全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
小单孢菌属特异寡核苷酸探针的设计及杂交条件优化
李玉梅 李莉 彭双 闫淑珍
(南京师范大学生命科学学院 江苏省微生物工程技术研究中心 ,南京 210046)
　　摘 　要 : 　小单孢菌在生态环境中占有重要地位 ,也是寻找新的抗生素的重要来源。为了探索小单孢菌的生态分布和在
未培养情况下的生态位 ,在分离和鉴定一定数量的小单孢菌的情况下利用小单孢菌属的 16S rDNA基因同源性 ,采用 ClustalX
软件进行序列分析 ,设计了小单孢菌属的 16S rRNA特异寡核苷酸探针 Mn1和 Mn3两个序列 ,将这两个序列与 GenBank中小
单孢和非小单孢菌属的 16S rRNA序列进行 B lastn比对分析 ,先在理论上确认 Mn1和 Mn3对小单孢菌属是特异的。收集小单
孢和非小单孢菌株 19株 ,通过原位杂交试验的方法对设计的探针进行特异性验证 ,结果证明 ,Mn1能和试验用到的所有小单
孢菌属的标准菌株杂交和非小单孢菌均不能杂交 ;Mn3能和所有小单孢菌属的标准菌株杂交 ,但也能与链霉菌 CGMCC41891
(S treptom yces m icroflavus)杂交。初步证明 Mn1可作为小单孢菌属的特异性探针。并通过杂交条件试验优化了 Mn1荧光原位
杂交的条件 :甲酰胺浓度为 30% ,溶菌酶处理时间为 37℃ 40 m in, HCl处理时间为 60 m in,杂交时间为 3 h。
关键词 : 　小单孢菌 荧光原位杂交 特异探针设计 杂交条件
Construction of a New O ligonucleotide Probe Spec if ic for
M icromonospora and Optim ization of the Hybridization Conditions
L i Yumei L i L i Peng Shuang Yan Shuzhen
( J iangsu Engineering and Technology R esearch Center forM icrobiology, College of L ife Sciences, N anjing N orm al University, N anjing 210046)
　　Abs trac t: 　 In order to exp lore the ecological distribution of the cultured and uncultured of the m icrom onospora, on the condition
of isolation and identification of a certain number of m icrom onospora , two new p robes, which have been named asM n1 and M n3, were
designed based on the 16S rDNA homology. Comparative analysis of 51 sequences of 16S rDNA including those of members of the
fam ily m icrom onospora and of other bacteria was carried out. Comparisons of M n1 and M n3 against the GenBank database by using
the NCB IBLASTN p rogram verified that M n1 and M n3 are specific for m icromonospora theoretically. Then whole2cell hybridization
was performed with 19 strains by using M n1 and M n3 p robes , which demonstrated that M n1 was specific for m icromonospora and
M n3 can also hybridese with S treptom yces m icroflavus. The op timal fluorescence in situ hybridization test conditions forM n1 were the
formam ide concentration in hybridization buffer 30% , lysozyme p rocessing time for 37℃ 40 m in, HCl p rocessing time for 60 m in, hy2
bridization time 3h.
