全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-27
基金项目:国家科技支撑计划项目“台湾农业新品种、新技术引进创新研究与示范”(2007BAD07B01)
作者简介:钟凤林(1977-),男,博士生,从事果树生理生化与分子生物学研究;E-mail:zfl10305@126.com
通讯作者:潘东明(1956-),教授,博士生导师,从事园艺产品采后贮运保鲜研究;E-mail:pdm666@126.com
余甘子(PhylanthusemblicaL.)是大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(PhylanthusL.)的一种落叶灌木或小乔
木,其果实性味甘、酸、涩、凉。可入药,清热凉血,消食健胃,生津止咳。余甘子含有丰富的维生素、多种氨基酸,
富含鞣质、有机酸、酚类等,还含有相当数量的能清除自由基的超氧化物歧化酶[1]。世界卫生组织已将余甘子指
定为世界广泛种植的3种保健植物之一[2]。我国余甘子种质资源非常丰富,但野生资源多,尚不知其品种属性,
建立余甘子种质资源与品种鉴别的方法,对具备育种价值的资源进行筛选和分类研究,有重点地进行收集和
保护,培育优良品种,丰富品种结构。近年发展的ISSR(InterSimpleSequenceRepeat)分子标记技术结合了SSR
和RAPD的优点,操作简单,检测方便,稳定性好,比 RFLP、SSR、AFLP等多态性更高,已被广泛应用于品种鉴
定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化、系统发育、分子标记辅助育种等方面的研究[4~6]。对余甘子 ISSR-
PCR反应体系的优化,为开展余甘子遗传变异分析、辅助育种、品种鉴定、系统进化等研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
余甘子主栽品种“粉甘”成年树嫩叶采自福建农林大学校园。取幼嫩的叶片进行基因组 DNA提取及
余甘子ISSR反应体系的优化
钟凤林 1,2 王江波 1,2 潘东明 1,2 郭志雄 1 林琳 1 李开拓 1,2 尤桂春 1,2
(1福建农林大学园艺学院,福州 350002;2福建农林大学园艺产品贮藏保鲜研究所,福州 350002)
摘 要: 应用ISSR技术开展余甘子遗传变异分析、辅助育种、品种鉴定、系统进化等研究,以(TC)8C为引物,采
用正交设计和单因素试验,研究余甘子基因组DNA的浓度、退火温度、引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶用量对余
甘子ISSR-PCR反应的影响,建立并优化了适宜于余甘子ISSR分析的扩增体系:20μl的反应体系中采用25ng的模板
DNA、0.35μmol/LISSR引物、1.25UTaq酶,0.3mmol/LdNTPs,引物(TC)8C的最佳退火温度为51.7℃。
关键词: 余甘子 ISSR 优化 PCR
OptimizationofISSRReactionSystem inPhylanthusemblicaL.
ZhongFenglin1,2 WangJiangbo1,2 PanDongming1,2 GuoZhixiong1 LinLin1
LiKaituo1,2 YouGuichun1,2
(1ColegeofHorticulture,FujianAgriculturalandForestryUniversity,Fuzhou350002;2InstituteofStorageScienceand
TechnologyofHorticulturalProducts,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002)
Abstract: In thisstudy,In orderto useISSR markersto studygeneticvariation,asistantbreeding,cultivar
identificationandphylogenesisofPhylanthusemblicaL.,twomethods,anorthogonaldesignexperimentandasingle
factortest,wereusedtooptimizeISSR-PCR amplificationsystem.Theannealingtemperature,concentrationofDNA
template,primer,dNTPandTaqDNA polymerasedosageonISSR-PCR amplicationsweretestedtodeterminetheir
optimallevelsandestablishthefolowingoptimalreactionsystem forISSR analysisinPhylanthusemblicaL.Theresults
showedthatabeteramplificationsystemofISSRwasobtainedwiththereactonsystemcontaining25ngtemplateDNA,
1.25U TaqDNA polymerase,0.3mmol/LdNTPs,0.35μmol/Lprimersinthetotalvolumeof20μl.Theoptimized
annealingtemperaturewas51.7℃forprimer(TC)8C.
