全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第1期
收稿日期:2007-08-14
基金项目:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基本科研业务费专项基金创新团队(编号:ywf-td-3)
作者简介:康俊梅(1972-),女,内蒙古集宁市人,博士,从事牧草、草坪草遗传育种研究;E-mail:kangjmei@yahoo.com.cn
通讯作者:杨青川,E-mail:qchyang66@yahoo.com.cn
引言
虫害是造成农作物减产的重要原因之一,减少
虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途
径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害
造成的损失达 14%,直接给农业生产造成的经济损
失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水
稻减产 10%、小麦减产 20%、棉花减产 30%以上[1]。
采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然
可以减轻害虫对农作物的为害,但化学农药造成环
境污染,生物杀虫剂成本较高。长期以来,大量喷施
化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性,使益虫及
其它生态区系遭受破坏,而且严重污染环境,提高
生产成本,破坏生态平衡。因此,减少杀虫剂使用
量,发展现代植物保护技术,已成为可持续发展农
业中必须正视的课题之一[2]。20世纪 80年代迅速
崛起的植物基因工程技术为植物抗虫育种开辟了
新的途径,已引起了许多育种工作者的高度关注。
1 抗虫基因
1.1 来源于微生物、细菌中的抗虫基因
1.1.1 Bt杀虫晶体蛋白基因 最早用于植物抗虫基
因工程的杀虫基因来源于苏云金芽孢杆菌(Bacilus
thuringiensis),它是一种革兰氏阳性土壤芽孢杆菌,
在形成芽孢时,可产生杀死昆虫幼虫的蛋白质,即
通常所说的
杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalprotein)或 δ-
内毒素(δ-endotoxin),也称苏云金芽孢杆菌毒蛋白
(Bttoxicprotein)。它是目前世界上生产量最大的生
物农药杀虫剂,广泛用于防治农业、林业等方面的
害虫[3]。Bt杀虫晶体蛋白是一类分子量为 130~160kD
的蛋白质,在昆虫中肠碱性和还原性的环境下,被
降解成 65~75kD的活性小肽,并和中肠纹缘膜上的
受体结合。现已证明受体为氨肽酶氮和钙粘着蛋白
(cadherin)类似物[4]。与受体结合的活性小肽插入到
细胞膜上并形成穿孔,使细胞膜周质和中膜腔之间
的离子平衡破坏,引起细胞肿胀甚至裂解,从而导
致昆虫瘫痪或死亡[5,6]。
自 1901年首次从患猝倒病家蚕中分离出苏云
金杆菌(Bacilusthuringiesis,Bt)以来,目前已发现
植物抗虫转基因工程研究进展
康俊梅 1 熊恒硕 1 杨青川 1 孙彦 2
(1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100094;2中国农业大学动物科学技术学院草地研究所,北京 100094)
摘 要: 较系统地介绍了植物抗虫基因的来源及遗传转化方法,提出了抗虫基因工程潜在的问题及解决途径,并
对抗虫转基因植物的前景作了展望。
关键词: 基因工程 遗传转化 害虫抗性 转基因植物
ProgressonGeneticEngineeringofPlantforInsectResistance
KangJunmei1 XiongHengshuo1 YangQingchuan1 SunYan2
(1InstituteofAnimalScience,CAAS,Beijing100094;2InstituteofGrasslandScience,CAU,Beijing100094)
Abstract: Inthisreview,wesystematicalyintroducedsomeinsect-resistancegenesderivedfrom bacteriaand
plantsandotherbeingliving,andfocusprimarilyonthemethodsofgenetictransformation.Theproblemsandfindinga
wayoutoftheproblem,andthefuturedevelopmentinengineeringofinsect-resistanceplantarediscused.
