全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-10-25
基金项目:天津市科委应用基础研究重点项目(06YFJZJC02600)
作者简介:朱宏丽(1982-),黑龙江齐齐哈尔人,硕士,研究方向:癌靶向超抗原融合蛋白;E-mail:zhuhongli2005@163.com
治疗恶性肿瘤,除手术治疗外,传统的放射治疗、化学治疗等均系直接杀伤肿瘤细胞,杀伤作用虽强,
但选择性很弱,故在杀伤肿瘤细胞的同时也大量杀伤正常细胞。另一方面,机体的免疫能力不足是肿瘤发
生、发展的主要原因之一。通过提高机体的免疫力,特别是细胞免疫能力以达到治疗肿瘤的目的,是目前肿
瘤生物治疗研究的重要方向。因此,在临床实践中需要能对肿瘤细胞进行特异性杀伤的治疗方法,而可选
择性地与肿瘤细胞结合的抗体的出现为肿瘤的生物治疗提供了新的选择。
葡萄球菌肠毒素 A(staphylococcalenterotoxinA,SEA)是金黄色葡萄球菌的产物[1],是近年来研究较多
的一种细菌性超抗原[2],与普通抗原不同,无需经抗原递呈细胞(APC)的加工处理,即可直接与 APC膜上
的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子的肽结合沟外侧的高度保守区结合,使表达有 T细胞抗原受体
(TCR)Vβ区的 T细胞大量激活[2],强烈诱导细胞毒性 T淋巴细胞(CTL)活性及细胞因子的产生[3],是迄今
为止人和小鼠 T细胞的最强的有丝分裂原。由于 SEA诱导的 CTL对肿瘤细胞有强大的杀伤作用,因此应
用 SEA进行抗肿瘤治疗得到了人们的热切关注。
但是,超抗原激活 T细胞需要 MHCⅡ分子的辅助,且无肿瘤细胞特异性,这使其应用受到限制。为了
超抗原融合基因VEGF-SEA的克隆、原核表达及蛋白纯化
朱宏丽 孙嘉琳 罗金凤
(天津科技大学生物工程学院,天津 300457)
摘 要: 根据Genebank报道的VEGF(NM-003376)、SEA(A28664)基因序列,对密码子进行优化,合成血管内皮细
胞生长因子和超抗原基因序列,将VEGF-SEA基因片段插入质粒pET22b构建重组质粒pET22b-VEGF-SEA。重组质粒经
序列分析正确,转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行 IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析蛋白条带与预期一致,证明
融合蛋白原核表达成功。产物经His·BindBuferkit试剂盒纯化,纯度达到90%,这一成果为进一步研究VEGF-SEA融合
蛋白的活性及其功能,探讨超抗原抑制肿瘤生长作用奠定了基础。
关键词: 超抗原 融合蛋白 原核表达 复性
Cloning,ProkaryoticExpressionandPurificationof
VEGF-SEAGenes
ZhuHongliSunJialin LuoJinfeng
(ColegeofBiotechnologyEegineering,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457)
Abstract: AccordingtotheVEGF(NM-003376)andSEA(A28664)genesequencesfrom Genebank,theircodons
wereoptimized,andVEGF-SEAfusiongenesegmentwassynthesized.ThentheVEGF-SEAfragmentwasinsertedinto
theplasmidpET22bandpET22b-VEGF-SEA wasconstructed.Itwasverifiedbythenucleotidesequencethatthe
eukaryoticvectorwascorect,andthefusionproteinwasexpresedeficientlyinE.coli1BL21(DE3),whichwas
consistentasexpectedbySDS-PAGEanalysis.TheproductswerepurifiedbyHis·BindBuferkit,andthepurityof
targetproteinswasmorethan90%.ThisstudyestablishesabasisforfurtherstudyofVEGF-SEAfusionproteinsnatural
activityandfunctioninkilingtumours.