Key wo rds: 　M icrom onospora F ISH Desigetion of specific p robe Hybridization conditions
收稿日期 : 2009210220
基金项目 :江苏省普通高校自然科学研究计划资助项目 (07KJB180063)
作者简介 :李玉梅 (19822) ,女 ,在读硕士 ,研究方向 :土壤微生物的应用 ; E2mail: liyumei111@126. com
通讯作者 :闫淑珍 ,副教授 ,研究方向 :微生物的应用 ; E2mail: yanshuzhen@ njnu. edu. cn小单孢菌属于放线菌 ,其生存环境十分广泛 ,在土壤及水生环境、低温环境、碱性环境均有分布 ,一般分离的小单孢菌数量仅占放线菌总数的5% ,被认为是稀有放线菌。但姜成林等 [ 1 ]的研究结果表明小单孢菌在云南境内的湖底泥中是优势菌 ,占放线菌总数的 30% ～90%。国外的研究工 作者也从各种环境中分离到不同的小单孢菌。Ze2nova等 [ 2 ]在他们的研究中发现 ,在草场生态系统中 ,链霉菌和小单孢菌是主要的菌群 ,春季植被根系土壤中的小单孢菌密度甚至超过链霉菌。近几年 ,从海洋中分离到大量小单孢菌 ,有研究表明M icrom onospora在海洋微生物类群中占主导地位
2009年第 12期 李玉梅等 :小单孢菌属特异寡核苷酸探针的设计及杂交条件优化
者之一 [ 3 ] 。
小单孢菌在自然生境中分布的广泛性也决定了
其在自然生境中的重要地位 ,所以探测小单孢菌在
某一生境中的生态位分布显得尤为重要。但是小单
孢菌生长缓慢 ,且菌落小 ,容易被优势放线菌覆盖 ,
用传统的平皿分离法只能分离到很少的且易于被分
离出的常见小单孢菌 ,大部分的小单孢菌不能被分
离到 ,不能精确地提供其在自然生境中的数量和生
态位分布。分子生物学方法如 SSR、ISSR、AFLP、
RAPD、SSCP和 DGGE等的应用为研究微生物种群
和鉴定微生物提供了新的途径。但是 ,这些基于
PCR的方法可能会在扩增反应中引入误差 ,降低了
所得信息的精确度。荧光原位杂交 ( fluorescence in
situ hybridization, F ISH )技术作为一种不依赖 PCR
的分子分析技术 ,是以上各种分子标记技术的有益
补充 ,并同时提供形态学、数量、空间分布与细胞环
境方面的信息 [ 4 ] ,使人们可以对自然生境中的微生
物进行动态地观察和鉴定 [ 5 ]。
目前 ,关于小单孢菌属的 16S rDNA 特异性探
针的研究和应用尚未见报道。为了小单孢菌生态学
研究的发展 ,在利用网络数据资源的条件下构建小
单孢菌属的特异性探针 ,研究其特异性和杂交条件
可对今后研究某一生境中小单孢菌属的生态位分布
有所帮助。
1　材料与方法
111　供试菌株
CGMCC11258 ( M icrococcus lu teus ) , CGM2
CC411160 (N oca rd ia fusca) , CGMCC411280 (M icrotet2
raspora cyaneovirid is ) , CGMCC411479 ( A ctinoplanes
ph ilippinensis ) , CGMCC411485 ( P rom icrom onospora
citrea ) , CGMCC411265 (M icrom onospora fu lvoviola2
cea) , CGMCC411268 (M icrom onospora brunnescens) ,
CGMCC411050 ( M icrom onospora cha lcea ) , CGM 2
CC41891 ( S treptom yces m icroflavus ) , ACCC10134
( Escherich ia coli) , C ICC10152 ( B acillus subtilis ) ,
CGMCC11879 ( S taphy loccocus au reus R osenbach )1CGMCC411487 (M icrobispora rosea subsp1aerata) ,
CGMCC411101 ( Am pu lla riella pek inensis ) , CGM 2
CC11178 ( Pseudom onas aerug inosa ) FJ262995,
FJ262994, FJ262996, FJ262997。
112 小单孢菌属 16S rRNA寡核苷酸特异性探针
的设计
从 GenB ank中收集小单孢菌属各种代表菌
株的 16 SrRNA序列 ,以及非本属的序列 (表 1 ) ,
采用 C lusta lX软件进行序列比对 ,在 16 S rDNA高
度可变区中查对小单孢菌属特异的序列 ,并对该
序列进行分析 ,从中设计出特异探针。对特异探
针采用 DNA club软件进行评价 ,以验证探针的可
用性。