Keywords: Geneticengineering Genetictransformation Insectresistance Transgenicplants
2008年第1期
Bt对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直
翅目和食虫目等昆虫有毒杀作用,还能防治线虫、
螨、原生动物和扁形动物;Bt具有高特异的杀虫活
性,主要是因为它能产生杀虫晶体蛋白(insecticidal
crystalproteins,ICPs),编码杀虫蛋白的基因称为晶
体蛋白质基因,简称 Cry基因[7]。1981年,第一个杀
虫晶体蛋白基因被克隆和测序[8]。据统计,截止 2004
年 1月已经发现 299种杀虫晶体蛋白基因,分属于
44群 (其中 Cry基因 42群,Crt基因 2群),136个
模式基因[9]。最近几年,又相继发现了兼抗鳞翅目
和鞘翅目的 Bt毒蛋白(CryV)、抗线虫的 Bt毒蛋白
(CryVI)。大多数苏云金芽孢杆菌株系可产生几种
晶体蛋白(Cry蛋白),每一种 Cry蛋白寄主范围相
当狭窄[10]。1987年,世界上有 4个实验室首次报
道获得转 Bt杀虫晶体蛋白基因的烟草或番茄植
株[3,5,11],此后 Bt基因被相继转入到棉花、水稻、玉
米、苹果和核桃等作物中。美国用农杆菌介导法将
Bt基因导入壳籽棉,育成世界上首例抗虫棉,棉铃
虫为害率下降 50%。我国是继美国后育成抗虫转基
因棉的第二个国家,育成中国第一代单价抗虫棉的
抗虫性在 90%以上,减少用药 60%～80%,增产 30%
～40%。
1.1.2 营养杀虫蛋白基因 营养杀虫蛋白是另一
类高效杀虫蛋白质,它的敏感害虫是另一种对 Bt
毒蛋白不敏感的重要农业害虫——鳞翅目的小地
老虎。目前已发现了 3个营养杀虫蛋白:从腊状芽
胞杆菌 (Baciluscereus)培养物中分离出的 Vip1、
Vip2和从苏云金芽孢杆菌(Bacilusthuringiensis)培
养物中分离出的 Vip3A。这类蛋白可能与敏感昆虫
表皮细胞,尤其是柱状细胞相结合,造成细胞分解,
伴随着肠道严重受损,受害昆虫迅速死亡。昆虫摄
食 Vip3A与 Bt毒蛋白致毒症状类似,但 Vip3A发
症时间要长些。日前 Vip3A基因已获克隆,对它的
研究也比较深入[12]。
1.1.3 来源于其他微生物的抗虫基因 异戊烯基
转移酶(IPT)是细胞分裂素合成中的关键酶,来源
于 Agrobacteriumtumefaciens的 IPT基因,IPT基因
在烟草、番茄中表达后,可减少烟草夜蛾对叶片的
损伤,并降低桃蚜的生存力。然而,IPT基因的表达
对植物发育有负面影响,如使根系发育不全,降低
叶绿素含量等[15]。
胆固醇氧化酶基因来源于链霉菌,胆固醇对细
胞膜的完整性和功能是必需的。因此,胆固醇氧化
酶对昆虫有一定的毒性[13]。胆固醇氧化酶是胆固醇
代谢过程中的一个关键酶,能催化胆固醇分解成 4-
胆甾烯-3-酮和过氧化氢。胆固醇氧化酶的杀虫谱
相当宽,对鞘翅目、鳞翅目、双翅目、直翅目和同翅
目的害虫都有不同程度的作用[14]。
1.2 来源于高等植物的抗虫基因
1.2.1 蛋白酶抑制基因 蛋白酶抑制剂(Proteinase
Inhibitor,PI)是自然界含量最丰富的蛋白种类之
一,是植物天然防御系统中的一部分,可抵抗食草
动物的侵食。其机理在于能与昆虫消化道内的蛋白
消化酶相互作用,形成酶抑制剂复合物,阻断或减
弱消化酶的蛋白酶水解作用,刺激消化酶的过量分
泌,使昆虫产生厌食反应,导致非正常发育或死亡。
1936年,Kunitz等[15]首先从牛胰脏中分离出碱
