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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
侧孢短芽孢杆菌 X10启动子活性
片段的克隆和序列分析
李伟杰 1 姜瑞波 2 陈敏 1
(1中国兽医药品监察所 ,北京 100081; 2中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　提取了侧孢短芽孢杆菌 X10的基因组 DNA,以绿色荧光蛋白基因 ( green fluorescent p rotein, gfp)为报告基因 ,以
启动子探针 pUC192GFP为载体 ,通过鸟枪法在大肠杆菌 DH5α中构建了 X10的启动子文库 ,通过筛选获得了 14个阳性克隆 ,
编号为 P1～P14。测定了阳性克隆子的荧光强度 ,结果表明 P6中 gfp基因的启动子活性最强 ,它的荧光强度达到了 355167,
而 P14中 gfp基因的启动子活性最弱 ,它的荧光强度只有 211. 67。对 P6克隆中的重组质粒的插入片段进行了测序和序列
分析。
关键词 : 　侧孢短芽孢杆菌 启动子 克隆 序列分析
Clon ing and Sequence Analysis of Fragments with Promoter
Activ ity in B revibacillus la terosporus X10
L i W eijie1 J iang Ruibo2 Chen M in1
(1 China Institu te of Veterinary D rug Control, B eijing 100081; 2 Institu te of Agricultural Resources and R egional P lanning,
Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　H igh quality genom ic DNA of B revibacillus la terosporus X10 was extracted. The p romoter library of X10 was construc2
ted in Escherich ia coli DH5αwith pUC192GFP as p romoter vector by shotgun2cloning method. 14 positive clones designed as P1～P14
were obtained by screening, the fluorescent intensity of which was assayed to compare the p romoting strength of the p romoters. The re2
sults showed that the p romoter of gfp in P6 was the strongest with fluorescent intensity of 355. 67, while the p romoter of gfp in P14 was
the weakest with fluorescent intensity of 211. 67. The inserting fragments in the recombinant from P6 were sequenced and analyzed.
Key wo rds: 　 B revibacillus la terosporus Promoter Cloning Sequence analysis
收稿日期 : 2009207230
基金项目 :国家科技资源平台项目 (2005DKA21200)
作者简介 :李伟杰 (19792 ) ,男 ,助理研究员 ,硕士 ,主要从事兽医微生物资源开发和利用 ; E2mail: weijielee@163. com　　启动子是基因表达和调控的重要元件 ,在分子生物学和基因工程的研究中有重要的意义。克隆启动子的方法很多 ,一种常用的方法是利用启动子缺失的报告基因构建启动子探针来克隆有启动功能的DNA片段。本研究以绿色荧光蛋白基因 ( gfp)为报告基因 ,以质粒 pUC192GFP为启动子探针 ,通过基因文库的方法克隆了本实验室分离和鉴定的侧孢短芽孢杆菌 X10的启动子 ,并筛选得到了具有强启动子活性的 DNA片段 ,对其序列进行了分析 ,为构建适合于侧孢短芽孢杆菌的遗传标记基因和用于基因表达调控机理的研究打下了基础。 1　材料与方法1. 1　材料1. 1. 