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生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
蛋白 G IgG Fc段结合域的克隆表达及功能研究
房国梁 1 　刘志国 1 　宗义强 2 　张大川 1 　曾丽娟 1 　付云洁 1 　屈伸 2
(1 武汉工业学院生物与制药工程学院 ,武汉 430023; 2华中科技大学同济医学院生化与分子生物学系 ,武汉 430030 )
　　摘 　要 : 　旨在研究蛋白 G IgG Fc段结合域 ( PGFB)的克隆、表达及其抗体结合功能 ,用于抗体的纯化。根据 PGFB的氨
基酸序列 ,选择大肠杆菌偏爱的密码子 ,设计并合成了 4个寡核苷酸片段。通过重叠延伸 PCR方法合成了 PGFB DNA片段 ,
测序鉴定后克隆至原核表达系统 pET228a2c ( + )上 ,转化大肠杆菌 ,获得表达菌株 ; IPTG诱导表达 PGFB,经 N i+ 2NTA琼脂糖
凝胶层析纯化后偶联到琼脂糖凝胶 6B上 ,用其纯化多克隆抗体。结果显示 , PGFB在大肠杆菌 BL21 (DE3)中获得高效表达 ,纯
化后纯度达到 90%以上 ,相对分子量为 12. 25 kD,与预期值相符。此外 ,偶联产物纯化多克隆抗体达到了良好的效果 ,每毫升基
质可结合 20 mg抗体。本研究克隆构建并高效表达了具有较好抗体亲和能力的 PGFB,为多克隆抗体的快速纯化提供了方便。
关键词 : 　蛋白 G IgG Fc段结合域 　多克隆抗体 　原核表达
Clon ing, Expression and Function of Prote in G IgG Fc Binding Doma in
Fang Guoliang1 　L iu Zhiguo1 　Zong Yiqiang2 　Zhang Dachuan1 　Zeng L ijuan1 　Fu Yunjie1 　Qu Shen2
(1W uhan Poly technic University School of B iology and Pharm aceutical Engineering, W uhan 430023;
2 Tongji M edical College of Huazhong University Departm ent of B iochem istry and M olecular B iology, W uhan 430030)
　　Abs trac t: 　 It was to clone and exp ress p rotein G IgG Fc binding domain ( PGFB) for purifying antibody. Four oligonucleotide frag2
ments with the selected E. coli2p referred codon were designed and synthesized according to the am ino acid sequence of PGFB. Then the
gene of PGFB was synthesized by overlap extension PCR, and cloned into pET228a2c ( + ) p lasm id. The recombinant p rotein was puri2
fied by a single step affinity chromatography with N i+ 2NTA, then it was coup led with Sepharose 6B to purify polyclonal antibody. Re2
sults showed PGFB was exp ressed highly in E. coli BL21 (DE3) , the purity of which reached 90% with expected molecular weight of
12. 25 kD. PGFB coup led with Sepharose 6B which can purify polyclonal antibody. The binding capacity reached 20 mg/mL. There2
fore, highly exp ressed PGFB would p rovide convenience for the rap id purification of polyclonal antibody.
