全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 刀了口百付 口乙 年增刊
黑籽南瓜 一 反应体系的正交设计优化
曹晖 杨正安 韩曙 蔡晓琳 张应华
云南农业大学园林园艺学院 , 昆明
摘 要 以云 南个旧黑籽南瓜叶片基因组 为模板 , 固定反应程序 , 采用 。 , 正交试验设计的方法 ,
对影响 一 反应的五因素 , , ‘ , 引物 ,鞠 聚合酶 , 模板 在四个水平上进行优化试验。 研
究建立起 了适于云 南黑籽 南瓜 一 的最佳反 应体 系 闪反应体 系中含 闪、 巧
〕 、 、 林 引物 、 , 聚合酶、 模板 。 扩增程序为 ℃预 变性
而 , ℃ 变性 , ℃退火 , ℃延伸 , 进行 个循环 , 最后 ℃延伸 。 该优化体系的建立为今后用
标记技术进行黑籽南瓜种质资源的分类鉴定和遗传多样性研究莫定 了基础 。
关键词 黑籽南瓜 反应体系 正交设计 优化
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4 0 林m o F L p ri m e r. T h e p C R a m P lifi e a-
tio n p ro e e d u re u se d in th is stu d y w a s a s fo llo w : p re d e n a tu re a t 9 5℃ fo r sm in , t h e n 9 4 ℃ fo r 4 5 5 , 5 2 ℃ fo r 4 5 5 , 7 2 ℃ fo r
9 05 , fo r 3 5 e y e l e s , fi n a l l y e x t e n d e d a t 7 2 ℃ fo r 7 m in . T his optim ized sy stem w ould p lay an im port ant ro le in fu rt h er researeh
of elassifieation , i d e n t i fi e a t i o n a n d g e n e t i e d i v e rs i t y o n C “c u rb it a 万c如lia by ISSR m oleeular m ark er.
K ey w ords: C琳urbita fi e如lia Bouehe ISSR R eaetion system O rthogonal desi邵 Oprim izat ion
黑籽南瓜 (Cuc ur占ita 万e如lia Bouehe)系一年生
或多年生草本 , 因种皮黑而得名 , 是南瓜属中喜温 、
不耐热的短 日照作物 。 原产中美洲至南美洲 , 现主
要分布在世界上低纬度 、高海拔地区 , 我国以云南丽
江地区栽培最早 , 至今已有 10 0 多年的历史 川 。 黑
籽南瓜食用价值不高 , 但因具有发达的根系 、极好的
抗冷性 、抗病性等特点 , 综合性状优 良 , 成为瓜类作
物的主要砧木之一 。 尤其在温室栽培中 , 黑籽南瓜
被广泛用作嫁接黄瓜的砧木 , 以提高黄瓜抗病及抗
低温能力 。 云南省多数地区都适于黑籽南瓜的生
长 , 是国内的主产区 。 但是 , 对黑籽南瓜种质资源的
研究相对滞后 , 本实验旨在建立一个可靠的 IS R -
PCR 反应体系 , 为采用分子生物技术对云南黑籽南
瓜进行种质资源评价 、鉴定 、性状分子标记以及遗传
图谱构建等研究提供技术基础 。
I S S R ( I
n t e r S i m p l e S e q u e n e e R e p e a t
, 简单重复序
列区间分子标记)是 zietkiewiez等[’]于 1994 年创建
的一种基于 PCR 分子标记技术 , 其原理是根据真核
基金项目:云南农业大学校青年基金项目(AZ o Zo 2)
作者简介:曹晖 (1984 一 ) , 男 , 山东济宁市充州人 , 硕士研究生 , 从事植物生物技术研究
通讯作者:张应华 , r e l : 0 5 7 1 一2 2 77 2 4 , E 一 m ai l : z h an 群h@ publie · k m · y n · c n
生物杖 术通报 Bio te ch n口勿舒 2008 年增刊
生物基因组中广泛存在的简单重复序列·(S im p le se -
q
u e n c e
R
e
p
e a t
,
S S R
) 设计单一引物 , 引物通常为 15
一 2 4 碱基序列 , 由 1 一 4 个碱基为基序的串联重复
和几个非重复的锚定碱基组成 , 从而保证引物与基
因组中 S R 的 5 ’或 3 ’末端结合 , 对相距较近 、方向
相反的 SSR 序列之间的 D N A 片段进行扩增 。 I S R
分子标记操作技术与 RA PD 标记相同 , 具有简便 、快
速和成本低廉的优点 , 由于其引物较长 、退火温度较
高的特点和 S R 在真核生物基因组中的广泛性 , 其
多态性和稳定性明显优于 RA P D 标记技术 , 现正在
广泛地应用于生物的品种鉴定 〔’] 、遗传构图[4〕、 基
因定位 、遗传多样性等方面的研究〔’〕。
IS S R 分子标记技术基于 PCR 反应 , 受多种反应
因素的影响 , 不同物种对反应条件的要求也存在一
定的差异 。 因此 , 采用 IS R 分子标记技术时应首先
对其反应体系进行优化筛选 〔“, , 〕。 正交设计能用少
量试验 , 提取关键信息 , 并且简单易行 , 了解各因素
之间的内在规律 , 较快地找到最优水平的组合〔8〕。
利用正交设计 ,从 dN TP s, M g , + , 引物 , Ta q D N A 聚合
酶和模板 D NA S 种因素4 个水平 , 对黑籽南瓜 IS R
一 P C R 反应体系进行优化分析 , 以建立适合黑籽南
瓜 IS R 反应的最佳体系 。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用黑籽南瓜材料采自云南省个旧市牛街
镇 , 2 0 07 年9 月于云南农业大学园林园艺学院实验
室内播种 , 采集嫩叶提取 D N A 。
1
.
