全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
野生濒危植物掌叶木的 ISSR-PCR反应体系的建立
李雪萍1 李在留2 崔彬彬3 贺春玲1 彭健2 杨婷2 周振艳2
(1河南科技大学林学院，洛阳 471003;2广西大学林学院，南宁 530004;3保定学院生化系，保定 071000)
摘 要: 以野生濒危植物掌叶木的叶片为材料，通过单因子试验分别研究了模板 DNA、退火温度、Taq DNA 聚合酶用
量、dNTP浓度、Mg2 +浓度、引物浓度等对 ISSR-PCR反应的影响，找出各自的合适条件，通过各个因子的组合研究建立了适宜
于掌叶木 ISSR分析的扩增体系，即 25 μL 的反应体系中含模板 DNA 约 30 ng，Mg2 + 2． 0 mmol /L，引物 0． 8 μmol /L，dNTP
0． 20 mmol /L，Taq DNA聚合酶 1． 5 U。该研究为利用 ISSR分析掌叶木遗传多样性、进行掌叶木种质资源研究等奠定了良好的
基础。
关键词: 掌叶木 ISSR PCR 优化
Optimization of ISSR-PCR Amplification in Handeliodendron
bodinieri (Lévl．)Rehd．
Li Xueping1 Li Zailiu2 Cui Binbin3 He Chunling1 Peng Jian2 Yang Ting2 Zhou Zhenyan2
(1 College of Forestry，Henan University of Sience and Technology，Luoyang 471003;2 College of Forestry，Guangxi University，Nanning 530004;
3 Department of Biology and Chemistry，Baoding University，Baoding 071000)
Abstract: In order to establish an optimal reaction system of ISSR-PCR in Handeliodendron bodinieri (Lévl．)Rehd．，the effects
of main elements，such as template DNA concentration，annealing temperature，Taq DNA polymerase dosage，dNTP concentration，Mg2 +
concentration，primer concentration，were tested by single factor experiments respectively． The optimal reaction system for ISSR analysis
in Handeliodendron bodinieri(Lévl．)Rehd． included 30 ng template DNA，1 × PCR buffer，2． 0 mmol /L MgCl2，0． 20 mmol /L each of
dATP，dCTP，dGTP and dTTP，1． 5 unit of Taq DNA polymerase and 0． 8 μmol /L primer in a total volume of 25 μL． The research would
laid a satisfactory foundation for ISSR analysis in Handeliodendron bodinieri(Lévl．)Rehd．
Key words: Handeliodendron bodinieri(Lévl．)Rehd． ISSR PCR Optimization
收稿日期:2011-06-28
基金项目:国家自然科学基金项目(31060053) ，河南省自然科学基金项目(62580021) ，广西自然科学基金项目(2011GXNSFB018016)
作者简介:李雪萍，女，博士，讲师，研究方向:濒危植物遗传多样性;E-mail:l_xx_p_98000@ 163． com
通讯作者:李在留，女，博士，讲师，研究方向:濒危植物的濒危机制;E-mail:lizailiu666@ 163． com
掌叶木(Handeliodendron bodinieri(Lévl．)Re-
hd．)是无患子科(Sapindaceae)掌叶木属(Handelio-
dendron Rehd．)落叶大乔木，是我国特有的珍稀濒
危野生物种，第三纪孑遗古老植物。该物种分布区
狭小，全球仅见我国贵州南部的荔波、平塘、独山、安
龙、兴义以及广西隆林、田林和凌云等县零星分布［1］。
作为亚热带石灰岩石山常绿、落叶阔叶混交林的特有
树种之一，对古植物、古地理、古气候的研究以及喀斯
特地形地貌研究与保护具有重要意义［2 － 5］。
简单重复序列区间扩增多态(ISSR)DNA 分析