表 1 小单孢菌属探针设计中所使用的菌株及
GenBank中的序列接受号
菌株 登录号
M icrom onospora chokoriensis strain HBUM82563 EU841701
M icrom onospora fulvoviolacea X92619
M icrom onospora. krabiensis AB196716
M icrom onospora. aurantiaca strain Marseille AY569009
M icrom onospora. yulongensis X92626
N ocardia. exa lbida strain IFM0803 AB187522
N ocardia. seriolae strain MS00018 AB255702
M icrobispora sp. AB454509
Escherich ia coli strain KesE99 EU919568
S taphylococcus aureus L37597
B acillus subtilis strain A405 AF058767
A rthrobacter g lobiform is X80736
Luteococcus japonicus Z78208
S treptom yces lu teogriseus strain ES_62con EU934092
S treptom yces sp. EU998645
A ctinom yces turicensis strain APL10 X78720
A ctinom yces. catu li strain CCUG 41709 AJ249328
D actylosporangium m atsuzakiense strain B138 EU240416
D actylosporangium fulvum D86942
Frankia sp. BCU110501 DQ336135
M ycobacterium sp. S8 EF467851
M ycobacterium. fortuitum strain UMT2M2 EU982464
Therm oactinom yces sp. JAM2FM1001 AB362275
Therm om onospora chrom ogena strain S22216 AM932261
M icrom onospora aurantiaca strain R tII145 EU274369
M icrom onospora carbonacea strain R tII90 EU274365
M icrom onospora eburnea strain R tII69 EU274362
541
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
续表
菌株 登录号
M icrom onospora m arina strain HBUM174737 EU841638
M icrom onospora. fu lvoviolacea strain M2 FJ262994
M icrom onospora sp. strain M1 FJ262995
M icrom onospora yulongensis strain M3 FJ262996
M icrom onospora sp. strain M6 FJ262998
D actylosporangium vinaceum strain DSM 43823 NR_026294
A ctinoplanes sp. HBDN08 FJ770217
Prom icrom onospora citrea strain DSM 43110 NR_026240
A ctinoplanes sp. HBDN08 FJ770217
Planom onospora sphaerica strain JCM 9374 NR_024779
Pseudom onas aeruginosa FJ665510
M icrobispora m esophila strain JCM 3151 NR_024838
N ocardiopsis sp. YIM C20 EU135731
Rhodococcus sp. Z25 FJ752527
M ycobacterium lentiflavum strain GR22466 FJ754639
A ctinom yces bovis X81061
A ctinom adura m adurae NR_026343
A ctinom adura m adurae strain 11075 EF371432
Prom icrom onospora sp. MJ23 GQ250445
M icrotetraspora ferruginea U48845
M icrotetraspora angiospora 48843