1 菌株和质粒 侧孢短芽孢杆菌 (B revibacil2lus la terosporus) X10为本实验室分离和保存 [ 1 ] ;大肠杆菌 ( Escherich ia coli) DH5α为本实验室保存 ;启动子探针 pUC192GFP由南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室李顺鹏教授惠赠。1. 1. 2　培养基和培养条件 LB培养基用于侧孢短芽孢杆菌和大肠杆菌的培养 ;含 100μg/m l氨苄青霉素的 LB固体培养基用于启动子的筛选。侧孢短芽孢杆菌和大肠杆菌均在 37℃培养。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
1. 1. 3　主要试剂及仪器 　限制性内切酶 S au3A I、
B am H I、H ind III和 EcoR I, RNaseA ,溶菌酶 ,蛋白酶
K,碱性磷酸酶 , T4 DNA 连接酶 , DNA marker购自
大连 TaKaRa公司 ;生化药品为进口或国产分析纯
试剂。紫外分光光度计为国产 722型 ,荧光显微镜
为 O lympus BX51 型 ,荧光分光光度计为 H itachi
F24 500　。
1. 2　方法
1. 2. 1 　大肠杆菌 DH5α高效感受态细胞的制
备、质粒提取 ,侧孢短芽孢杆菌 X10总 DNA的提
取、总 DNA的酶切、载体脱磷、酶连和转化参考
文献 [ 2 ]进行。
1. 2. 2　文库的构建 [ 3, 4 ] 　大量提取质粒 pUC192
GFP,对它进行完全酶切 (B am H I)、脱磷处理后和
通过 S au3A I消化的侧孢短芽孢杆菌基因组 DNA
所得片段酶连 ( T4 DNA连接酶 ) ,将酶连产物转化
大肠杆菌 DH5α高效感受态细胞 ,经过适当稀释
后涂布在含 100μg /m l氨苄青霉素的 LB平板上 ,
37℃培养 24 h。如果菌落经肉眼初筛发绿色和菌
体经荧光显微镜检测发绿光 ,该菌落就为启动子
阳性克隆。
1. 2. 3　阳性克隆子荧光强度的测定 [ 5 ] 用氨苄青
霉素 LB平板活化菌株 ,挑单菌落接入液体 LB中培
养 12 h,离心收集菌体 ,用 0. 9%的生理盐水重悬菌
体 ,用紫外分光光度计于 600 nm 波长测定其 OD
值 ,用生理盐水将不同菌株的 OD值均调整成 0. 3。
用荧光分光光度计测定其荧光强度 ,激发波长 480
nm,发射波长 510 nm,每个菌株测量 3次 ,然后取平
均值作为其相对荧光强度。取原始菌株为对照 ,测
量 3次 ,然后取平均值作为其相对荧光强度。用转
入 gfp基因的菌株的相对荧光强度减去对照菌株的
相对荧光强度即为其标准荧光强度。
1. 2. 4　DNA序列测定和分析 DNA序列的测定由
上海英骏生物技术有限公司完成 ; DNA序列的比对
使用 NCB I数据库中的 B lastn程序 ;启动子的预测
采用 BPROM 2Prediction of bacterial p romoters 程序
( http: / / linux1. softberry. com /berry. phtm l)。
1. 2. 5　试验数据的统计分析 数据处理用国际商
业统计软件 SAS6. 12,采用费歇氏最小显著差异法
( Fisher’s LSD )检验 ,置信度为 0. 05。
2结果与分析
2. 1　侧孢短芽孢杆菌基因组 DNA的提取、酶切以
及探针的制备
参考文献 [ 2 ]的方法成功地从该菌株中提取出
了基因组 DNA,每 100 m l菌液可以得到 1. 8 mg的
DNA,达到了建库的要求 ,采用 Sau3A I对其进行完
全酶切。结果如图 1所示 ,片段大小集中在 100～
1 000 bp之间 ,回收这些片段用作构建启动子文库
用。大量提取质粒 pUC192GFP并纯化后 ,用 B am H I
对它进行完全酶切 ,然后用 DNA回收试剂盒回收后
溶于 TE (pH 7. 0)中 ,并用碱性磷酸酶进行脱磷处
理后待用。
1.λDNA /H ind IIImaker和 DL2000 maker;
2. 基因组 DNA本科切片段 ; 3. 基因组 DNA
图 1　Sau3A I完全酶切侧孢短芽孢杆菌 X10基因组 D NA
2. 2　侧孢短芽孢杆菌启动子文库的构建和阳性克
隆的获得
将处理好的 pUC192GFP和 Sau3A I完全酶切基
因组 DNA所得的片段以 1∶3的比例进行混合酶连后
转化大肠杆菌 DH5α高效感受态细胞 ,经过适当稀释
后涂布在含氨苄青霉素的 LB平板上 ,于 37℃培养 24
h后 ,观察菌落的颜色 ,如果有绿色荧光出现 ,表明