性胰蛋白酶抑制因子(basicpancreatictrypsininhibitor
BPTI,也称 kunitznorthrop型抑制因子)。1946年,
Kunitz[16]又从大豆中分离了胰蛋白酶抑制因子,并
将其结晶化,证实了它们均为蛋白质,由此揭开了
蛋白酶抑制因子研究的序幕。目前,至少有 14种蛋
白酶抑制基因转入作物中。其中令人注目的是豇豆
胰蛋白酶抑制剂 (CowpeuTrypsinInbibitor,CPTI)、
马铃薯蛋白酶抑制剂-Ⅱ基因(PotatoProteinaseInhi
bitor-Ⅱ ,PI-Ⅱ ) 及 水 稻 巯 基 蛋 白 酶 抑 制 基 因
(Oryzacystatin)。Hinder等[5]应用 CaMv35S基因启动
子使豇豆(Vignaunguiculata)胰蛋白酶抑制剂基因
在烟草中组成型表达,是利用植物自身基因来控制
害虫的范例,饲喂实验表明,CpTI1%的表达量可以
延缓烟芽夜蛾(H.virescens)幼虫生长,增加幼虫死
亡率,减轻植物的损失;田间试验表明其对玉米夜
蛾(H.zea)也有抗性[17]。巯基蛋白酶抑制剂(TPI)对
玉米根部害虫(Diabroticaspp.)和根结线虫亦有明
显的抑制作用[18]。1992年底,中国农科院生物技术
研究中心郭三堆[19]等人首先人工合成 Bt基因后,
又对豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因进行修饰,
构建了同时带有这两种基因的双价杀虫基因高效
植物表达载体,通过花粉管通道转化技术导入我国
不同棉花生产区的主栽品种,已获得了数个双价转
康俊梅等:植物抗虫转基因工程研究进展 15
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
基因抗虫棉株系。双价抗虫转基因棉花研制成功并
开始大面积进入田间试验,标志着我国在抗虫棉方
面的研究已取得了较大的进展[25]。
1.2.2 淀粉酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因分
布较广,以禾谷类作物和豆科植物种子中的含量最
为丰富,在植物对病虫害侵染的天然防御系统中起
着重要的作用[20]。这类酶抑制剂能抑制昆虫消化道
内 α-淀粉酶活性,使食入的淀粉无法水解,阻断了
昆虫主要能量来源,并刺激昆虫过量分泌消化酶,
通过神经系统反馈产生厌食反应。Lajolo等(1985),
研究了普通大豆中 α-淀粉酶抑制剂的生化特性及
对害虫的抑制作用[21]。Gibbs等(1998)对小麦 α-淀
粉酶抑制剂的特性进行相关研究[22]。我国徐成勇等
(1999)从土壤中筛选到形成淀粉酶抑制剂的产生
菌 S-2-35菌株,并对其代谢产物的分离及其理化
性质进行了深入研究[23]。
1.2.3 植物凝集素基因 菜豆凝集素(PHA)是第
一个被描述具有抗虫作用的凝集素。Gatehouse[24]等
(1984),实验表明 PHA对四纹豆象的幼虫具有毒
性。雪花莲凝集素基因(GNA)是从雪花莲中分离克
隆,对稻飞虱、叶蝉、蚜虫等有毒性作用。现在 GNA
基因已作为一种抗虫基因转化许多作物。黄大昉等
(1997)[25]报道来源于掌叶半夏和半夏的凝集素对
麦管蚜、棉蚜、桃蚜等有致死作用。凝集素抗虫的作
用机制可能是在昆虫肠腔部位与糖蛋白结合,降低
膜透性,从而影响营养物质的正常吸收,同时诱发
病灶,促进消化道内细菌繁殖,使昆虫得病或引起
拒食、生长停滞甚至死亡。
目前研究较多且成功用于植物抗虫基因工程
的凝集素基因有:雪花莲凝集素(GNA)基因、豌豆
凝集素(P-Lec)基因、麦胚凝集素(WGA)基因和半
夏凝集素(PTA)基因。另外有研究报道,稻胚凝集