M icrococcus flavus strain LW4 DQ491453
S treptom yces a lbiaxia lis AB249952
S treptom yces m utom ycini AB249951
113 探针的特异性验证
使用标准菌株与探针杂交来验证探针的特异
性。试验设置阴性对照为不加探针 ,阳性对照采用
通用探针 EUB338[ 6 ]。
11311 菌体固定 细菌的培养和固定方法参考文
献 [ 7 ] ,购买菌株培养方法和培养基参照菌保中心
建议。待菌体长到对数期时用灭菌的牙签小心挑取
菌丝体到无菌的研钵中 ,加入适量的无菌过滤的 1
×PBS轻轻研磨 ,收集研磨菌体到 15 m l灭菌离心
管中 ,振荡器上充分振荡 , 6 000 r/m in离心 5 m in,
弃去上清 ,加入新鲜配制的 4%多聚甲醛 [ 7 ]固定菌
体 ,置于 4℃冰箱固定过夜 ,用 10 m l 1 ×PBS洗涤两
次 , 6 000 r/m in离心 5 m in,加入 4 m l 95%乙醇 /PBS
( v /v = 1∶1) ,振荡器充分混匀 ,置于 - 20℃保存。
11312 　荧光原位杂交 取 10μl适当浓度稀释的
固定菌体悬液 ,点样于单凹载玻片的凹槽中 (载玻
片事先用明胶包埋 [ 7 ] ) ,自然风干。分别用 50%、
80%、95%乙醇依次脱水 3 m in,风干后 ,加入 20 g/L
溶菌酶 40μl,置于 37℃培养箱中 40 m in[ 8 ]。无菌
去离子水冲洗 ,以除去溶菌酶 ,自然风干 ,再加入
1 M HCl 40μl,置于 50℃烘箱中 60 m in。无菌去离
子水冲洗 ,自然风干 ,加入 2 ×SSC 40μl,置于 37℃
培养箱中 30 m in,无菌去离子水冲洗 ,用 50%、
80%、95%乙醇再依次脱水 3 m in,自然风干。将上
述载玻片放入铺有湿润滤纸的盒中 ,加入 10μl杂
交溶液至样品上。取 1μlMn1探针溶液加入 99μl
杂交缓冲液制成杂交液 ,探针用 Tris2EDTA溶解 ,制
成浓度为 600 ng/μl探针溶液。杂交缓冲液成分 :
019 M NaCl, 20mM Tris2HCl pH712, 011% SDS[ 9 ] ,
35%甲酰胺。放入杂交炉中 , 46℃避光杂交 3 h,杂
交结束 ,用预热 48℃的洗脱缓冲液 48℃洗脱 30
m in。洗脱缓冲液成分 : 160 mM NaCl , 20 mM Tris2
HCl pH716, 5 mM EDTA pH 810洗脱完成后 ,用无
菌去离子水冲洗 3次 ,自然风干。置于荧光显微镜
下观察。
114 探针杂交条件探索
以小单孢菌 CGMCC411050为研究对象对设计
的探针进行杂交条件探索 ,方法如下。
甲酰胺浓度的优化 :保持洗脱缓冲液中 NaCl浓
度和杂交温度不变 ,逐渐改变甲酰胺浓度 ,甲酰胺浓
度分别设置为 0、10%、20%、30%、40% ,其余杂交
条件不变。相同试验条件下重复 3次。
溶菌酶处理时间的确定 :用 20 g/L 溶菌酶处
理 ,处理时间分别设置为 0, 20, 40, 60, 80 m in,其余
杂交条件不变。相同试验条件下重复 3次。
杂交时间的确定 :保持杂交温度和洗脱缓冲液
中 NaCl浓度不变 ,将杂交时间分别设置为 0 h, 1 h,
2 h, 3 h, 4 h,其余杂交条件不变。相同试验条件下
重复 3次。
HCl处理时间 :用 1M HCl处理 ,处理时间分别
设置为 0, 30, 60, 90, 120 m in,其余杂交条件不变。
相同试验条件下重复 3次。
641
2009年第 12期 李玉梅等 :小单孢菌属特异寡核苷酸探针的设计及杂交条件优化
2 试验结果及分析
211　小单孢菌属探针的设计及评价
在 ClustalX软件在小单孢菌属的 16S rDNA高
度可变区中查对特异序列 ,结果如图 1所示。筛选
的两条特异性序列命名为 Mn1和 Mn3。在相当于
M. m irobrigensis 16S rDNA序列的 1010～1030的位
置设计了 Mn1: 5′2TTTTGCGGCCATGTCAAA23′,在
1140～1160 的位置设计了 Mn3: 5′2AACGCGCTG2
GCAACATCGAACG23′。
图 1　C lusta lX比对原核生物不同种属的 16S rD NA序列
采用 GenBank中 B lastn软件对 Mn1和 Mn3的
特异性进行检测。从检测结果可知 ,与 Mn1和 Mn3
相匹配的大部分为小单孢菌属 ,还有不可培养的克
隆产物 A ctinobacterium 220466 ( FJ429826 )和 Poly2
m orphospora sp. YIM61359 ( FJ214343)。
利用 DNAClub软件对这两个探针进行引物评
价 ,从评估结果可以得知 Mn1和 Mn3的杂交温度分