是由 Zietkiewicz 等［6］于 1994 年建立的一项新的
DNA标记技术。它结合了 SSR 和 RAPD 技术的优
点，不仅操作简单、所需 DNA量少、不需预知研究对
象的基因组序列，而且稳定性高。因此，ISSR 近年
来已迅速应用于品种鉴定、种质资源和遗传多样性
的研究，并作为构建遗传图谱的工具［7 － 10］，但至今
未见 ISSR技术应用于掌叶木的相关研究报道。
本研究对影响 ISSR-PCR 扩增体系的相关影响
因素进行优化筛选，建立了适于掌叶木的简单、高
效、稳定的 ISSR 反应体系，为进一步开展野生濒危
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
植物掌叶木的种质资源和分子生物学研究奠定
基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
试验材料采自广西省岑王老山国家级自然保护
区，取其幼叶，于冰壶中带回实验室后置于 － 70℃超
低温冰箱保存备用。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA 的提取与检测 采用申丹
等［11］介绍的改良 CTAB 法，提取掌叶木的总 DNA。
在紫外可见光分光光度计(Spectrophotometer Nano
Drop ND-1000)上，波长 260 nm测定其光吸收值，计
算 DNA浓度;用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，自动
凝胶成像系统(Bio-Rad)观察拍照。
1. 2. 2 原初 ISSR 反应体系及 PCR 扩增程序 根
据相关文献［12 － 14］，最初的反应体系为 25 μL 中，10
ng 模板 DNA，1. 5 mmol /L MgCl2，0. 20 mmol /L
dNTP，1. 0 μmol /L Primer，1 × PCR Buffer，Taq DNA
聚合酶 1. 0 U。初步反应程序:94℃预变性 5 min，
然后执行 36 个扩增循环，每个循环中 94℃变性
45 s，退火 45 s，72℃延伸 1 min;最后 72℃延伸 10
min，4℃保存。
ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学提供的序
列，由上海生工生物工程公司合成。扩增反应在 Bi-
ometer Tgradient基因扩增仪上进行，所用 Taq DNA
聚合酶、dNTP均为 Tiangen公司产品。
扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，
3 V /cm恒定电压下电泳约 1. 5 h，自动凝胶成像系
统(Bio-Rad)拍照记录。
1. 2. 3 退火温度的确定 采用梯度 PCR 模式，参
考每条引物的 Tm 值，通过试验测试确定每条引物
的适合退火温度，如引物 UBC808 的 Tm值为 52℃，
在 48 － 60℃设置 5 个梯度(48℃、53℃、55℃、57℃
和 60℃)以检测其最佳退火温度。
1. 2. 4 ISSR-PCR扩增体系的优化 为了确定最佳
的掌叶木的 ISSR-PCR 的扩增条件，从初步筛选中
选择谱带多态性较高的通用引物 UBC808 为引物，
对 ISSR 的影响因素(模板 DNA、Mg2 +、dNTP、引物
浓度、Taq DNA聚合酶用量)逐个作浓度梯度，进行
单因素试验研究，各因素变化量详见表 1。
表 1 ISSR-PCR体系优化的因素与水平
编号
模板浓度
(ng)
Mg2 +浓度
(mmol /L)
dNTP浓度
(mmol /L)
引物浓度
(μmol /L)
Taq DNA聚合
酶用量(U)
1 10 1. 0 0. 10 0. 2 0. 5
2 30 1. 5 0. 15 0. 4 1. 0
3 60 2. 0 0. 20 0. 8 1. 5
4 110 2. 5 0. 25 1. 0 2. 0
5 200 3. 0 0. 30 1. 5 2. 5
6 350
2 结果与讨论
2. 1 掌叶木基因组 DNA的提取与检测
提取的掌叶木总 DNA的溶液无色透明，测得其
OD260 /OD280在 1. 8 － 2. 1 之间，DNA 琼脂糖电泳显
示此种方法提取的掌叶木基因组 DNA基本无降解，
完整性好。
2. 2 引物筛选与退火温度的确定
退火温度明显影响 ISSR-PCR 扩增谱带式样。
有些研究者认为，不论引物组成如何均采用 50 －52℃
退火温度，也能获得清晰的谱带［15］。为了提高掌叶
木 ISSR-PCR扩增的严谨性，本试验中采用 50 条 IS-
SR引物进行初步筛选，经梯度 PCR测试，其中能扩增
出清晰明亮的谱带且重复性好的有 12 条引物，引物
UBC808在不同退火温度下的扩增谱带如图 1 所示。
从图 1可以看出退火温度对引物 UBC808的扩增谱带
有一定的影响;因遗传多样性分析时统计条带一般在