素可以与 N-乙酰葡萄胺专性结合,具有与麦胚凝
集素相似的杀虫活性,能阻碍昆虫的正常发育过
程,导致其发育迟缓甚至死亡。凝集素虽可用来杀
虫,但有些凝集素对哺乳动物也有显著毒性,如麦
胚凝集素。因此,某些凝集素不适合用来转基因。而
有些凝集素,如豌豆凝集素和雪花莲凝集素对哺乳
动物的毒性相对较小,是抗虫转基因工程的研究重
点。GNA对刺吸式口器的害虫如蚜虫、褐飞虱等同
翅目害虫及线虫具有抗生效应。Gatehouse等(1996)[26]
将 GNA基因转入马铃薯,发现 GNA可延缓马铃薯
桃蚜的发育期,降低其生殖力,抑制其种群生长。袁
正强等(2001)[27]用定点突变方法对编码雪花莲凝
集素(GNA)前体蛋白的 DNA序列进行了改造及其
转基因烟草(NicotianatabacumL.)抗蚜性的研究,
结果表明,将 GNA编码序列中含有的稀有密码子
改造后,GNA的表达水平从占总可溶性蛋白的
0.17%增加到 0.25%,转基因烟草的抗蚜性也随之
增强,从平均抑制桃蚜(Myzuspersicae(Sulzer))虫
口密度的 63.7%提高到 71.0%。目前成功转入 GNA
基因的植物有油菜、马铃薯、水稻、甘薯、甘蔗、向日
葵、烟草、番茄和葡萄等,均表现出有抗虫性。半夏
凝集素(PineliaTernataAgglutinin,PTA)的粗提液
对刺吸式口器的同翅目昆虫如棉蚜、桃蚜等有显著
的致死作用。张磊等(2003)[28,29]构建了以 CaMV35S
为启动子,新霉素磷酸转移酶(Npt-Ⅱ)为选择标
记,带有半夏凝集素基因(PTA)的 pCAMBIA2200
植物双元表达载体,应用根癌农杆菌 EHA105遗传
转化了四倍体菘蓝。
1.2.4 来源于高等植物的其他抗虫基因 来源于
高等植物的其他抗虫基因有几丁质酶(Chitinase)、
色氨酸脱羟酶 (TryptophanDecaiboxylase,TDC)、核
糖体灭活基因 (RibosomeInactiveProtein,RIP)、豌
豆脂肪氧化酶(Pealipoxygenase)、番茄素(Tomatime)、
多酚氧化酶(PPO)和脂氧化酶(LOX)都对昆虫有毒
害作用。
1.3 来源于昆虫自身的抗虫基因
昆虫神经激素是昆虫三大激素的一种,它控制
着昆虫许多关键的生理过程,影响昆虫的生长、变
态、生殖、代谢和行为等。近年来,人们已开始在基
因工程中利用昆虫神经激素防治害虫。目前已证明
转蝎毒素基因的作物对取食的害虫有毒性[30]。
2 转化方法
2.1 农杆菌介导法
农杆菌是一类革兰氏阴性土壤杆菌,主要有根癌
农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)。
根癌农杆菌含有肿瘤诱导质粒(Ti),Ti质粒上含有
可转移 DNA(T-DNA)区、毒性区(Vir区)、结合转移
区(Con区)和复制起始区(Ori区)4部分。其中与冠
16
2008年第1期
瘿瘤生成有关的是 Vir区和 T-DNA区。T-DNA区
在农杆菌侵染植物时可以插入植物基因组中,使其
携带的基因在植物中表达。农杆菌作为一种天然的
植物基因转化系统,其介导的转化属于一种纯生物
学的方法,与其它转化方法相比具有明显的优点:
①转化频率高;②可导入大片段的 DNA,且导入植
物细胞的片段确切;③导入基因拷贝数低,大多只
有 1~3个,表达效果好,稳定遗传,多数符合孟德尔
遗传规律;④农杆菌转化方法使用的技术和仪器简
单。因此,农杆菌介导法是目前应用最广泛的转化
方法。该方法的不足之处是主要适合于双子叶植物
的基因转化[31]。
2.2 聚乙二醇法(PEG法)
PEG介导基因转化是植物遗传研究中较早建