2 试剂
ISSR 引物876 (GA CA G A CA G AC AG A CA ) , 由北
京赛百盛生物公司合成 。 d N T p s 、 M g C 1 2 、 Ta g D N A
聚合酶和 DN A m arker(D12 000 )购自北京天根生物
工程公司 , 其它试剂为国产分析纯 。
1
.
3 云南黑籽南瓜基因组 DN A 提取
采用改良过的 CTA B 法提取 DN A , 取嫩叶于液
氮中研磨 , 加人 CTA B 裂解缓冲液 (2% CTA B , 1 . 4
m
o
l/ L N
a
C I
,
1 0 0 m m
o
l/ L p H 8
.
0 T ri
s
一
H C I
,
1 0 m m
o
F
L E D T A
,
0
.
2 %
p
一琉基乙醇 ) , 酚抽提 , 氯仿抽提 , 用
异丙醇沉淀、 70 % 冰乙醇洗涤 , 干燥后加人 TE 缓冲
液溶解 D N A , 0 . 8 % 的琼脂糖凝胶电泳检测 D NA 质
量后 , 保存于 一 20 ℃冰箱中备用 。
1
.
4 优化 IS R 一P C R 反应体 系的正交设计
为确定黑籽南瓜 IS R 一P C R 反应的最适扩增条
件 , 经初步筛选 , I S R 引物 876 ( G AC A GA CA G A -
cA GA c A )作为此次正交试验的引物 。 采用 5 因素
4 水平 L , 6正交试验设计 , 对 dNTPS、 M g , ‘ 浓度 、引物
浓度 、 Ta q D N A 聚合酶浓度 、模板 D N A 进行筛选 。
反应体系的总体积为 25 闪 , 重复3 次 , 方案如表 1 和
表2 。
表 1 IS R 一 P C R 反应体系的因素 一 水平
水平(体系终浓度)肠vels (6n己 C on ee n tra tion )因素 Fac tors 1 2 3 4
dNTP s(mm ol/ L)
引物(协m oF L)
p ri m er( 卜m o F L )
M g Z 十 ( m m o F L )
Taq
D N A 聚合酶(U/25卜L )
T aq D N A p oly m e ras e ( U / 2 5 卜l )
模板D N A (ng /25闪)
DNA tem plate (ng /25协l )
0 .2 0
0 .5 6
2 .5
2 .0
60
5 1)C R 反应条件
PCR 扩增程序为 :95 ℃ 预变性 5m in , 94 ℃ 变性
455 , 5 2 ℃ 退火 455 , 7 2 ℃延伸905 ,进行 35 个循环 , 最
后 72℃延伸7m in , 4 ℃ 保存 。
年增刊 曹晖等:黑籽南瓜 IS R 一P C R 反应体系的正交设计优化 199
1.6 电泳
pC R 反应结束后 , 取 10林l 样品 , 加 2林L 6 / 上
样缓冲液混合 , 在 1.5% 琼脂糖凝胶中电泳 。 以
D IZ o o 作为分子量标准 ,每孔上样 6林L 。 电泳缓冲
液为 1 x TAE , 电泳电场强度为 sv/ cm , 嗅化 乙锭
(EB )染色 , U vi 凝胶成像系统下 , 观察拍照 。
表2 IS R 一P C R 反应的因子水平 L 16《45 )正交试验设计
编号 dN T I、 引物(卜m ol/ L ) M gZ 腼酶(U/25林l) 模板 DNA (ng/ 25林l)
1 0 .0 5 0 .3 2 1. 0 0 .5 15
3045615巧
l0
1l
l2
l3
0 .15
0.20
0.5
1.0
l4
l5
0.5
2.0
16 0 .20 0 .56 1.0 1 5 30
2 结果与分析
依据琼脂糖电泳条带的强弱和杂带的多少做直
观分析 。 从图 l 中可 以看到 , 从片段数量来看 , 在
16 种处理组合中 , 以处理 3 、处理 4 、处理 7 、处理 8 、
处理 9 、处理 ro 扩增出的片段最多 ,处理 1 、处理 11 、
处理 12 、处理 13 、处理 14 最少 。 从片段亮度来看 ,
可以看出不同处理中相同分子量的扩增片段存在亮
度上的差异 。 以处理 11 、处理 12 、处理 13 、处理 14
扩增的片段亮度最强 。 说明 PC R 平均产物量最大 ,
其次为处理 6 、处理 7 、处理 9 、处理 ro 。 处理 3 、处理
4 的片段亮度最低 。 综合扩增片段数量和片段亮度
可知 , 处理 3 、处理 4 、处理 7 、处理 8 、处理 9 、处理 10
的片段数显著多于其他处理 , 虽然其相互之间无明
显差异 ,但综合扩增有效片段数和扩增片段亮度分
析可知处理 10 应该是相对较好的组分浓度 。 即最
佳处理体系为 :含 1 x PC R 缓冲液 、 2 . s m m o F L
M g C I :
、
1
.