别在 47℃和 60℃, G + C含量分别为 44%和 59%。
212 杂交试验验证设计探针的特异性
采用 19株代表性的标准菌株验证上述设计探
针的特异性 ,试验结果见表 2。其中选用的 7株小
单孢菌菌株都能与 Mn1杂交 ,杂交信号明显 ,而其
他非小单孢菌的菌株与 Mn1杂交时均没有杂交信
号 ,所有菌株与通用探针 EUB338杂交时均有荧光
信号 ;Mn3能和试验用到的所有小单孢菌属的标准
菌株杂交上 ,但也能与链霉菌 ( S treptom yces m icrofla2
vus)杂交 ,且有较强的杂交信号 ;由此可以初步确定
Mn1对小单孢菌属是特异的。从表 2可以看出 ,与
Mn1杂交的 7株小单孢菌中 ,荧光信号的强弱不同 ,
菌株 CGMCC411268和 CGMCC411050的荧光信号
较强 ,而其他 5株小单孢菌的信号则较弱 ,能依稀分
辨出有菌丝体杂交上。部分菌株的荧光原位杂交结
果见图 2～图 5。
表 2 小单孢菌属探针 M n1和 M n3对
标准菌株进行杂交试验的验证结果
菌株 Mn1 Mn3 EUB338
A ctinoplanes philippinensis - - +
M icrococcus luteus - - +
M icrotetraspora cyaneoviridis - - +
M icrobispora rosea subsp. aerara - - +
Prom icrom onospora citrea - - +
N ocardia fusa - - +
M icrom onospora brunnescens + + + + + +
M icrom onospora fulvoviolacea + + +
M icrom onospora chalcea + + + + +
Escherich ia coli - - +
B acillus subtilis - - +
S treptom yces m icroflavus - + +
S taphyloccocus aureus Rosenbach - - +
FJ262995 + + +
FJ262994 + + +
FJ262996 + + +
FJ262997 + + +
Pseudom onas aeruginosa - - +
Am pullariella pekinensis - - +
注 : +表示强杂交信号 ; - 表示无杂交信号
741
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
213 探针 Mn1的杂交条件优化
小单孢菌属特异性探针 Mn1四种杂交条件下
的结果如图 6示 ,随着甲酰胺浓度增加 ,直到 30%
时杂交信号基本不变 ,荧光信号强度较强 ,当达到
40%时荧光强度突然下降 ,所以选择甲酰胺的浓
度为 30 %。其余 3种杂交条件下荧光信号强度
都是先增强后减弱 ,溶菌酶的最佳处理时间为
40 m in,最佳杂交时间为 3 h,最佳 HCl处理时间为
60 m in。此种杂交条件下探针 Mn1的荧光原位杂交
结果如图 7。
3　讨论
小单孢菌在自然生境中分布广泛 ,所以探测小
单孢菌在某一生境中的生态位分布就显得尤为重
要。F ISH技术为复杂自然环境样品提供一种鉴定
和定量微生物以及了解微生物群落动态变化的方
法。Eschenhagen等 [ 10 ]用 F ISH技术监控两个不同
活性污泥系统微生物结构的变化以及根据特异探针
推测聚磷菌的组成和分布 ,在试验中发现 Tetraspha2
era spp . 是主要的聚磷菌 ,但同时也观察到像 M i2
croluna tus spp. 和 Rhodocyclus group其他的聚磷菌。
W att等 [ 11～13 ]用 F ISH 技术分析了生长小麦根系的
土著细菌、假单胞菌、丝状菌的量以及分布情况。小
单孢菌是产基内菌丝的放线菌 ,目前对菌丝体微生
物的杂交很少有报道 , Delos Reyes[ 14 ]曾报道过含有
分枝菌酸的放线菌诺卡氏菌的杂交 ,在菌体固定剂
的选择和处理时间以及洗脱温度上做了探索 ,但对
其杂交条件没有作深入的研究。
杂交条件对荧光原位杂交试验的结果很关键 ,
杂交条件处理不好 ,容易造成假阳性和假阴性 [ 15 ]。
841
2009年第 12期 李玉梅等 :小单孢菌属特异寡核苷酸探针的设计及杂交条件优化
试验对设计的小单孢菌的特异探针 Mn1的杂交条
件进行了探索。小单孢菌是革兰氏阳性菌 ,较之革
兰氏阴性菌 ,其细胞壁较厚 ,细胞渗透性差 ,探针很
难进入其菌体内 ,容易导致杂交结果出现假阳性。
溶菌酶可破坏细菌的细胞壁 ,使之松弛从而让探针
更易进入。试验结果表明随着溶菌酶的处理时间延
长 ,荧光信号强度也逐渐增强 ,当溶菌酶达到 60 m in
时 ,杂交上的菌体数量开始下降 ,原因是溶菌酶处理
时间过短起不到破坏细胞壁的作用 ,探针不能很好
的进入菌体内 ;处理时间过长很容易破坏菌体的细