立且应用广泛的一个 DNA直接转化系统。主要原
理就是聚乙二醇、多聚-L-鸟氨酸、磷酸钙高 pH值
条件下诱导原生质体摄取外源 DNA分子。这种方
法具有在转化过程中避免嵌合体产生、易于选择转
化体及受体植物不受种类限制等优点,但缺点是只
局限于转化原生质体和未脱壁或酶解脱壁不完全
的小细胞团(50~100细胞)且转化率较低。
2.3 基因枪法
基因枪法,又称微弹轰击法(microinjectilebomb
ardment),是由康乃尔大学 Sanford等[32]在 1987年
建立的基因导入方法。其原理是将 DNA包裹于微
小的金属钨或金粒的表面,在高压下使金属颗粒喷
射,高速穿透受体细胞或组织,使外源基因导入受
体细胞核并整合表达的过程。之所以选择钨或金作
为子弹,在于它们在植物细胞和原生质体中呈现惰
性,不会影响植物细胞或原生质体正常的生理活
动。迄今为止,该法已成为除了农杆菌介导转化法
以外应用最广泛的基因转移技术。基因枪转化法与
其他遗传转化法相比,具有无宿主限制,受体类型
广泛,可控程度高,操作简便快速等突出优点,但具
有转化率较低(与农杆菌转化法相比)、稳定遗传的
比例小及成本较高等缺点。
2.4 电穿孔法(electroporation)
电穿孔法又称电激法,是在高压电脉冲作用下
在新鲜分离的原生质体的质膜上形成可逆性的瞬
间通道,从而发生外源 DNA的摄取。电穿孔法对植
物细胞不产生毒性,而且转化效率较高,特别适用
于瞬间表达。但是,该法易造成原生质体损伤。
Nyman等(1992)用电穿孔法成功地把 GUS基因转
移到草莓原生质体中[33]。
2.5 显微注射法(microinjection)
显微注射法是 Pena等 1987年首创用于基因
转化,用该法进行基因导入前,通常需要先把原生
质体或培养的细胞固定在低熔点的琼脂糖上或用
聚赖氨酸处理使原生质体附着在玻璃平板上,也可
通过一根固着的毛细管将原生质体吸附在管口,再
进行操作。该方法的优点是转化效率高,无特殊的
选择系统,但必须以精细的显微操作技术和低密度
的培养为基础,同时,需要注射大量的细胞或原生
质体,比较费工费时。因此,该方法比较适合大细胞
的操作,主要用于动物的基因转化。沈世华等
(2001)直接对离体的玉米子房注射,然后进行光照
培养,3~4周后获得种子,避免了组织培养与再生
[34]。
2.6 花粉管通道法
花粉管通道法是利用在有性生殖的授粉受精
过程中使外源 DNA沿着花粉管进入胚囊,转化尚
不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞的方
法即是花粉管通道法。其优点是利用整体植株的卵
细胞、受精卵或早期胚细胞转化 DNA,无需细胞、
原生质体等组织培养和诱导再生植株等一整套人
工培养过程,操作十分方便,一般育种工作者易于
掌握。可以任意选择生产上的当家品种进行外源
DNA的导入,单胚珠和多胚珠的单双子叶植物均
可利用这一技术。缺点是这一方法的成株转化率较
低,影响因素多,如受体植物的受精过程及时间规
律,导入 DNA的浓度、分子结构及片段大小等[35]。
除此之外,基因的转化方法还有很多,不管选
择哪一种,重要的是选择最适合所要研究的基因转
化对象,当然也可以选择两种甚至多种方法结合使
用,也许会有更优的效果。例如,明小天等(2001)利
用基因枪将根癌农杆菌细胞直接轰击到水稻的愈
伤组织中,可以明显的提高其转化效率[36]。
3 抗虫基因工程潜在的问题及解决途径
伴随着抗虫基因工程的进展,其在应用方面潜
在的问题也日益显露。近年来,随着转基因植物的
康俊梅等:植物抗虫转基因工程研究进展 17
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