Key wo rds: 　Protein G IgG Fc binding domain　Polyclonal antibody　Prokaryotic exp ression
收稿日期 : 2009206203
作者简介 :房国梁 (19842 ) ,男 ,山东济南人 ,硕士研究生 ,研究方向 :微生物与生化药物
通讯作者 :刘志国 (19632) ,男 ,博士 ,教授 ,主要从事生物技术与食品安全研究 ; E2mail: zhiguo_l@126. com　　链球菌 G蛋白 ( S treptococcus p rotein G)简称SPG,是某些链球菌细胞壁中的一类能够与许多哺乳动物免疫球蛋白特异性结合的蛋白。这类蛋白能特异性与免疫球蛋白分子的 Fc段结合而不影响 Fab段与抗原分子的结合 ,因此在免疫学及分子生物学研究中得到广泛应用 [ 1 ]。由于链球菌细胞壁中的 SPG含量低 ,直接提取过程复杂 ,得率很低 [ 2 ]。因此通过基因工程的方法获取 SPG是近年采用的主要方法。目前通常采用在大肠杆菌中克隆表达的方法 [ 3 ] ,也有文献报道将SPG与其它功能蛋白融合表达 ,满足不同的需要。 如 Suzuki等 [ 4 ]将 SPG与 SPA基因 , SPG与碱性磷酸酶基因分别融合 ,在细菌中表达出具有 SPA和 SPG特性的蛋白及具有 SPG特性和碱性磷酸酶活性的蛋白。这两种工程菌蛋白显示了比单独 SPA 或SPG更为广泛的结合谱和更强的 IgG结合力。结构分析显示 , SPG中存在独立的 IgG Fc段结合区 [5 ] ,它可能替代全长的 SPG直接用于抗体纯化 ,并且分子较小的功能区更适合克隆操作和做进一步的结构修饰 ,因而具有独特的优势和应用价值 [ 6～8 ]。本研究人工合成寡核苷酸片段 ,经重叠延伸 PCR克隆 PGFB片段 ,表达纯化后做功能分析 ,结果显示
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
该片段具有良好的纯化抗体的能力 ,为进一步修饰
改造奠定了基础。
1　材料与方法
111　材料
大肠杆菌 DH5α菌株、BL21 (DE3)菌株和质粒
pET228a2c ( + )由本实验室保存 ;兔多克隆抗体由本
实验室制备 ;限制性内切酶 H ind III、EcoR I, T4 连接
酶为 Toyobo产品 ; 1 kb p lus DNA Ladder购自 TIAN2
GEN公司 ; PCR产物纯化试剂盒购自 Axygen公司 ;
DNA凝胶回收试剂盒购自 V2gene公司 ; Pfu DNA聚
合酶、质粒小量制备试剂盒、中分子量标准蛋白购自
上海捷瑞 ;蛋白胨、酵母浸提物为 Oxiod公司产品 ;
N i+ - NTA树脂为 Novagen公司产品 ; Sepharose 6B
为鼎国生物产品 ; DNA合成由英骏生物技术有限公
司完成。
112　重组表达载体 pET228a2c ( + ) - PGFB的构建
参照 GenBank上的 PGFB 基因序列 (登录号 :
S62801) ,为了便于后期与琼脂糖凝胶的偶联 ,使用
质粒 pET228a2c ( + )自身的起始密码子和终止密码
子 ,将目的基因中起始密码子 ATG用表达缬氨酸的
GTT替换 ,去除终止密码子 TGA;保留 5′端 EcoR I
酶切位点和之前的两个碱基作为保护碱基 ;将目的
基因中的大肠杆菌稀有密码子改为大肠杆菌偏爱密
码子 ;并在 3′端增加 H ind III酶切位点和两个保护
碱基 GC,为使阅读框不改变在 H indⅢ酶切位点前
加一个碱基 C。整个序列全长为 197 bp ,分 4段合
成 ,每段重叠 18 bp (表 1)。
表 1　4段引物序列
名称 序列 (5′→3′)
PGFB1
CAGAATTCGTTACCACCTACAAACTGGTTA
TTAATGGTAAAACCCTGAAAGGCGAAACC
PGFB2
TTCGCGTACTGTTTGAACGCTTTTTCCGCGGTTTCCG
CATCTACGGTTTTGGTGGTGGTTTCGCCTTTCAGGGT
PGFB3
GTTCAAACAGTACGCGAACGATAACGGTG
TTGATGGTGTTTGGACCTATGATGATGCGA