Keywords: Supperantigen Fusionprotein Prokaryoticexpresion Renaturation
2008年第2期
解决超抗原的无抗肿瘤特异性问题[4],与癌细胞生长有关的细胞因子被用于癌细胞的特异性定位。血管内
皮细胞生长因子(Vascularendothelialcelgrowthfactor,VEGF)就是其中很有成效的。为了有效地开发针对
癌症的特异性药物,本研究根据抗原和细胞因子的各自特性,构建成新型融合蛋白质即细胞生长因子-超
抗原融合蛋白质,促进癌细胞生长的细胞因子可以将融合蛋白质定位到癌细胞上,而超抗原则在癌细胞周
围引起抗癌的免疫反应,即超抗原依赖的细胞介倒的细胞毒作用 (Superantigendependentcelular
cytotoxicity,SDCC)。这样,就可以将这种类型的融合蛋白质特异的定位到癌细胞,并在癌细胞周围引起抗
癌的细胞毒免疫反应,为进一步研究其对肿瘤治疗作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、载体及菌株 大肠杆菌 JM109、BL21(DE3)为本实验室保存,质粒 pET22b购自 Novagen,
VEGF-pMD18-Tsimple、SEA-pMD18-Tsimple由上海生工公司合成。
1.1.2 酶类及试剂 各种限制性内切酶、碱性磷酸酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶等均购自 TaKaRa
公司,质粒提取试剂盒、DNA片段胶回收试剂盒购自博大泰克,His·BindBuferkit试剂盒购自 Novagen公
司,引物合成及 DNA测序由 Invitroge公司完成。
1.2 方法
1.2.1 基因片段的合成 根据 Genebank报道的 VEGF(NM-003376)、SEA(A28664),对密码子进行优化,
使其最适合大肠杆菌表达。由 TaKaRa公司合成含 BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的 VEGF-pMD18-Tsimple和含
XhoⅠ、HindⅢ酶切位点的 SEA-pMD18-Tsimple质粒,SEA前面加 Linker。
1.2.2 目的基因片段的扩增 以基因组 DNA为模板用 TaqDNA聚合酶用引物 P1和 P2进行 PCR反应,
扩增 VEGF和 SEA基因。
PCR扩增:先在 95℃变性 5min,加 TaqDNA聚合酶;然后 95℃变性 40s,60℃退火 40s,72℃延伸 1min,
循环 30次后 72℃保温 10min。
1.2.3 重组质粒 pET22b-VEGF-SEA的构建 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收,两种 PCR产物加 A后
连接到 pMD18-T上。SEA-pMD18-Tsimple质粒用 HindⅢ和 XhoⅠ进行双酶切,酶切产物经电泳、割胶纯化
后于 16℃,用 T4DNA连接酶连接至同样用 HindⅢ和 XhoⅠ进行双酶切的质粒 pET22b中。
VEGF-pMD18-Tsimple用 BamHⅠ和 HindⅢ进行双酶切,将
酶切产物 VEGF片段连接到 pET22b-SEA上,得到重组质粒
pET22b-VEGF-SEA(图 1)。
1.2.4 重组质粒的双酶切鉴定和 PCR鉴定 为进一步验证所
得的重组质粒是否为阳性,用所得的重组质粒和引物做 PCR鉴
定,其中重组质粒 pET22b的引物为:
上游:5-CTgCCgACCgCTgCTgCTggTCTg-3
下游:5-gCAgCAgCCAACTCAgCTTCC-3
PCR鉴定操作同前,对所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
并且对质粒进行 XhoⅠ和 BamHⅠ双酶切,酶切产物作琼脂糖凝
胶电泳检测。
1.2.5 VEGF-SEA融合基因在大肠杆菌中的原核表达 将鉴定正确的重组表达质粒 pET22b-VEGF-SEA
转化宿主菌 BL21(DE3),将转化后的菌液涂布含氨苄青霉素 100μg/ml的 LB培养平皿,于 37℃培养过夜。
