全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
重组运动发酵单胞菌的构建及木糖利用特性研究
张颖 1 　马瑞强 1, 2 　洪浩舟 1 　陆伟 1 　张维 1 　林敏 1 　陈明 1
(1 中国农业科学院生物技术研究所 ,北京 100081; 2 中国农业大学生物学院 ,北京 100193)
　　摘 　要 : 　将大肠杆菌 ( Escherich ia coli)木糖代谢的关键酶基因。引入到运动发酵单胞菌中 ,获得能利用木糖发酵生产乙
醇的重组工程菌株 PZM。混合糖发酵过程中 ,重组菌利用葡萄糖和木糖生成乙醇的效率分别达到理论值的 81. 2%和 63. 1%。
关键词 : 　运动发酵单胞菌 　乙醇 　木糖 　发酵
The Construction and Character istic Evaluation of Xylose2utiliz ing
Recombinant Zym om onas m obilis Stra in
Zhang Ying1 　Ma Ruiqiang1, 2 　Hong Haozhou1 　Lu W ei1 　Zhang W ei1 　L in M in1 　Chen M ing1
(1 B iotechnoligy Research Insititu te, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081;
2 College B iological Science, China of Agriculture University, B eijing 100193)
　　Abs trac t: 　Two poerons encoding xylose assim ilation and pentose phosphate pathway enzymes from Escherichia coli were construc2
ted and transformed into Z. m obilis. The recombination strain fermentation xylose to ethanol was achieved through a combination of the
pentose phosphate pathway and Entner2Doudoroff pathways. PZM can utilize glucose and xylose. The p roductivity of ethanol from glu2
cose was 81. 2% of theory value and 63. 1% from xylose.
Key wo rds: 　Zym om onas m obilis　Ethanol　Xylose　Fermentation
收稿日期 : 2009204201
基金项目 :“973”运动发酵单胞菌代谢途径的分子改造与优化 ( 2007CB707805) ,“863”重组大肠杆菌乙醇代谢网络的改造和优化 ( 2006AA02
Z229) ,运动发酵单胞菌高产乙醇和利用戊糖的代谢工程菌构建 (2006AA010101)
作者简介 :张颖 (19772) ,女 ,博士研究生 ,研究方向 :环境微生物的基因工程
通讯作者 :陈明 , E2mail: chenm ingbio@hotmail. com
　　近年来 ,随着石油资源日益短缺 ,油价的上涨 ,
作为补充或替代汽油的高效清洁环保燃料 ,燃料乙
醇越来越受到重视 ,但目前乙醇的生产主要以淀粉
为原料 ,造成价格偏高以及与人争粮的局面 ,大大限
制了燃料乙醇的发展。
在自然界中 ,纤维素、半纤维素和木质素是世界
上最丰富的可再生性生物资源。木质素广泛存在于
林业及农业废弃物中 ,利用酸解或酶解的方法将木
质纤维素转化为还原性糖会产生大量的五碳糖 (D2
木糖和 L2阿拉伯糖 )和六碳糖 (葡萄糖、半乳糖和甘
露糖 ) ,其中六碳糖约占 2 /3,五碳糖约占 1 /3。在半
纤维素的水解产物中 , D2木糖约占 90%。然而 ,具
有良好的工业乙醇生产应用前景的产乙醇微生物包
括酵母及运动发酵单胞菌不能有效地利用木糖为碳
源。因此 ,构建能同时利用五碳糖和六碳糖的产乙
醇工程菌 ,具有重要的实践意义。
Z1m obilis是目前惟一一种通过 ED途径厌氧发
酵葡萄糖的兼性厌氧微生物 ,具有乙醇产率高 ,发酵
速率快 ,乙醇耐受能力强等优点。但是 ,该菌的底物
利用范围窄 ,不能利用五碳糖。随着生物技术的发