PGFB4
GCAAGCTTGCGGATCCATTTCGGTTACGGT
AAAGGTTTTGGTCGCATCATCATAGGTCC
　注 : PGFB1的划线部分是 EcoR I酶切位点 , PGFB4的划线部分是
H ind III酶切位点
将合成的引物通过重叠扩增法扩增出模板 DNA。
引物合成后 ,加三蒸水稀释成 100μmol/L。
第一步 , PGFB1与 PGFB2段连接 : PGFB1和 PG2
FB2各 1. 5μl, 10 ×Pfu buffer 2μl, dNTP (10 mmol/L)
0. 5μl, Pfu DNA聚合酶 (5 U /μl) 0. 5μl,加三蒸水补
足 20μl。扩增条件 : 94℃预变性 2 m in,然后进行
94℃ 30 s, 51℃ 30 s, 72℃ 30 s,共 30个循环 ,最后
72℃延伸 5 m in。
第二步 , PGFB3与 PGFB4段连接 : PGFB3和 PG
FB4各 1. 5μl, 10 ×Pfu buffer 2μl, dNTP (10 mmol/
L) 0. 5μl, Pfu DNA聚合酶 (5 U /μl) 0. 5μl,加三蒸
水补足 20μl。扩增条件 : 94℃预变性 2 m in,然后进
行 94℃ 30 s, 49℃ 30 s, 72℃ 30 s,共 30个循环 ,最
后 72℃延伸 5 m in。
第三步 ,上述两次 PCR 的产物各 20μl, 10 ×
Pfu buffer 5μl, dNTP (10 mmol/L ) 1μl, Pfu DNA聚
合酶 (5 U /μl) 0. 5μl,加三蒸水补足 50μl。扩增条
件 : 94℃预变性 5 m in,然后进行 94℃ 1 m in, 49℃
1 m in, 72℃ 1 m in,共 30 个循环 ,最后 72℃延伸
5 m in。用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
用 PCR纯化试剂盒纯化扩增产物 ,分别用 EcoR
I和 Hind III双酶切扩增产物及质粒 pET228a2c ( + ) ;
用 DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物 ;将回收的片
段和载体用 T4 DNA连接酶于 16℃连接 1 h;转化大肠
杆菌 DH5α感受态细胞 ;筛选阳性菌落 ,质粒酶切鉴
定 ,将鉴定正确的克隆送上海捷瑞生物工程有限公司
测序 ,将测序正确的克隆命名为 pET228a2c ( + ) 2PG2
FB。
113　重组质粒 pET228a2c ( + ) 2PGFB的表达及优化
将阳性重组质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3)感
受态细胞 ,涂布于含有卡那霉素 ( 50μg/m l)的 LB
固体培养基上 ,挑取单菌落接种于含有卡那霉素
(50μg/m l)的 2 m l LB液体培养基中 37℃培养过
夜 ,吸取少量过夜培养液按 1∶100的比例转接到新
鲜 LB中 ,于 37℃摇床培养至 OD600为 0. 6～0. 8,分
别对加入的 IPTG浓度和诱导时间进行单因素影响
试验。 IPTG浓度分别为 0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2
mmol/L;诱导时间分别为 3、6、9、12 h。收集菌体进
行 SDS2PAGE电泳检测。
114　重组蛋白的纯化
将诱导后的菌液冰浴 30 m in, 4℃、5 000 r/m in
离心 20 m in,弃上清 ;细菌沉淀用 1 /10的裂解液
(Na3 PO4 20 mmol/L , NaCl 0. 5 mol/L ,溶菌酶 1 mg/
211
2009年第 9期 房国梁等 :蛋白 G IgG Fc段结合域的克隆表达及功能研究
m l, pH7. 4)重悬 ;混合物于 4℃摇床孵育 10 m in;加
入 TritonX2100、DNase和 RNase,终浓度分别为 1%、
5μg/m l和 5μg/m l,再于 4℃摇床孵育 10 m in;然后