次日挑取阳性克隆的单菌落接入 LB(Amp)培养基中,振荡培养。 当 OD600达到 0.5时,加入 IPTG至终浓
度 1mmol/L,于 25℃培养 4h。结束培养后以 8000r/min离心菌液 5min,收集菌体。将菌体悬浮于冰浴的
图 1 重组质粒 pET22b-VEGF-SEA的构建
朱宏丽等:超抗原融合基因VEGF-SEA的克隆、原核表达及蛋白纯化 181
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
图 4 重组质粒 pET22b-VEGF-SEA测序分析
50mmol/LTris-HClpH8.0中超声破碎,将破碎后的菌液 14000r/min离心 10min,收集上清与沉淀,进行
SDS-PAGE分析。
1.2.6 包涵体的洗涤及复性 将超声波破碎得到的沉淀用含有 2mol/L尿素的 50mmol/LTris-HClpH8.0
洗涤两次,加入变性剂(8mol/L尿素,3mmol/LEDTA,50mmol/LTris-HClpH8.0)充分搅拌,再以 14000r/min
离心 10min除去不溶物,收集上清装入透析袋中,于 50mmol/LTris-HClpH8.0缓冲液中透析过夜。
1.2.7 目的蛋白的纯化 将透析后得到的溶液用 His·Bindbuferkit试剂盒进行纯化。具体操作按照说明
书进行。大致步骤是将溶液上样到 Ni2+-charged琼脂糖凝胶柱上,用漂洗液洗去非特异性结合的杂蛋白,然
后用 3个柱床体积的洗脱液分 3次洗脱目的蛋白,每次收集到的洗脱液编号,并对其进行 SDS-PAGE法鉴
定。
2 结果与分析
2.1 重组质粒的 PCR鉴定与双酶切鉴定
VEGF-SEA基因片段长 1130bp,SEA基因片段长 700bp,通过对质粒进行 PCR扩增,并对扩增产物进
行琼脂糖凝胶电泳检测(图 2),可以看出扩增片段大小与 VEGF-SEA基因长度相符,且无非特异性扩增带
出现。切胶回收后的 VEGF-SEA基因片段连接到质粒 pET22b中,得到重组质粒 pET22b-VEGF-SEA,用 Xho
Ⅰ和 BamHⅠ双酶切获得片断,经电泳检测与 VEGF-SEA理论大小一致(图 3)。
图 2 重组质粒的 PCR鉴定
M.DNAMark 1.SEA片断 2.VEGF-SEA片断
图 3 重组质粒双酶切鉴定结果
1.pET22b-VEGF-SEA/XhoⅠ、BamHⅠ
2.pET22b-SEA/XhoⅠ、BamHⅠ M.DNAMark
2.2 重组质粒测序分析
将酶切鉴定正确的重组质粒进行测序(图 4),从测序结果可以看出其基因序列与设计的 DNA链基因
序列完全一致。证明 VEGF-SEA基因片断已被克隆到
pET22b载体中,即重组质粒 pET22b-VEGF-SEA构建成功。
2.3 融合基因 VEGF-SEA的诱导表达
将构建好的重组质粒 pET22b-VEGF-SEA转化至宿主
菌 BI21(DE3),加入 IPTG诱导 4h,离心收集菌体,超声波
破碎后分离上清和沉淀,进行 SDS-PAGE分析(图 3),由图
可以看出表达产物以包涵体形式存在,蛋白分子量约为
46kDa,与理论大小一致,而转入空质粒 pET22b的细菌总
蛋白抽提物中未出现这一条带。说明目的蛋白在大肠杆菌
中表达成功。
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3 讨论
近年来热门报道的 SAg依赖的细胞介导的细胞毒作用 (superantigendependentcelcytotoxicity,SDCC)
不同于一般抗原,超抗原[5]主要是通过大量激活 T淋巴细胞来介导杀伤肿瘤效应,被激活的 T细胞可通过
两种途径发挥其对肿瘤细胞的杀伤作用:①SAg依赖的细胞介导的细胞毒作用(superantigendependentcel
mediatedcytotoxicity,SDCC)[6]:SAg激活的 CD8+杀伤力很强的抑制 T细胞或细胞毒性 T细胞 (cytotoxicor
suppressorTlymphocytes,CTL)和 CD4+辅助性(helper)T细胞,直接或间接地杀伤表达有 MHCⅡ类分子的肿
瘤细胞。②细胞因子参与的抑瘤作用:被激活的 T细胞可释放多种细胞因子非特异地直接或间接杀伤肿瘤