展 ,利用遗传工程的手段 ,扩大 Z. m obilis底物利用
范围是目前研究的重点之一。
本研究通过克隆大肠杆菌 ( Escherich ia coli)木
糖代谢途径中编码木糖异构酶 ( X I)、木酮糖激酶
(XK)和转酮醇酶基因 ( TalB )、转酮醛酶基因 ( Tk2
tA ) ,分别融合到 Z. m obilis 32磷酸甘油醛脱氢酶基
因 ( eno)和烯醇化酶基因 ( gap)强启动子下游 ,构建
表达质粒 pBBgABeTT,转化获得 Z. m obilis重组工
程菌株 PZM ,扩大了 Z. m obilis的底物利用范围。
同时对重组工程菌 PZM发酵葡萄糖和木糖产生乙
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2009年第 7期 　　　张颖等 :重组运动发酵单胞菌的构建及木糖利用特性研究
醇的能力进行了分析。
1　材料与方法
111　菌株、质粒及培养条件
供试菌株及质粒见表 1。大肠杆菌于 LB培养
基 (NaCl 5 g/L ,蛋白胨 5 g/L ,酵母膏 10 g/L )中 ,
37℃,摇床 (200 r/m in)培养。 Z. m obilis菌株于 RM
培养基 (葡萄糖 20 g/L,酵母膏 10 g/L ,磷酸二氢钾
2 g/L , pH6. 0)中 , 30℃,静止培养。广宿主载体 pB2
BR1MCS21用于目的基因的克隆。
表 1　菌株及质粒
菌株及质粒 特性 来源
E1coli MG1655 野生型 [ 1 ]
E1coli JM109 recA1, endA1, gyrA96, th i, hsdR17, supE44, relA1, △ ( lac2proAB ) /( traD36, proAB + , laclq, lacZ△M15) 全式金公司
Z1m obilis 10232 ( ZM) 野生型 中国工业微生物菌种保藏中心
Z. m obilis PZM Plasm ids xylA, xylB , ta lB , tktA, pdc, adhB 本研究
pBBR1MCS21 穿梭质粒 , Cm抗性 Sandra K. A rm strong赠
pBBgABeTT
含有 eno2ta lB / tktA融合片段和 gap2xylA / xylB 融合片段的 pBBR1MCS21
质粒 本研究
112　DNA的克隆及重组质粒的构建
设计 Z. m obilis32磷酸甘油醛脱氢酶基因 ( eno)
和烯醇化酶基因 ( gap)启动子引物 : EnoF和 EnoR
( 5′2GGTACCATCTGCTGTCCTATATGAA23′和 5′2
GTAACCGGTCTGCCGAAACCTTTCTTA23′,下划线序
列为 Kpn Ⅰ酶切位点 ) ; GapF 和 GapR ( 5′2ACT2
AGTTAGAAACAGCAGGTTTT23′和 5′2TCACCCTTTG2
CACCTAGCTA CTATATTCC 23′,下划线序列为 S pe I
酶切位点 ) ,以 Z. m obilis基因组 DNA为模板分别
进行 PCR扩增。分别以 TalBF: 5′2CTGTCTGTCACT
CCCTTGCGGTAAATT23′和 TalBR: 5′2AGATCTGGG
AGTGACAGACAG23′(下划线序列为 B gl II酶切位
点 ) , TktAF: 5′2AGATCTTTGCGGTAAATTGTTGG23′
和 TktAR: 5′2GGGCCCGGACATATCAAGGTAATAAA23′(下划线序列为 A pa Ⅰ酶切位点 ) , XylABF: 5′2
GGAATATAGTAGCTAAGGTGAAGG GTGA23′和 Xy2
lABR: 5′2CCGCGGAAACGTTATCCCCTGCCT23′(下
划线序列为 SacⅡ酶切位点 )为引物 ,从 E. coli
MG1655基因组 DNA扩增含有完整 ta lB、tk tA和 xy2
lAB 基因片段。利用重叠 PCR融合的方法 [ 2 ] ,构建
eno2ta lB / tk tA 融合片段和 gap2xy lA / xy lB 的融合片
段。分别用 Kpn I和 B g l II酶消化 eno2ta lB / tk tA融合
片段和质粒 pBBR1MCS21,构建中间质粒 pBBeTT;
然后分别用 A pa I和 Sac II酶消化 gap2xy lA / xy lB 融合
片段和质粒 pBBR1MCS21,构建 pBBgABeTT质粒。