商品化进程加快,有关生物安全性问题已成为人们
研究和关注的热点[37,38]。
3.1 昆虫的抗性问题
害虫的抗性是指一个种群在遗传基础上降低
了对某一种杀虫剂的敏感性。1988年,McGauhey[40]
报道了仓库谷物害虫-印度谷螟在 Bt选择压力下,
繁殖 75代后,对 Bt杀虫剂的抗性增加 90~100倍。
对这一问题的解决办法,目前常用的方法有:(1)使
用组织特异性表达启动子和损伤诱导启动子等特
殊的启动子[41];(2)采取两个或两个以上不同杀虫
机理的抗虫基因同时转入植物中[42];(3)提供“避难
所”(Peferoen,1997)[43]等。
3.2 “基因沉默”现象
无论是哪种来源的抗虫基因用于基因工程,首
要考虑的问题就是提高其表达量。一般来说,表达
量越高,抗虫效果就越好。导入的抗虫基因翻译水
平不高是普遍存在的问题,因此,如何提高外源抗
虫基因在植物体内的表达,是植物抗虫基因工程的
一个重要研究方向[44]。
减少“基因沉默”的主要方法有:(1)改进转基
因方法,尽量避免多拷贝外源基因整合到受体基因
组中;(2)筛选单拷贝转基因个体;(3)采用具有特
殊功能的启动子和增强子进行调控。随着人们对
DNA空间结构、各种调控因子、环境因子及发育因
子与转基因表达之间相互关系的深入研究,转基因
沉默现象终将会被克服。
3.3 生态风险性
转抗虫基因植物的安全性是一个长期、重要且
复杂的问题,应谨慎对待[45]。抗虫转基因植物的直
接生态效应是对靶标昆虫种群的控制,但靶标昆虫
有无向其他寄主植物转移的可能;害虫天敌种群会
受到怎样的影响;次要害虫是否会变为主要害虫;
靠转基因作物的逃逸或从作物杂交中获取转基因
抗性的植物是否会对自然植物群落产生严重影响,
都是需要进一步研究的问题。为了防止转基因植物
与它们的野生亲缘植物之间杂交,进而减少转基因
植物的扩散,目前,已有学者在实验室内用烟草作
试验,把不育基因和不育抑制基因分别嵌入烟草
中,当转基因烟草之间相互授粉后,由于不育抑制
基因可以抑制不育基因,使得转基因烟草可以产生
能繁衍的种子。而当转基因烟草与非转基因烟草授
粉后,不育基因就可以防止“不纯”烟草种子的萌
发;为了防止选择基因或报告基因的潜在风险,目
前,世界上已有许多实验室正在研究无标记转化系
统[46]。
4 展望
植物抗虫基因工程在短短十几年中已取得了
丰硕成果,抗虫转基因棉花、玉米、马铃薯的商业化
推广证明了这项技术的实用性。在转基因植物体
内,抗虫基因在植物整个生活周期中都存在并行使
其抗虫功能,克服了使用农药控制虫害的时效性和
易被冲刷、流失、分解等缺点,又防止了化学农药在
食物中的残留危害人体健康和对环境造成的污染
等问题。多种抗虫基因的同时开发及其互补和协同
作用,对于控制昆虫产生抗性,提高抗虫植物的抗
虫能力及抗虫范围前景是乐观的。另外,我们必须
认识到,基因工程并非是解决一切问题的万全之
策,通过植物基因工程得到的只是一种人工种质新
材料,而不是生产上可以立即应用的新品种,它必
须经过常规育种考验。只有将传统的抗虫育种、遗
传工程及田间综合防治相互结合起来,才能更好地
控制害虫发生,更好地改良植物。因此,植物基因工
程技术必须与常规育种相结合,并经大田试验将转
基因植物的外源目的基因持续遗传给后代或通过
有性繁殖转移到其他品种上去。可以相信,随着研
究的不断深入,目前抗虫转基因工程中存在的各种
问题必将得到解决,在不久的将来会有更多的抗虫
作物新品种从实验室走向大田。
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康俊梅等:植物抗虫转基因工程研究进展 19