胞壁 ,导致菌体内的 rRNA渗漏。
HCl可作用于菌体细胞壁 ,使探针更易于进入
细菌体内 , HCl还可以灭活蛋白酶 K和细胞内的过
氧化物酶 [ 8 ] Taguchi等 [ 16 ]在进行 F ISH之前 ,用 HCl
预处理可以减少来自荧光标记寡核苷酸探针非特异
性吸收的背景荧光以及减少大量的杂质。试验中随
着 HCl处理时间延长 ,荧光杂交信号先增强后减
弱 ,尤其是当 HCl处理时间达到 120 m in时 ,明视野
下完全看不到菌丝体 ,只看到存留的孢子 ,分析原因
是 HCl的作用太强 ,处理时间过长 ,将菌丝体溶解
掉了 ,也可能是长时间的 HCl处理使菌体与明胶载
片的附着力减低 ,从而在后续的流水冲洗以及洗脱
缓冲液冲洗时将菌体冲洗掉了。
本试验从 4个方面优化了 Mn1的杂交条件 ,在
该杂交条件下 ,Mn1可以与试验中所有的小单孢菌
标准菌株杂交上 ,但同一杂交条件下各小单孢菌的
荧光信号强度 ,杂交数量都有差异 ,小单孢菌 411268
的杂交信号最好 ,其次是 411050; 411265的信号最
差 ,能看到有菌丝体杂交上 ,但是不清晰。分析原因
是在相同的杂交条件和菌体的培养时间下 ,Mn1更
易进入 411268的菌体内与 rRNA结合 ,是因为在进
行菌体固定时 411268正处于旺盛的对数生长期 ,其
菌体内 rRNA含量非常多 ,从而使探针能与更多的
rRNA结合。而杂交信号弱的菌株在杂交时不是处
于旺盛生长期。因此在验证一个探针和一个菌株杂
交时单纯的 1～2个杂交试验是不够的 ,必须在了
解菌株的生长特性的基础上进行多个反复杂交试
验。同样 ,验证一个探针对某个属或种的特异性
时 ,要对多个菌株进行多个反复杂交试验后排除
假阳性和假阴性的结果 ,才能确定一个探针的特
异性。
试验设计的小单孢菌属的特异性探针可用于检
测某一生境中小单孢菌的数量及生态位分布 ,同时
杂交条件的优化也为菌丝体这类微生物的杂交提供
了参考。
参 考 文 献
1　 姜成林 ,徐丽华 ,许宗雄 ,放线菌分类学. 昆明 :云南大学出版
社 , 1995, 127.
2　 Zenova GM , Zvyagintsev DG. M icrobiology, 2002, 71 ( 5) : 570～
　　574.
3　 Maldonado LA, Stach JE, Pathom2aree W , et al. Antonie Van Leeu2
wenhoek, 2005, 87 (1) : 8～11.
4　 Choi BK, Paster BJ , Dewhirst FE, et al. Infect Immun, 1994, 62
(5) : 1889～1895.
5　 Raap AK. Mutat Res, 1998, 400 (1～2) : 287～298.
6　 Daim s H, Ram sing NB, Schleifer KH, et al. App l Environ M icrobiol,
2001, 67 (12) : 5810～5818.
7　余利岩 ,徐平 ,姚天爵.中国抗生素杂志 , 2000, 25 (6) : 401～406.
8　 Fazi S, Amalfitano S, Pizzetti I, et al. Syst App l M icrobiol, 2007, 30
(6) : 463～470.
9　 H icks RE, Amann R I, Stahl DA, et al. Enwiron M icrobiol, 1992, 58
(7) : 2158～2163.
10　 Eschenhagena M, Schupp lerb M, Roske I. W ater Res, 2003 , 37
(13) : 3224～3232.
11　W att M, Hugenholtz P, W hite R, et al . Environ M icrobio, 2006, 8
(5) : 871～884.
12　 Lee TJ , Kawaharasaki M , M atsumura M , et al. Environmental
　　Technology, 2002, 23 (7) : 747～755.
13　Coskuner G, Curtis TP. J App lM icrobiol , 2002, 93 (3) : 431～437.
14　Delos Reves FL, R itterW , Raskin L. App l Environ M icrobiol, 1997,
1107～1117.
15　宋琳玲 , 曾光明 , 陈耀宁 , 等. 微生物学杂志 , 2007, 27 ( 1 )
40～44.
16　Taguchi T, Shinozaki Y, Takeyama H, et al. J M icrobiol Methods ,
2006 , 67 (2) : 373～380.
941