用电转的方法转入野生菌株 ZM ,利用氯霉素抗性
筛选得到重组菌 PZM并进行质粒验证。
113　发酵及细胞生长量的测定
Z. m obilis和重组菌株 PZM首先接菌到 RM 培
养基中 ,静止培养 OD600达到 1. 0后 ,按照 10%接菌
量 ,分别接种到 200 m l含有 40 g/L的葡萄糖或木糖
的 RM培养基中 ,以及含有葡萄糖、木糖各 40 g/L
的 RM培养基中 ,于 100 r/m in, 30℃条件下发酵。
发酵过程中 ,通过测定发酵液的 OD600值或干物
质含量分析细胞生长的情况 ,即用 H ITACH I U23010
分光光度计测定发酵液在 600 nm波长处的 OD值 ;
或采集不同的时间点的样品 (100 m l) ,经烘干后 ,测
定干物质含量。
114　糖、乙醇及其他次生代谢物质的测定
采集不同时间点的样品 ,经 0. 22 mm滤膜过滤
后 ,用 Agilent 1100 HPLC检测样品中的葡萄糖、木
糖、乙醇及其他次生代谢物质 ,包括木糖醇、乳酸、乙
酸的含量。
115　酶粗提液制备
取 2 m l菌液 ,离心收集菌体 ,加入 2 m l E2Buffer
(5 mM Tris2HCl pH7. 8, 1 mM EDTA pH8. 0, 1 mM
DTT)重悬菌体 ,于 - 80℃冻融一次 ,然后置于冰上
进行超声波破碎 (200 W ,超声 2. 0 s,间隔 2. 5 s, 10
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～20 m in)。4℃, 10 000 g离心 ,取少量上清液进行
SDS2PAGE电泳检测 ,其余上清液加入 50% (w / v)
甘油 ,混匀后于 - 20℃保存备用。
116　酶活测定
木糖异构酶 ( EC5. 3. 1. 5 )的酶活测定按照
Schellenberg[ 3 ] 描述的方法 , 在含有 0. 128 mM
NADH , 50 mM木糖 , 10 mM MgSO4 , 1 mM三乙醇胺 ,
0. 5 U山梨糖醇脱氢酶的反应液中 ,加入 50μl细胞
提取液 ,反应 15 m in;木酮糖激酶 ( EC2. 7. 1. 17)按
照 Eliasson等 [ 4 ]的方法 ,在含有 0. 2 mM NADH, 50
mM Tris2HCl(pH7. 5) , 2 mM MgCl2 , 2 mM ATP, 0. 2
mM磷酸烯醇丙酮酸 , 8. 5 mM ATP, 2. 5 U丙酮酸激
酶 , 2. 5 U乳酸脱氢酶的体系中 ,加入 10～50μl细
胞提取液 ,反应 20 m in;转醛醇酶 ( EC2. 2. 1. 2)的测
定按照 De Graaf等 [ 5 ]的方法 ,在含有 20 mM果糖 262
磷酸 , 200 mM甘油醛 , 5 mM NADH,α2甘油磷酸脱
氢酶 ( GoPD ) , 1 M二硫苏糖醇 (DTT)的反应体系中
加入 20 μl细胞提取液 ,反应 15 m in; 转酮醇酶
( EC2. 2. 1. 1)的分析按照 Sp renger等 [ 6 ]的方法 ,在
含 5 mM磷酸缓冲液 (pH7. 0, 1 mMTPP,α2甘油磷酸
脱氢酶 ( GoPD) , 54 mMD2核糖 252磷酸的体系中加入
20μl细胞提取液 ,反应 20 m in。所有反应于 30℃
条件下进行 ,分别取 0. 5 m l反应液 ,用 H ITACH I U2
3010分光光度计测定在波长 340 nm下的光密度。
酶活力单位 (U )定义 :在特定条件下 , 1 m in内转化
1微摩尔底物 ,或者底物中 1微摩尔有关基团所需
的酶量 ,称为一个国际单位 (1U ,又称 U )。
2　结果与分析
211　重组质粒的构建
从 Z. m obilis基因组中 PCR扩增获得 gap和 eno
基因启动子序列片段 ,通过凝胶电泳分析显示所克
隆片段大小均约为 450 bp (图 12A) ,与预期片段大
M1Maker; 1, 21eno, gap; 31xylAB ; 4, 51 talB , tktA; 61pBBgABeTT
图 1　重组质粒 pBBgABeTT的构建
小 (456 bp和 450 bp)相符 ;同样 , E. coliMG1655基
因组为模板 ,克隆的 xy lA / xy lB、ta lB 和 tk tA 基因序
列 ,其大小符合设计的要求 ,分别为 3. 1 kb、1. 4 kb
和 1. 98 kb (图 12B, C) ,利用重叠 PCR的技术 ,获得