Keywords: PhylanthusemblicaL.ISSR Optimization PCR
2008年第3期
ISSR优化。
1.2主要药品与试剂
ExTaq酶购自宝生生物工程有限公司,随机引物购自上海生物工程有限公司,CTAB Buffer,TE Buffer,
Tris、HCl、EDTA、CTAB、NaCl、β-巯基乙醇、硼酸、PVPP、乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇等均为国产分析纯试
剂。以上海生工合成的 808(Ag)8C作为试验的引物。
1.3实验方法
1.3.1总 DNA提取 采用改良 CTAB法,参照钟凤林[7]方法进行 DNA提取。
1.4扩增反应程序
采用 ISSR反应体系的基本条件是采用 20μlPCR反应体系,PCR反应在热循环仪 Biometra T-gradient
上进行,94℃预变性 5min;94℃变性 30s;52℃复性 1min;72℃延伸 1.5min。循环 40次;然后 72℃延伸 7min;
最后置 4℃保存,电泳检测。
1.5 ISSR反应体系的优化
1.5.1正交试验优化 针对模板、dNTP、Taq酶与引物浓度 4种因素,选用 L9(34)设计 PCR各反应成分的
因素水平的正交表(表 1)。
1.5.2单因素试验优化 在正交试验的基础
上,针对符合结果的组合进行单一因素的优
化。选模板 DNA、dNTP、引物浓度以及 Taq酶
用量 4个因素,各取 5个水平,进行优化。
1.6引物退火温度的优化
设定退火温度梯度(47℃～57℃),自动形
成 1～12个梯度,从中选择 47.9℃、50.2℃、
52.6℃、53.8℃、56.1℃5个温度对引物 823(TC)
8C进行筛选。除退火温度不同,反应程序均相
同。
2 结果与分析
2.1 DNA检测
用 1%琼脂糖凝胶电泳,检测其完整性,从图 1的结果可以看到一条整齐的条带,无弥散的荧光出现,
加样孔清晰,表明所提取的 DNA样品较纯,基本没有多糖等杂质,无明显的降解和 RNA污染。
2.2 ISSR反应体系的优化结果
根据正交优化结果可以知道,图 2中的第 2、第 3、第 4、第 6共 4条条带比较清晰,且条带数较多,所
以选择这几个组合进行单因素优化条件的筛选。
表 1 ISSR正交试验设计表
图 1 DNA模板电泳图
图 2 正交试验的电泳结果
1~9为正交实验序号 M为 2 000bp的 maker
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
2.2.1 模板 DNA浓度对 ISSR反应的影响 PCR反应中对模板 DNA浓度要求的范围通常较宽,但最佳的
DNA模板浓度范围取决于物种基因组大小及 DNA模板纯度。对不同量的模板 DNA分别进行了 PCR扩
增,设置 5个梯度(4、10、20、30和 40ng)进行扩增试验,结果见图 3可见,模板用量为 20~40ng之间扩增带
数多而且清淅。结合正交试验结果,20~30ng模板 DNA用于余甘子 ISSR-PCR扩增为最佳选择。
2.2.2 dNTP浓度对 ISSR反应的影响 dNTP是 ISSR-PCR反应的原料,dNTP浓度过高,会导致 PCR错配,
从而使扩增出现非特异性扩增;过低影响合成效率,甚至会因过早的消耗而使产物单链化,影响扩增效果。
单一因素选择 0.1、0.2、0.3、0.4和 0.5μmol/L,根据图 4的结果,dNTP的合适范围初步定为 0.2~0.5μmol/L,
结合正交结果选定 0.2~0.3μmol/L。
2.2.3 Taq酶对 ISSR反应的影响 Taq酶使用量直接影响扩增反应的成功与否,使用高浓度的 Taq酶提
高了成本,还容易产生非特异扩增产物;而 Taq酶浓度过低则导致产物的合成效率下降。选择 0.75、1、
1.25、1.5和 2.0U共 5个梯度。从图 5中发现 Taq酶 1.25U最佳,这和正交设计完全一致。
图 3 余甘子模板浓度对 ISSR
反应的影响
图 4 dNTP对余甘子 ISSR
反应的影响
1~5为正交体系 M为 2000bp的 maker 1~5为正交体系 M为 2000bp的 maker
2.2.4 引物浓度对 ISSR反应的影响 引物浓度偏高或偏低所得到的 PCR结果均不可靠,引物浓度偏高