200 －2 000 bp，所以在谱带相似的情况下(53℃、55℃和
57℃)，选择较高的退火温度以提高扩增的稳定性［16］，
确定引物 UBC808的退火温度为 57℃。
M. Trans 2K DNA Marker;1 － 5. 退火温度为 60℃、57℃、55℃、
53℃和 48℃
图 1 引物 UBC808 在不同退火温度下的 ISSR-PCR图谱
861
2011 年第 9 期 李雪萍等:野生濒危植物掌叶木的 ISSR-PCR反应体系的建立
2. 3 各因素对 ISSR-PCR扩增的影响
2. 3. 1 模板浓度对 ISSR-PCR 扩增的影响 与濒
危植物珙桐的 ISSR-PCR 体系相似，掌叶木 ISSR-
PCR 体系中，对 DNA 模板含量的许可范围较大，
如图 2 所示。当模板用量在 10 － 400 ng 时，均能
扩出相似的带型;试验中使用的模板是未经纯化
处理总 DNA，虽然不影响扩增反应［17］，但用紫外
可见分光光度计进行的浓度测定不够准确，为了
节约总 DNA，每体系中我们加入 2 μL 的模板，约
30 ng。
M． Trans 2K DNA Marker;1 － 6．模板浓度分别为 350、200、110、
60、30 和 10 ng
图 2 模板浓度对 ISSR扩增的影响
2. 3. 2 镁离子浓度对 ISSR-PCR 扩增的影响
Mg2 +浓度是 ISSR-PCR 中一个重要的影响因素，它
对 Taq DNA聚合酶的活性、退火温度和产物的特异
性都有影响［18，19］。李均敏等［20］在对西兰花的研究
中指出，在一定的浓度范围内，随着 Mg2 +浓度的增
高，扩增的特异性减弱，但扩增片段的产率增加。但
本试验中发现，Mg2 + 浓度在 2. 0、2. 5、3. 0 mmol /L
浓度水平间扩增无显著差异(图 3) ，与王东娜等［21］
在对胡桃楸的研究中的结果相似。一般认为，PCR
反应体系中 Mg2 + 浓度过低，Taq 酶会有所失活;
Mg2 +浓度过高则会使引物的错配频率增加，结合节
省试剂等因素选择 Mg2 +浓度为2. 0 mmol /L。
2. 3. 3 dNTP浓度对 ISSR-PCR 扩增的影响 dNTP
作为 PCR反应的原料参与新链 DNA 的合成过程，
对循环数、产物扩增的量均有较大的影响，浓度过
低，偶然性大，无扩增产物或扩增产物不稳;浓度过
高则会导致聚合酶错误掺入，影响扩增的特异性和
精确性。但本试验显示 dNTP 浓度的变化对谱带的
数量和强弱影响不大，如图 4 所示。因此，采用 IS-
SR-PCR中 dNTP的常用浓度 0. 20 mmol /L。
M． Trans 2K DNA Marker;1 － 5． Mg2 + 浓度分别为 3． 0、2． 5、
2． 0、1． 5 和 1． 0 mmol /L
图 3 Mg2 +浓度对 ISSR扩增的影响
M． Trans 2K DNA Marker;1-5． dNTP 浓度分别为 0． 30、0． 25、
0． 20、0． 15 和 0． 10 mmol /L
图 4 dNTP浓度对 ISSR扩增的影响
2. 3. 4 引物浓度对 ISSR-PCR扩增的影响 在本研
究中，引物浓度的变化对 ISSR 谱带的数量和强弱影
响较小，这与李均敏等［20］对七子花的研究结果及与
王东娜等［21］对胡桃楸的研究结果相似，如图 5 所示。
当引物浓度在 0. 8 －1. 5 μmol /L之间时，带型相差不
大，最终选用 0. 8 μmol /L为引物的适用浓度。
2. 3. 5 Taq DNA 聚合酶用量对 ISSR-PCR 扩增的
影响 由图 6 可以看出，Taq DNA 聚合酶的用量对
谱带有一定的影响。当 Taq DNA聚合酶用量为 0. 5
U时，扩增产物较少，随着 Taq DNA 聚合酶用量的
增加，条带数量与强度逐渐增加，但 Taq DNA 聚合
酶用量为 2. 5 U 时反而无扩增产物，可能是一些人
为操作失误所致。为了节约成本选用 1. 5 UTaq
DNA聚合酶。
961
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
M． Trans 2K DNA Marker;1 － 5．引物浓度分别为 1. 5、1. 0、0. 8、
0. 4、0. 2 μmol /L
图 5 引物浓度对 ISSR扩增的影响
M． Trans 2K DNA Marker;1 － 5． Taq DNA 聚合酶用量分别为
2． 5、2． 0、1． 5、1． 0 和 0． 5 U
图 6 Taq DNA聚合酶用量对 ISSR扩增的影响
3 结论
ISSR技术虽然具备操作简单、快速、高效，多态
性高，重复性好等优点，但它也是一种基于 PCR 的
分子标记技术，影响 PCR 扩增的各个因素，如模板
DNA、Mg2 +、dNTP、引物浓度以及 Taq DNA 聚合酶
用量等，亦会影响到 ISSR-PCR 的扩增结果。因此，
将该技术应用于一个新的植物材料时，首先建立一
个合适的 ISSR-PCR 反应体系，才能才后续研究中