携带 gap启动子序列和 xy lA / xy lB 基因序列的融合
片段以及携带 eno启动子序列和 ta lB / tk tA基因序列
的融合片段 ,片段大小分别为 3. 656 kb和 3. 75 kb。
将克隆的融合片段连接到广宿主质粒 pBBR1MCS21
上 ,得到了重组质粒 pBBgABeTT (图 12D )。对克隆
的片段进行序列测定 ,其的结果显示 pBBgABeTT携
带 eno2ta lB / tk tA 和 gap2xy lA / xy lB 片段 ,符合设计要
求。将该质粒电转化到 Z. m obilis 10232中 ,经氯霉
素抗性筛选 ,获得重组菌 PZM。
212　重组运动发酵单胞菌 PZM利用木糖的生长情况
分析重组菌 PZM与野生型菌株 Z. m obilis利用
木糖或葡萄糖的生长情况 (图 2)可以看出 , PZM与
野生型菌株 Z. m obilis利用葡萄糖的生长状况大致
相同 ,但野生型菌株不能有效地利用木糖生长。而
PZM在含有木糖作为惟一碳源的培养基中生长时 ,
尽管存在一个滞后期 ,但经过 40 h的培养后其菌体
生长量能达到其利用葡萄糖的菌体水平 ,表明 X I、
XK、TalB和 TktA的基因表达使 Z. m obilis具有能利
用木糖生长的能力 ,扩大其底物利用范围。
G1葡萄糖 ; X1木糖 ; ZM1野生型菌株 ; PZM1重组菌株
图 2　重组菌 ( PZM )利用葡萄糖和木糖的生长曲线
213　重组运动发酵单胞菌 PZM利用木糖和葡萄糖
发酵
为验证和测试重组菌发酵木糖形成乙醇的性
能 ,在含有木糖、葡萄糖以及混合糖的 RM培养基中
进行了 PZM的发酵试验。以葡萄糖 ( 40 g/L )为惟
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一碳源 , PZM在 24 h之内就完全消耗葡萄糖 ,细胞
生长量达 1. 53 g /L ,乙醇产量为 20. 5 g/L ,达理论产
量的 81. 2% (图 32A ) ;在以木糖 (40 g/L )为惟一碳
源时 , PZM在 48 h时的细胞生长量达 1. 54 g/L ,利
乙醇的产量为 12. 6 g /L ,达到理论值的 63. 1% (图
32B )。可见 ,重组菌 PZM利用木糖的效率以及生成
乙醇的效率低于 PZM 对葡萄糖利用和产乙醇的
效率。
在混合糖 (葡萄糖和木糖各 40 g/L )发酵过程
中 , PZM首先利用葡萄糖 ,在发酵 18 h时 ,葡萄糖几
乎被消耗完 ,而木糖含量为 32 g/L,仅消耗了 20%
含量 ,细胞生长量达 2. 0 g/L;发酵至 30 h时 ,木糖
含量仅为 10 g/L , 75%的木糖被利用 ,细胞生长量增
加到 2. 4 g/L ,但最终 (45 h)仍有部分木糖未被利用
(图 32C)。从菌株利用混合糖的生长曲线 (图 2)以
及对不同糖的利用情况看 ,重组菌 PZM优先利用葡
萄糖 ,在发酵的 45 h内不能完全利用木糖。重组菌
PZM混合糖发酵生成乙醇约为 31. 2 g/L乙醇。
图 3　PZM 发酵乙醇
214　重组运动发酵单胞菌利用木糖和葡萄糖发酵
中产生的次生代谢产物
重组菌 PZM在利用葡萄糖和木糖发酵的过程
中 ,尽管大部分碳源转化成乙醇 ,但同时产生一些副
产物包括乙酸、乳酸和木糖醇等 (图 4)。其中 ,产生
的木糖醇较高 ,达 2. 7 g/L;乙酸和乳酸分别为 1103
g/L和 0. 69 g/L。
215　组运动发酵单胞菌 PZM 中木糖代谢的酶活
测定
为了进一步检验外源基因转入 Z. m obilis后对
图 4　PZM 利用葡萄糖和木糖混合糖发酵的次生代谢产物
木糖分解代谢的作用 ,对重组菌 PZM细胞酶粗提液
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中 4种酶活进行了测定。发现外源基因编码的木糖
异构酶 (X I) ,木酮糖激酶 (XK) ,转醛酶 ( TAL )和转
酮酶 ( TKT)均有一定的酶活 ,它们的酶活分别为 80
U /mg蛋白、53 U /mg蛋白、1105 U /mg蛋白、180 U /
mg蛋白 (图 5)。酶活分析的结果表明来自 E. coli
的 4个基因均能在 Z. m obilis中正常表达 ,翻译成
具有代谢木糖所需的 4种功能蛋白 ,并赋予 Z. m o2
bilis细胞具有代谢木糖的能力。
图 5　重组 PZM 菌株中 X I, XK, TAL, TKT的酶活
3　讨论