gfp基因得到了表达 ,该克隆为阳性克隆。启动子探
针 pUC192GFP在没有外源启动子插入到 gfp基因上
游时 ,该基因不能表达 ,如果该基因表达了 ,表明克隆
到了启动子。通过该方法从 40 000多个克隆中共获
得了 14个阳性克隆子 ,编号为 P1～P14,将它们当中
的重组质粒分别编号为 pUC192GFP21～pUC192GFP2
14,并用 EcoR I和 Hind III对其进行了酶切验证 (图 2,
图 3)。
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2009年第 11期 李伟杰等 :侧孢短芽孢杆菌 X10启动子活性片段的克隆和序列分析
2. 3　启动子片段强度的测定
启动子的强弱决定了报告基因的表达量 ,所以
通过测定报告基因的比活力 ,可以推断启动子的强
度。选择启动子片段上没有 EcoR I和 H ind III酶切
位点的 7个阳性克隆 ,将它们和对照菌株 (大肠杆
菌 DH5α)分别接种到 LB液体培养基中 ,培养后用
生理盐水调整到同样的菌体浓度。荧光强度测定用
H itachia生产的荧光分光光度计 F24500,不同启动
子转化大肠杆菌的荧光强度见表 1。从表 1可以看
出 , P3、P6和 P9阳性克隆中的 gfp基因的启动子活
性较强 ,它们的荧光强度达到了 300以上 , P13和
P14阳性克隆中的 gfp基因的启动子活性较弱 ,它们
的荧光强度只有 200多。
2. 4　启动子序列测定和分析
根据酶切结果和荧光强度的测定 ,对 P6克隆中
的重组质粒中的插入片段 Ps6进行了序列测定 ,结
果表明 Ps6的长度为 338 bp, A + T为 59. 47% (图
4)。BLASTN比对未发现形似序列 ,推断可能为一
新的启动子。使用 BPROM 2Prediction of bacterial
p romoters程序进行分析 ,发现了一段可能的启动子
序列 ,虽然潜在的 - 10区 ( GTGTAATAT)和 - 35区
( TTGGCA )之间的距离为 13 bp,但是他们与标准的
- 10区 ( TATAAT)和 - 35区 ( TTGACA )有较高的
相似性。
表 1 不同启动子荧光强度
启动子 P2 P3 P6 P9 P10 P13 P14
荧光强度 275. 33 ±2. 52 325. 33 ±4. 04 355. 67 ±3. 51 310. 67 ±3. 06 290. 67 ±6. 66 211. 67 ±7. 09 234. 33 ±3. 51
双下划线表示 - 35区 ,单下划线表示 - 10区
图 4 具有启动子功能的 Ps6片段的核苷酸序列
3　讨论
分离具有强启动功能的基因启动子是构建表达
型载体最关键的一环。分离基因启动子的
方法通常有两种 :一是从已分离到的基因中去
分离 ;二是利用基因启动子探针型载体分离基因启
动子 ,然后进行分析和比较 ,以获得各种效率的启动
子 [ 6 ]。最早由 Neve等在大肠杆菌中以四环素抗性
基因作为报告基因构建了启动子探针质粒 pBRH3B,
之后很多遗传标记基因被用作报告基因来构建启动
子探针载体 ,如氯霉素乙酰转移酶基因 ( cat)、荧光素
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
酶基因 ( luxAB )、绿色荧光蛋白 ( Green fluorescent
p rotein , GFP)、冰核基因 ( inaZ )和卡那霉素磷酸转
移酶基因 ( npt)等 [ 7 ]。
GFP标记系统因其具有标记基因小 (约 1 kb)、
肉眼可直接观察、对细胞安全稳定等优点 ,已被成
功用于微生物定殖、对宿主组织侵染、微生物动态
监测和基因表达调控等研究 [ 8 ] ,因此本研究采用
GFP为报告基因从侧孢短芽孢杆菌 X10中分离
启动子片段。分离到的启动子片段除用于构建
表达型载体外 ,亦可用于构建适合于侧孢短芽孢
杆菌的遗传标记和用于基因表达调控机理的
研究。
参 考 文 献
1　李伟杰 ,姜瑞波. 微生物学杂志 , 2007, 27 (1) : 5～8.
2　萨姆布鲁克 J,拉塞尔 DW著 ,黄培堂 ,等译 ,分子克隆实验指南
(第 3版 ) . 北京 :科学出版社 , 2002.
3　 Dunn AK, Handelsman J. Gene, 1999, 226: 297～305.
4　 Cui ZL, et al. B iotechnology Letters, 2004, 26: 1115～1118.
5　田涛 ,蜡样芽孢杆菌绿色荧光蛋白标记及其在小麦上定殖的初
探 [硕士学位论文 ]. 北京 :中国农业大学 , 2004.