4℃、5 000 r/m in离心 30 m in,收集细胞上清和沉
淀。将上清液加入预先用平衡液 (Na3 PO4 20 mmol/
L , NaCl 0. 5 mol/L,咪唑 10 mmol/L , pH7. 4)平衡好
的 N i+ - NTA琼脂糖层析柱中 ,用洗涤液 (Na3 PO4
20 mmol/L , NaCl 0. 5 mol/L , pH7. 4)洗至基线后 ,用
洗脱液 (Na3 PO4 20 mmol/L , NaCl 0. 5 mol/L ,咪唑
400 mmol/L , pH7. 4)进行洗脱 ,收集洗脱峰蛋白 ,进
行 SDS2PAGE分析。将沉淀用洗涤液 ( 50 mmol/L
Tris2Cl pH8. 0, 2 mmol/L EDTA, 1% TritonX2100)洗
涤 ,用变性缓冲液 ( 8 mol/L尿素 , 0. 3 mol/L NaCl,
50 mmol/L NaH2 PO4 )溶解 , 4℃、12 000 r/m in离心
20 m in,收集上清 ,进行 SDS2PAGE鉴定。
115　重组蛋白与多克隆抗体结合力的分析
将纯化后的 PGFB各取 40μl,分别加入 1、2、3、
4、5、6、7μl兔多克隆抗体 ,混匀后 20℃孵育 1 h。
4℃、12 000 r/m in离心 5 m in,收集上清和沉淀 ,进
行 SDS2PAGE电泳 ,测定各个参数 ,绘制饱和曲线和
Scatchard图。
116　重组蛋白与琼脂糖凝胶的偶联及功能鉴定
取 Sepharose 6B 10 g,加入 25 m l环氧氯丙烷和
20 m l 1mol/L NaOH, 37℃恒温摇床振荡 4 h,用蒸
馏水洗去剩余的环氧氯丙烷 ;取 5 g经环氧氯丙烷
活化的琼脂糖 ,加入 10 m l氨水 ,室温反应 4 h,使环
氧基团彻底氨解 ,将水解后的琼脂糖载体洗净抽干 ;
加入 20 m l体积分数为 15%的戊二醛水溶液 ,室温
反应 2 h,彻底洗净戊二醛 ;取 3 g上述活化并连接
上手臂的琼脂糖 ,加入 6 m l纯化的重组蛋白 PGFB,
30℃振荡 4 h,用蒸馏水洗净 ;然后加入一定体积的
1 mol/L的乙醇胺溶液 ,在室温下振荡 2 h,屏蔽未反
应的环氧基团 ;最后用一定浓度的牛血清白蛋白于
室温反应 2 h,封闭未反应的醛基 ,最后用大量的蒸
馏水洗净 [ 9 ]。
将偶联好的重组 PGFB琼脂糖凝胶装柱 ,柱床
体积为 1 m l;用缓冲液 (pH7. 4的 PBS溶液 )平衡 5
～10个床体积 ,流速为 1 m l/m in;将 1 m l先前制备
的多克隆抗体用缓冲液稀释到 5 m l上样 ,流速为 1
m l/m in;用缓冲液再洗 5～10个床体积 ,流速为 1
m l/m in;用洗脱液 (100 mmol/L甘氨基酸 2盐酸缓冲
液 , pH2. 7)洗脱 ,流速为 1 m l/m in,收集洗脱液 ,立
即用中和液 (1 mol/L Tris2HCl缓冲液 , pH9. 0)中和
到中性。
2　结果
211　目的基因的扩增及重组载体的鉴定
PCR扩增产物的 1%琼脂糖凝胶电泳结果 (图
1)表明 ,扩增片段大小为 197 bp,与预期相符。将
目的片段和质粒双酶切后凝胶回收 ,经过连接后转
化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,挑取阳性菌落 ,提取
质粒 DNA ,用 EcoR I和 H ind III双酶切鉴定 ,阳性
质粒可以切出与 PCR产物大小一致的片段 (图 2)。
将双酶切阳性的质粒进行 DNA序列测序 ,测定结果
经过比对、分析 ,证明所获得的序列完整且阅读框
正确。
M. 1 kb p lus DNA Ladder; 1. PGFB1、PGFB2连接产物 ;
2. PGFB3、PGFB4连接产物 ; 3. PGFB DNA片段
图 1　PCR扩增电泳结果
M. 1 kb p lus DNA Ladder; 1. PGFB DNA 片段 ; 2. 质粒 pET228a2c
( + ) ; 3. 重组质粒 pET228a2c ( + ) 2PGFB; 4. 重组质粒 pET228a2c
( + ) 2PGFB EcoR I和 H ind III双酶切产物