细胞。这些细胞因子主要包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)等[7,8]。它们
作为 T细胞免疫应答过程中的效应阶段的重要产物,不仅直接或间接地杀伤肿瘤细胞,而且可增强肿瘤细
胞表达 MHC抗原分子,增强癌细宿主免疫系统的能力。另一方面,这些细胞因子又刺激 T细胞进一步增殖
分化,而增殖分化的 T细胞又将产生更多的细胞因子与 SDCC作用共同导致肿瘤细胞的溶解。目前研究的
超抗原主要是金黄色葡萄菌肠毒素(Staphylocclal-enterotoxinSE),其中就包括 SEA。
然而超抗原严重的毒副作用曾一度限制了其在抗肿瘤中的应用研究[9]。通过将 SEA与靶向性物质血
管内皮生长因子 VEGF[10]相连,大大降低了其副作用。靶标药物的出现充分证明了以分子为靶点治疗肿瘤
的巨大潜力,这类药物改变了传统化疗药物对所有快速分裂的细胞全面打击的方式,针对肿瘤细胞的基因
突变或基因表达异常进行治疗,对正常细胞的影响很小。这类药物的出现,标志着癌症治疗的新时代已经
到来。
成功构建了血管内表皮生长因子和超抗原融合基因表达载体 pET22b-VEGF-SEA,并且在大肠杆菌
BL21(DE3)中表达。通过 SDS-PAGE分析,观察到蛋白条带的分子量与预期的 VEGF-SEA融合蛋白的分子
量一致。因此,VEGF-SEA融合蛋白在 pET22b载体中表达成功。表达产物以包涵体形式存在,并且通过用
His·Bindbuferkit试剂盒进行纯化,纯度已达到 90%以上。
(下转第187页)
2.4 目的蛋白的纯化
采用 His·Bindbuferkit试剂盒对透析后的溶液进行纯化,对所得溶液进行 SDS-PAGE分析(图 6),可
以看到漂洗液中并无蛋白,说明蛋白已吸附到胶粒上,并且由洗脱液洗脱下来,蛋白电泳图谱表明,目的蛋
白已经得到了较好的纯化,其纯度在 90%以上。
图 5 SDS-PAGE电泳图
M.蛋白 Mark 1.pET22b(BL21)对 照 2.pET22b-VEGF-
SEA(BL21)超声后上清 3.pET22b-VEGF-SEA(BL21)超声
后沉淀 4.pET22b-VEGF-SEA(BL21)诱导后全菌抽提
图 6 VEGF-SEA蛋白纯化的 SDS-PAGE分析
M.蛋白 Mark 1.pET22b-VEGF-SEA(BL21)纯化
漂洗液 2.pET22b-VEGF-SEA(BL21)纯化洗脱液
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(上接第183页)
这一研究成果为进一步探讨该靶向治疗癌症药物打下基础,并且扩大了其应用范围,为其在抗肿瘤应
用方面开创了新的思路。在未来的肿瘤化疗发展中,可以预计除了细胞毒类的传统化疗药物会继续发展
外,针对分子靶点的新一代抗肿瘤药物将凭借其特异性与靶向性,在抗癌治疗中发挥重要作用,成为抗癌
治疗的主要方向。
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由上述结果可以看出,无论组成型启动子 P43,还是诱导型启动子 Pspac,均能启动 gfp基因在 1A751和
BL21中的表达,说明构建的重组载体 pBE-GFP+具有较好性能,并有较广泛的适用性。
3 讨论
GFP蛋白具有较高的检测灵敏度,结果直观,在多种生物体中均能正确表达和折叠,这些优点使得它
逐渐广泛用于基因启动子及调控序列的研究。采用经遗传改造的 gfp基因突变体 gfp+为报告基因,其蛋白
产物 GFP+的灵敏度大大高于野生型基因蛋白产物。构建所用质粒 pBE2同时具有 pUB110和 pGEM3的复
制起始位点,且在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均具有较高的拷贝数。因此,该检测体系可以实现在两种不同
类型原核生物中表达绿色荧光蛋白的目的,具有较广泛的适用性。
通过对两种不同类型启动子组成型启动子 P43和诱导型启动子 Pspac的检测,确认构建所得 pBE2-gfp+
启动子检测体系在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均能得到很好应用。
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