6　孙迅 ,任昶 ,刘德明 ,等. 四川大学学报 , 1995, 32 (2) : 207～210.
7　 洪青 ,张忠辉 ,张晓舟 ,等. 应用与环境生物学报 , 2005, 11 ( 6) :
729～732.
8　 姚震声 ,陈中义 ,陈志谊 ,等. 生物工程学报 , 2003, 19 ( 5 ) : 551
～556.
(上接第 78页 )
　　多个 Pgs共转染对 HbsAg表达呈现不同效应作
用 PgS1 + Pgs2对 HB sAg的表达亦有显著抑制作用
(抑制率为 64. 32% , P < 0. 01) ;与 PgS1或 Pgs2单
独转染比较 ,有增强抑制 HB sAg表达的作用 ; PgS1
+ PgS2 + PgS3共转染 ,对 HB sAg的表达抑制率为
53. 77%、PgS1 + PgS3共转染 ,对 HB sAg的表达抑制
率为 27. 64%、而 PgS2 + PgS3共转染不能抑制 HB2
sAg表达。这些结果表明靶向同一基因不同部位的
shRNA表达载体间有相互协同或拮抗作用。目前 ,
国内外研究证实通过增加靶位点数量 ,并由此筛选
多个功能性 siRNA ( functional siRNA )共转染 ,有可
能克服 siRNA的靶向偏离作用 ,提高 siRNA的抑制
效率 [ 9～11 ]。本试验观察结果提示采用多个靶向
shRNA表达载体共转染方法 ,有可能筛选到具协同
抑制作用的载体 ,从而克服靶向偏离作用 ,以增强其
抑制靶基因表达的效应作用。
抑制 HB sAg表达可能致 HBeAg表达增加 ME2
IA检测分析结果显示除单独转染 Pgs1外 ;其余 Pgs
单独或多个混合共转染对 HBeAg表达均显示不同
程度的促进作用 ,与 Pg对照比较 , PgS1 + Pgs3、PgS2
+ Pgs3 有显著增加 HBeAg的表达的作用 ( P <
0101) ,其中 PgS1 + Pgs3使培养上清中的 HBeAg表
达水平增加 57. 63% ; PgS2 + Pgs3 使上清中的
HBeAg表达水平增加 75. 91%、裂解液中的 HBeAg
表达水平增加了 93. 23%。这些试验结果不仅证实
RNA干扰作用具靶向性和特异性 ,因为靶向 HB s抗
原编码基因的 Pgs只能够抑制 HB s抗原的表达、对
HBeAg的表达无抑制作用 ;而且试验结果还提示抑
制 HB sAg表达 ,有可能促进 HBeAg表达增加。本
研究结果结合先前观察到抑制 HBeAg表达可增加
HB sAg表达的研究结果 [ 12 ]提示 HBV不同抗原的产
生可能有相互制约作用 ,其机制和意义有待进一步
研究确定。
参 考 文 献
1　 Novina CD, Sharp PA. Nature, 2004, 430 (6) : 161～164.
2　唐恩洁 ,杨健. 国外医学《免疫学分册》, 2005, 28 (1) : 31～37.
3　 David B, et a1. D iced Defence. Nature, 2001, 409: 295～296.
4　 Klein C, Bock CT,W edemeyer H, et a1. Gastroenterology, 2003, 125
(1) : 9～18.
5　杨健 ,胡为民 ,任碧轩 ,等. 细胞与分子免疫学杂志 , 2006, 22
(5) : 670～671, 673.
6　 Zhi K, Bao Q, Tai S, et a1. World J Gastroenterol, 2005, 11 ( 9 ) :
129～131.
7　 Shin D, Kim SI, Kim M, et a1. V irus Res, 2006, 119 (2) : 146.
8　 Yoshinari K,M iyagishiM, Taira K. Nucleic Acids Res, 2004, 32: 691
～699.
9　 Chen Y, Du D, W u J, et al. B iochem B iophys Res Commun, 2003,
311: 398～404.
10　Tuschl T. RNAS Chembiochem, 2001, 2: 239～245.
11　Mccaffre Y, Nakai H, Pandey K, et al. Nat B iotechnol, 2003, 21: 639
～644.
12　唐恩洁 ,胡为民 ,杨健 ,等. 中国免疫学杂志 , 2008, 24 ( 12) : 10
～14.
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