图 2　重组质粒酶切电泳结果
311
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
212　重组质粒在大肠杆菌 BL21 (DE3)中的表达及
重组蛋白的纯化
用 CaCl2 法把重组质粒转入大肠杆菌 BL21
(DE3) , IPTG诱导表达 ,收集菌体经 10% SDS2PAGE
检测 (图 3) ,在相对分子量 12. 25 ×103 处出现了表
达条带 ,说明 PGFB 蛋白在 BL21 (DE3 )中成功表
达。因使用质粒 pET228a2c ( + )表达的蛋白 , N 端
带 6 ×H is标签 ,因此可以用 N i+ 2NTA树脂纯化目
的蛋白。收集洗脱液 ,进行 10% SDS2PAGE检测 (图
3) ,得到了重组蛋白 ,纯度达 90%以上。破碎细胞
后 ,在上清和沉淀中均有目的蛋白出现 ,且含量基本
一致 ,说明目的蛋白以可溶性蛋白和包涵体蛋白两
种形式存在。
M. 蛋白分子量标准 ; 1. 未经诱导的 BL21 (DE3 ) 2pET228a2c ( + )全
菌蛋白 ; 2. 未经诱导的 BL21 (DE3) 2pET228a2c ( + ) 2PGFB全菌蛋白 ;
3. 经诱导的 BL21 (DE3) 2pET228a2c ( + )全菌蛋白 ; 4. 经诱导的 BL21
(DE3) 2pET228a2c ( + ) 2PGFB全菌蛋白 ; 5. 纯化后的目的蛋白 ; 6. 诱
导后破碎细胞上清中的蛋白 ; 7:经诱导后破碎细胞沉淀中的蛋白
图 3 SD S2PAGE检测重组蛋白的表达及纯化
213　重组质粒在大肠杆菌 BL21 (DE3)表达条件的
优化
当诱导时间为 3 h, IPTG浓度分别为 0. 4、0. 6、
0. 8、1. 0、1. 2 mmol/L ,从图 4中可以看出当 IPTG诱
导浓度为 1. 0 mmol/L时 ,目的蛋白表达量最高 ,占
细胞总蛋白的 21. 69% (图 5)。确定 IPTG浓度为
1. 0 mmol/L ,诱导分别为 3、6、9、12 h。从图 6,图 7
可以看出当诱导时间为 9 h时 ,目的蛋白表达量达
到最大 ,占细胞总蛋白的 49. 72%。因此重组质粒
在大肠杆菌 BL21 (DE3)的最佳表达条件为 IPTG浓
度 1. 0 mmol/L ,诱导时间 9 h。
M. 蛋白分子量标准 ; 1～5. IPTG浓度分别为 0. 4、0. 6、
0. 8、1. 0、1. 2 mmol/L的全菌蛋白
图 4　 IPTG浓度对目的蛋白表达的影响
图 5　不同浓度 IPTG诱导目的蛋白占细胞总蛋白的百分比
M. 蛋白分子量标准 ; 1～4. 诱导时间分别为 3、6、9、12 h的全菌蛋白
图 6　诱导时间对目的蛋白的影响
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2009年第 9期 房国梁等 :蛋白 G IgG Fc段结合域的克隆表达及功能研究
M. 蛋白分子量标准 ; 1～4. 诱导时间分别为 3、6、9、12 h的全菌蛋白
图 7　不同诱导时间内目的蛋白占细胞总蛋白的百分比
214　重组蛋白与多克隆抗体结合能力的分析
PGFB与兔多克隆抗体结合呈现饱和性 ,多克
隆抗体的最高结合量为 0. 65 mg/mg PGFB (图 8) ,
Scatchard作图所得解离常数 Kd值为 7. 33 ×1026
mol/L (图 9)。
图 8　PGFB与 IgG结合饱和曲线
图 9　PGFB与 IgG结合 Sca tchard图
215　重组蛋白与琼脂糖偶联后功能的鉴定
用重组 PGFB琼脂糖凝胶纯化多克隆抗体 ,收
集洗脱液 ,进行 SDS2PAGE检测。从图 10中可以看
到辛酸 2硫酸铵沉淀粗纯化的多克隆抗体中仍含有
较多的杂蛋白 ,重组 PGFB琼脂糖凝胶经纯化后去
除了较多的杂蛋白。每毫升基质可结合 20 mg抗
体 , PGFB的密度为 2 mg/m l。
1. 未纯化的多克隆抗体 ; 2. 纯化的多克隆抗体
图 10　重组 PGFB琼脂糖凝胶纯化多克隆抗体
3　讨论
真核基因在大肠杆菌中的表达受很多因素影
响 ,如启动子、终止子的强弱 , SD 序列 ,密码子的偏