在本研究中 ,把 E. coli中代谢木糖的 4个关键
的酶引入了 Z. m obilis代谢途径中 ,使运动发酵单
胞菌能够利用木糖发酵乙醇。木糖通过木糖异构酶
(X I) ,木酮糖激酶 ( XK) ,转醛酶 ( TAL )和转酮酶
( TKT)的代谢以后 ,生成 62磷酸果糖和 32磷酸甘油
醛 ,与 Z. m obilis的 ED代谢途径相偶联 ,最后生成
乙醇。
重组菌 PZM在利用木糖过程中 ,其利用率相对
较低。在葡萄糖、木糖混合糖存在的条件下 , PZM
优先利用葡萄糖。在 Z. m obilis缺乏木糖运转蛋
白 ,木糖的转运是通过 Z. m obilis细胞膜上葡萄糖
促进扩散因子 GFL运输的 ,由于 GFL对葡萄糖的亲
和力高 [ 7～10 ] ,导致 PZM优先转运和利用葡萄糖。
携带木糖代谢的支路的重组菌 PZM ,代谢过程
中 ,每分子的木糖经过木糖异构酶、木酮糖激酶的代
谢 ,在转醛酶和转酮酶催化的反应过程共产生 2分
子的 NADPH,产物 32磷酸甘油醛和 62磷酸果糖进入
Z. m obili的 ED途径产生乙醇 [ 5, 11～14 ] ;而葡萄糖代
谢中 ,每分子葡萄糖可产生 1分子 ATP以及 1分子
的 NADPH [ 15 ] ,木糖代谢支路增加了 1分子 NADPH
的产生 ,由于 Z. m obilis不具有完整的三羧酸循环 ,
限制了生物体通过呼吸作用产生 ATP的能力 ,因此
体内的 NADPH发生积累 ,对细胞产生负担 ,影响菌
体的生长及利用木糖发酵的能力 [ 9, 16, 17 ]。De Graaf
等 [ 5 ]应用 NMR的分析方法研究 ,重组菌木糖代谢
中碳代谢通量发生了明显的改变 ,以 13C作为标
记 ,发现木酮糖发生积累 ,分析木酮糖激酶是木糖代
谢途径的瓶颈酶。
在混合糖发酵过程中会产生副产物 ,副产物形
成造成碳源和能量的丢失 [ 18 ] ,其中木糖醇是主要的
副产物 ,是木糖代谢过程中的正常代谢产物。木糖
在代谢过程中有两个途径 ,一个是在木糖异构酶的
作用下异构为木酮糖 ,进入木糖发酵产生乙醇的代
谢途径。另一个途径由醛糖还原酶催化木糖生成木
糖醇 [ 19, 20 ]。木糖醇产生多 ,降低了木糖的利用率 ;
另外 ,糖代谢中乙酸、乳酸等副产物的产生也影响到
乙醇产率。而且 ,研究表明有机酸如乳酸、乙酸是
Z. m obilis 生长及发酵生产乙醇的主要的抑制
物 [ 21 ]。在混合糖发酵后期 ,副产物乙酸和乳酸的积
累可能是造成木糖不能完全利用的另一个原因。
木糖的转运、糖代谢副产物以及引入木糖代谢
途径引起能量不平衡可能是重组菌不能有效利用木
糖和乙醇产率较低的主要原因 [ 22 ]。基于以上几个
问题 ,可以利用分子生物学的技术克隆编码木糖转
运蛋白基因 ;另外 ,通过完善 Z. m obilis的三羧酸循
环途径如引入α2酮戊二酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶
基因 ,缓解因导入木糖代谢途径引起的能量不平衡 ;
通过引入通过阻断醛糖还原酶、乙酸和乳酸的合成
酶途径 ,消除副产物木糖醇、乙酸和乳酸的产生以及
减少有机酸对细胞生长、木糖利用的抑制作用 ,以此
提高重组菌木糖和葡萄糖发酵生产乙醇的效率。
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2009年第 7期 　　　张颖等 :重组运动发酵单胞菌的构建及木糖利用特性研究
参 考 文 献
1　 Heath JD, et al. J Bacteriol, 1992, 174 (2) : 558～67.
2　 ZhangM, et al . Science, 1995, 267 (5195) : 240～243.
3　 Schellenberg GD, et al. J B iol Chem, 1984, 259 (11) : 6826～32.
4　 Eliasson A, et al. App lMicrobiol Biotechnol, 2000, 53 (4) : 376～82.
5　 De Graaf AA, et al. A rch M icrobiol, 1999, 171 (6) : 371～85.
6　 Sp renger GA, et al. J Bacteriol, 1995, 177 (20) : 5930～6.
7　 Deanda K, et al. App l Environ M icrobiol, 1996, 62 (12) : 4465～
70.