获得可靠的结果。本研究对上述各因子的最佳反应
条件进行了优化，建立起适合于掌叶木的反应体系，
即 25 μL 的反应体系中，模板 DNA 30 ng，Mg2 +
2. 0 mmol /L，引物 0. 8 μmol l /L，dNTP 0. 20 mmol /
L，Taq DNA 聚合酶 1. 5 U，为今后开展濒危植物掌
叶木的种质资源和分子生物学研究奠定基础。
参 考 文 献
［1］蓝开敏．中国珍稀濒危植物(掌叶木) ［M］．上海:上海教育出版
社，1989:294．
［2］Forest F，Drouin JN，Charest R，et al． A morphological phylogenetic
analysis of Aesculus L． and Billia Peyr． (Sapindaceae)． Canadian
Journal of Botany，2001，79:154-169．
［3］Harrington MG，Edwards KJ，Johnson S，et al． Phylogenetic inference
in Sapindaceae sensu lato using plastid matK and rbcL DNA se-
quences． Systematic Botany，2005，30:366-382．
［4］曹丽敏，夏念和，邓云飞．掌叶木的花器官发生及其系统学意义．
植物分类学报，2006，44(4) :393-400．
［5］Cao LM，Xia NH，Deng YF． Embryology of Handeliodendron bodinieri
(Sapindaceae)and its systematic value development of male and fe-
male gametophytes． Plant Syst Evol，2008，274:17-23．
［6］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D． Genome fingerprinting by sim-
ple sequence repeat(ssr)-anchored polymerase chain reaction ampli-
fication． Genomics，1994，20:176-183．
［7］王静，张小平，李文良，等．濒危植物连香树居群的遗传多样性和
遗传分化研究．植物研究，2010，30(2) :208-214．
［8］Zhao J，Jiang P，Li N，et al． Analysis of genetic variation within and
amongUlva pertusa(Ulvaceae，Chlorophyta)populations using ISSR
markers． Chinese Science Bulletin，2010，55(8) :705-711．
［9］施维属，王江波，李开拓，等． 24 份甜橙种质资源的 ISSR 分析．
热带作物学报，2010(6) :902-907．
［10］刘燕，张道远，杨红兰．准葛尔无叶豆 5 个自然居群 ISSR 遗传
变异的空间自相关分析．生物多样性，2010，18(2) :129-136．
［11］申丹，曾杰，周世良，等． 4 种石山植物 DNA 提取方法筛选． 广
西科学，2005，12(4) :340-342．
［12］李雪萍，何正权，陈发菊，等．濒危植物珙桐 ISSR-PCR反应体系
的建立．江苏农业科学，2007(2) :162-165．
［13］宋吉轩，王季春，雷尊国，等． 甘薯 DNA 提取及 ISSR 反应体系
的建立．种子，2010，29(4) :40-43．
［14］陈元生，彭建宗．葛属植物 ISSR-PCR扩增条件的正交优化．广
东农业科学，2010(1) :120-123．
［15］邹喻苹，蔡美琳，王晓东． 古代“太子莲”及现代红花中国莲种
质资源的 RAPD分析．植物学报，1998，40(2) :163-168．
［16］席嘉宾，郑玉忠，杨中艺．地毯草 ISSR反应体系的建立与优化．
中山大学学报:自然科学版，2004，43(2) :80-84．
［17］汪小全，邹喻苹，张大明，等． RAPD 应用于遗传多样性和系统
学研究中的问题．植物学报，1996，38(12) :954-962．
［18］邹喻苹，葛颂，王晓东．系统与进化植物学中的分子标记［M］．
北京:科学出版社，2001:93-97．
［19］庞赫，郭太君，胡志军，等．大花君子兰 ISSR-PCR反应体系的建
立与优化．吉林农业大学学报，2010，32(2) :167-171，176．
［20］李钧敏，金则新． 适合西兰花的反应体系的建立． 江苏农业科
学，2006(1) :79-81．
［21］王东娜，牟长城，冯富娟．胡桃楸 ISSR-PCR 反应体系的建立及
优化．实验室研究与探索，2010，29(11) :18-22，37．
(责任编辑 狄艳红)
071