爱性 ,基因二级结构以及培养条件等 ,这其中尤以密
码子的偏爱性最为重要 [ 10 ]。本试验采用全基因合
成的方式得到了蛋白 G IgG Fc段结合域片段 ,并用
大肠杆菌 BL21 (DE3)偏爱的密码子替换稀有密码
子 ,使表达量有了大幅提高 , 达到菌体蛋白的
49. 72%。表达产物以可溶性蛋白和包涵体蛋白两
种形式存在 ,且两者的含量基本一致。
为了便于目的蛋白的纯化 , 使用 pET228a2c
( + )作为表达载体 ,表达的蛋白在 N端含有 6 ×H is
标签 ,用 N i+ 2NTA树脂纯化简化了纯化过程 ,纯化
率达到了 90%以上。
目前市售蛋白 G琼脂糖凝胶每毫升基质最高
可结合 25 mg抗体 ,本研究获得的 PGFB琼脂糖凝
胶每毫升基质可结合 20 mg抗体 ,表明本研究克隆
表达的蛋白 G IgG Fc段结合域具有与完整蛋白 G
相同的功能 ,即能够与多克隆抗体 IgG结合 ,将 PG2
FB与琼脂糖凝胶偶联能够纯化多克隆抗体 ,为其进
一步的商品化发展奠定了基础。
参 考 文 献
1　蔡仕英 ,王园园 ,姚志建. 中国科学 , 1991, 12 (12) : 1284～1288.
2　 徐诗嘉 , 刘海雄 , 汪超英 ,等. 中国生物制品学杂志 , 1999, 12
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511
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
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5　蔡仕英 ,王园园 ,姚志建. 中国科学 , 1991, 12: 1284～1288.
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8　 Mandard S, Zandbergen F, Tan S, et al. B iological Chem istry,
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(7) : 511～514.
生物化学 (双语 )
赵宝昌　主编　燕秋　高颖　副主编
97827203202472126　　  62. 00　　　　　2009年 7月出版
内容简介 :本书是我国高等医学院校留学生本科教学和中、英双语教学班教学的生物化学
教材 ,内容为医学专业学生应该掌握的基础理论、基本知识与基本技能 ,同时也兼顾了国家执
业医师考试的要求。全书共 21章 ,内容包括蛋白质、核酸和酶的结构与功能 ;糖、脂、氨基酸和
核苷酸的代谢 ,以及生物氧化和代谢调节 ; DNA、RNA和蛋白质的生物合成 ,基因表达的调控
及 DNA技术 ;生物膜、糖复合物与细胞外基质、细胞信号转导 ,癌基因、抑癌基因与生长因子 ;
肝胆、血液、维生素与无机物的生物化学。全书有插图 348幅 ,表 69个。本书特别注重在华留
学生和双语教学的需要 ,重要的英文生化专业名词与术语均在其后标出相应的中文 ,并在书后
附有名词释义 ,给出简洁、准确的概念。各章后均有中、英文内容摘要。
本书适用于高等医学院校各专业本科留学生和中、英双语教育的学生使用。
科技英语写作进阶
〔法〕J. L. 利伯恩　著　任胜利　莫京　安瑞　译
97827203202492829　　  35. 00　　　　　2009年 7月出版
内容简介 :本书从方便读者阅读、满足读者期望的角度出发 ,阐述了英语科技论文的写作
技巧。作者首先结合自己长期从事英文科技写作培训的实践 ,从文法、逻辑、知识衔接等方面
分析了如何确保读者阅读所需要的时间、记忆和精力最小化 ,同时保持阅读的注意力和动机最
大化。在此基础上 ,作者从论文题名、摘要、标题 /次级标题、引言、图表、结论等方面详细阐述
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本书的特色是实例丰富 ,深入浅出 ,适合非英语母语的科研人员进行科技写作时参考。
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