8　 Kim IS, Barrow KD, Rogers PL. App l EnvironM icrobiol, 2000, 66
(1) : 186～93.
9　 Lawford HG, et al. App l B iochem B iotechnol, 2000, 84～86: 295
～310.
10　Mohagheghi A, et al. App l B iochem B iotechnol, 2002, 98～100:
885～98.
11　Saez2M iranda JC, Saliceti2Piazza L, et al. B iotechnol Prog, 2006,
22 (2) : 359～68.
12　Krishnan MS, et al. App l B iochem B iotechnol, 2000, 84～86: 525
～41.
13　Sp renger GA. A rch M icrobiol, 1995, 164 (5) : 324～30.
14　Josephson BL, Fraenkel DG. J Bacteriol, 1969, 100 ( 3 ) : 1289
～95.
15　Sp renger G. FEMS M icrobiol Lett, 1996, 145: 301～307.
16　Jeon YJ, Svenson CJ, Rogers PL. FEMSM icrobiol Lett, 2005, 244
(1) : 85～92.
17　Salamon C, et al. Genom ics, 1998, 48 (2) : 209～20.
18　D ien BS, Cotta MA, Jeffries TW. App l M icrobiol B iotechnol,
2003, 63 (3) : 258～66.
19　Lonn A, et al. Eur J B iochem, 2002, 269 (1) : 157～63.
20　N ichols NN, D ien BS, Bothast RJ. J Ind M icrobiol B iotechnol,
2003, 30 (5) : 315～21.
21　Rogers PL, et al. Adv B iochem Eng B iotechnol, 2007, 108: 263～
88.
22　Jeffries TW. Curr Op in B iotechnol, 2006, 17 (3) : 320～6.
(上接第 159页 )
参 考 文 献
1　 Pusztai A, Ewen SWB, Grant G, et al. B r J Nutr, 1993b, 70: 313
～321.
2　 L iener I. J A rch Latinoam Nutr, 1996, 44 (1) : 48～54.
3　 Zang JJ, L i DF, Piao XS, et al. A rch Anim Nutr, 2006a, 60: 245
～253.
4　 L i ZT, L i DF, Q iao SY, et al. A rch Anim Nutr, 2003b, 57: 267
～277.
5　 Makuid MO, Umapathy E, Akingbem i BT, et al. J Vet Med, 1996,
43: 75～85.
6　 Leontowicz H, Kostyra H, Leontowicz M, Kulasek GW. The Inacti2
vation of Legume Seed Haemagglutinin and Tryp sin Inhibitors by
Boiling. In: Fansman AJM, H ill GD, Huismam J, van der Poel
AFB, Eds. TecentAdvances of Research in Antinutritional Factors in
LEGUME Seeds and Tapeseed. W ageningen: W ageningen Press,
1998, 429～432.
7　马秋枝 ,王幸 ,刘强. 大豆凝集素糖配体的筛选及其对体内结合
率的影响 [硕士学位论文 ]. 南京 :南京农业大学 , 2007, 16～20.
8　王幸 ,马秋枝 ,刘强. 大豆凝集素的分离纯化和细胞凝集活性的
研究 [硕士学位论文 ]. 南京 :南京农业大学 , 2006, 37～46.
9　 Rao M, Goggin FL. Pro Natl Acad Sci USA, 1998, 95: 9750～9754.
10　Sechulze H, Saini H, Huisman J. Sci Food and Agri, 1995, 69: 501～
510.
11　Van Schukthass GK, Giglio M Benedek GB. M Immun, 1980, 17: 81
～82.
12　DouglasMW , Parsons CM. Poult Sci, 1999, 78: 91～95.
13　汤树生. 大豆凝集素与小肠的结合规律及其对大鼠免疫功能的
影响 [D ]. 北京 :中国农业大学 , 2006.
14　Evans GS. Jouna H iroshi1 of Cell Science, 1992, 101.
15　Jaffe W G. Hemagglutinins ( lectins) [ A ]. In : L iener IE. Toxic
Constituents of Plant Foodstuffs[ C ]. New York : Academ ic Press ,
1980, 73～102.
561
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