会引起错配和非特异性产物扩增,且可增加引物之间形成二
聚体的几率,浓度过低则无法测出所有 ISSR位点。选择
0.15、0.25、0.35、0.45和 0.5μmol/L共 5个梯度。图 6中的第
3扩增结果最好,结合正交试验得到引物的合适范围
0.35μmol/L。
2.3 退火温度对 ISSR反应的影响
退火温度与 ISSR指纹的稳定性至关重要。退火温度不
同,产生错配的程度也不同,较低的温度保证引物与模板结
合稳定性,但是也产生一定的错误扩增。因此,在允许的范围
内,选择较高的退火温度可减少引物和模板之间的非特异性
结合,提高 PCR反应的特异性。图 7中从右往左依次设温度
梯度 49.2℃、51.0℃、51.7℃、53.2℃和 54.2℃。由图 7中可以
看出退火温度 51.7℃最佳。
2.4 优化反应体系的确定
综合正交试验和单因素优化,在反复试验,最终确定体积 20μl的反应体系中:模板为 25ng、dNTP为
图 5 Taq酶浓度对余甘子 ISSR
体系的优化结果
1~5为正交体系 M为 2000bp的 maker
图 6 引物浓度对余甘子 ISSR体系的优化结果
1~5为正交体系 M为 2000bp的 maker
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0.3μmol/L、Taq酶为 1.25U、引物为 0.35μmol/L、退火温度为 50℃～54℃。利用此优化系统,使用引物(TC)
8C,在 52℃的退火温度下,对余甘子样品进行 ISSR-PCR扩增,得到清晰、多态性高的 ISSR谱带,并具有较
好的重复性(图 8)。这表明优化确立的 ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可应用于余甘子品种的分子鉴定和遗
传关系的分析等研究,并且进行其它引物的筛选,得到(TC)8T的最佳退火温度 52℃,(gA)8T的最佳退火温
度51℃,(CA)8Agg的最佳退火温度 56℃。本优化体系同时也应用到余甘子的其它个别品种发现效果很好。
图 7 退火温度梯度优化结果 图 8 引物(TC)8C对余甘子 9个样品的 ISSR扩增结果
1~5为退火温度梯度体系 M为 2000bp的 maker 1~9为样品 M为 2000bp的 maker
3 讨论
蔡英卿等[8]对余甘子进行 RAPD鉴定,但是还没有相关的 ISSR标记研究报道,有必要加快确立 ISSR
反应体系,为合理开发、利用余甘子资源提供理论借鉴。
将 ISSR-PCR技术引入一个新的植物材料,试图建立合适的反应体系时,应对那些主要影响因子进行
系统研究。一般可采用单因素或两因素的完全试验设计,逐一研究各因素不同处理水平的影响,处理水平
可设较多梯度,得到比较精确的单因素结果,但是各个因素的相互影响没有考虑。也可采用正交试验设计,
同时研究几个因素几个水平的影响,这样可以更有效地分析不同因素的互相作用,结果比较直观,但处理
水平的设置相对有限,不能很好估计试验误差。这两种策略的采用主要取决于研究者多方面的综合考虑。
在本研究中,利用一种 ISSR引物和一个余甘子品种,采用正交设计和单因素多水平(处理水平设计 5个梯
度)的试验设计,比较系统和精细地研究了各主要因子的影响,建立了适用于其它 ISSR引物和其它余甘子
品种的 ISSR-PCR优化反应体系。
参考 文献
1 候开卫.食品科学,1990,(4):2.
2 郑元福,杨长山.集美大学学报,1997,2(1):40～44.
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4 ZietkiewicaE,RafalskiA,LabudaD.Genomics,1994,20(2):176~183.
5 McgregorCE,LambertCA,GreyingMM,etal.Euphytica,2000,113:135~144.
6 李海生.生物学通报,2004,39(2):19~11.
7 钟凤林.龙眼遗传资源的 RAPD与 POD同工酶分析[D].福州:福建农林大学,2006.
8 蔡英卿,赖钟雄,桑庆亮,等.福建农林大学学报,2003,32(1):89~92.
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