5 U Ta g D N A 聚合酶 、 0 . 1 5 m m o F L d N T P s 、
0
.
40 林m 0 F L 引物 、巧 ng 模扳 DN A , 体系总体积
25 闪。 从片段亮度来看 , 处理 ro 与处理 11 、处理
12 、处理 13 、处理 14 等亮度较强的处理不存在显著
差异 。 说明该体系可 以扩增出足够多量的 PC R 产
物 。
图 1 黑籽南瓜正交设计的 IS R 扩增结果
M :M ark er (DIZ (X) 0);1 一 16 :不同因子的处理组合
(下转第212 页)
生物杖术通报 B to te ch nolo gy 200 8 年增刊
2.3 继代培养条件对芽继代增殖的影响
继代苗的生长速度和节间长度随温度的差异 ,
有很大的不同 。 当培养温度超过 28 ℃时 , 容易发生
玻璃化现象 , 温度超过 30 ℃ 时 , 玻璃化现象可达
40% , 严重影响了芽的增殖 , 而且玻璃化苗也不利于
生根 。 当温度在 25 ℃左右时 , 继代苗生长速度 、节
间长度适中 , 而且基本无玻璃化现象。 当温度低于
20 ℃时 , 继代苗生长缓慢 , 节间短 , 因此最佳培养温
度为25 士 2 ℃ 。
此外光照对继代苗的生长也有着非常重要的作
用 。 研究表明 , 在较强自然光条件下 ,继代苗生长较
快 , 叶片浓绿伸展 , 玻璃化现象少 。 在较弱光照条件
下 , 生长速度变慢 , 叶片萎蔫发黄 , 并易出现玻璃化
苗 , 所以较强自然光是继代苗生长的必需条件。
3 结论
通过研究表明 , 适当浓度的6 一B A 和 N A A 配合
使用 , 能明显促进贴梗海棠芽的增殖和伸长生长 。
采用附加 6 一B A 0 . 5 g/ m L , N A A 0 . 5 岁m L 的 M S 培
养基 , 在25 土 2 ℃ 、强光培养条件下对贴梗海棠芽进
行培养的增殖效果最佳 , 这对建立贴梗海棠组培高
效体系及加速其推广具有重要的参考价值。
参 考 文 献
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( 上接第 199 页)
3 讨论
IS SR 是一种基于 PC R 反应的分子标记技术 , 其
扩增谱带虽较 R A PD 标记稳定 , 但同样受到多种因
素的影响 ,为了获得稳定 、可靠的谱带 , 必须对其影
响因素进行优化 , 构建适合研究物种的 IS R 一P c R
反应体系与扩增程序 。 传统的 IS R 一P C R 最佳反应
条件的优化一般采用单因子实验进行 , 这样做不仅
耗时耗力耗材 , 更主要的是没有考虑到各个反应物
在反应过程中的动态相互作用 , 正交实验正好可克
服这一缺点【9] 。 利用正交法进行实验设计 , 对 Is -
SR 一P C R 反应体系中的重要因素即模板浓度 、引物
浓度 、 d N T Ps 浓度 、 Ta q D N A 聚合酶用量进行了探
讨 。 结果通过一次实验取得了理想的结果 , 即节省
时间又减少耗材 , 降低了实验成本 。 因此 , 对不同实
验条件下的 PCR 反应体系进行优化 , 正交试验设计
是一种值得借鉴的方法 。
每一环节的操作不当均可导致扩增结果不能重
复;除了本试验优化的 5 种因素外 ,还有扩增反应中
的变性温度 、不同引物的退火温度及复性温度 、 PC R
扩增仪等因素的影响 , 因此 , 在反应条件一旦确定
后 , 整个试验过程中就应保持不变 , 同时还应注意尽
可能地使用同一厂家的药剂和同一 PCR 仪等设备 ,
以提高 IS R 分析结果的重复性和可靠程度 。 为使
实验结果优劣的判断中减少主观性 , 避免人为误差 ,
在以后的实验中迫切需要对 PC R 反应结果建立客
观标准 , 以便更客观准确的对实验结果进行评价 。
参 考 文 献
蔡克华. 长江蔬菜 , 19 9 4 ( 6 ) : 9 .
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