Pute Appl Chem，1991，63（1）：141~146.
3 Park J，Chew B，Wong TS，et al. Nutr Cancer，1999，33（2）：206~
212.
4 Giovannucci E，AscherioA，RimmEB，et al. J Natl Cancer Irst，1995，
87（23）：1767~1776.
5 Misawa N，Nakagawa M，Kobayashi K，et al. J Bacterial，1990，172
（12）：6704~6712.
6 Fraser PD，Schuch W，Bramley PM. Planta，2000，211（3）：361~
369.
7 Iwata-Reuyl D，Math SK，Desai SB，et al. Biochemistry，2003，42
（11）：3359~3365.
8 汪靖超，姜颖，等.青岛大学学报（自然科学版），2006，19（2）：
74~78.
图 6 转化农杆菌菌液及质粒 PCR 鉴定
M.DNA marker；1.pBI121-tp-crtB PCR；2.pBI121-GFP
PCR；3.农杆菌菌液 PCR
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